While studying packs of the eastern timber wolf in Algonquin Provincial Park in Ontario, DNA profiles at 8 microsatellite loci and the mitochondrial control region were found to be similar to those of the red wolf, C. rufus. Based on this it was suggested that both the red wolf and the eastern timber wolf have a common origin, evolving in North America, with the coyote diverging from them 150,000-300,000 years ago and with neither having any recent connection with the gray wolf that evolved in Eurasia. It was further proposed, that the eastern timber wolf retain its original species designation of C. lycaon instead of the present status of a subspecies of the gray wolf. Four "types" or "races" of wolves have been previously described in Ontario. Using DNA profiles, assignment tests identified four groups, which were typified by animals in Algonquin Provincial Park, Pukaskwa National Park, Frontenac Axis and those north of Lake Superior. The tests indicate that Frontenac animals are hybrids between the western coyote and C. lycaon and represent the eastern coyote. Pukaskwa maintains a small wolf population, which is genetically closer to the gray wolves of the Northwest Territories than the surrounding C. lycaon. These may represent an isolated remnant population of the original "Ontario type" (C. lupus). Animals north of Lake Superior were identified as C. lycaon, but represent products of hybridization between C. lycaon and C. lupus. Currently within Ontario, Algonquin Park contains the largest protected area of the eastern timber wolf. DNA profiles, including Y-linked microsatellite loci were used to establish maternity, paternity and kin relationships for 102 animals from 24 packs over a 12-year period. A complex pack structure was identified. A pack is not composed simply of an unrelated breeding pair and their offspring and subordinates appear to enter pack systems through adoption, pack splitting, dispersal and immigration. Relatively high genetic structuring was found between the Park animals and the "Tweed" wolves to the southeast suggesting introgression of coyote genetic material is not a present concern to the integrity of park animals. Evidence of gene flow with animals to the west, northeast and northwest coupled with the high genetic diversity, suggest that the Park animals are not an island population, but the southern part of a larger metapopulation of C. lycaon. Increased interest in the relationship of the red and eastern wolves led to the investigation of a gene in the major histocompatibility complex. Allelic variation in the exon 2 region of the DLA-DQA1 locus was analysed for gray wolves, red wolves, the eastern timber wolf and the western coyote. Twelve alleles were identified, seven of which were previously characterized in dogs. Non-synonomous nucleotide substitutions was 3.0 times higher than the synonomous changes, indicative of strong positive selection. These data provide baselines for the determination of allele frequencies and their distribution across the geographical range of the four species in North America. The results in this thesis have sparked numerous debates with respect to the protection of the wolves in Algonquin Provincial Park and reintroduction of wolves into Northeastern United States. The data support the idea that the C. lycaon population in Ontario is relatively large, numbering in the thousands rather than the hundreds. Concern for the conservation of wolves in Ontario should be directed at the declining numbers of gray wolves present in Ontario. / Thesis / Master of Science (MSc)

As imunodeficiências primárias são um grupo heterogêneo de doenças hereditárias do sistema. Aqui nós descrevemos 4 famílias (2 Turcas e 2 Brasileiras), que apresentaram infecções recorrentes desde os primeiros dias de vida. Após uma análise clínica bem detalhada, combinamos as técnicas de sequenciamento de alta geração para identificar novos defeitos genéticos que levam ao fenótipo de IDP. Finalizamos com a identificação e caracterização de três IDP, sendo que duas inéditas. A primeira identificada (P1) foi causada por uma mutação bialélica no sítio de splice do gene PRKCD (c.1352+1G>A). A segunda (P2 e P3) foi causada por uma mutação bialélica no gene que codifica NIK (c. C1694G; p. Pro565Arg). A terceira (P4) foi causada uma mutação no gene IL7Rα (c.G353A). Finalizamos a análise da P5, mas nenhum dos genes candidatos foi confirmado. A análise genética e a identificação do defeito genético, permite que nossos pacientes possam ter uma melhor sobrevida, podendo realizar um tratamento correto e permite o aconselhamento genético na família. / Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of inherited diseases of the immune system. Here we describe 5 patients from 4 families (2 Turks and 2 Brazilian), all patients had recurrent infections since the firsts days of life. After a very detailed clinical analysis, we applied the Next Generation Sequencing to identify new genes that could be lead to PID phenotype. We finished with the identification and characterization of 3 PID, where 2 of them was new. The first identified (P1) was a biallelic mutation in the splice site of the gene PRKCD (c.1352 + 1G>A). The second (P2 and P3) was a biallelic mutation in the gene encoding NIK (MAP3K14; c.C1694G;. p.Pro565Arg). The third (P4) has a mutation in the gene IL7Rα (c.G353A). We finished the analysis of P5, but no candidate gene was confirmed to be the defect cause. Genetic analysis and identification of the genetic defect allows our patients may have a better survival and can perform a proper treatment and genetic counseling allows the family.

O delineamento III foi proposto para estimar as variâncias aditivas e de dominância e o grau médio de dominância de caracteres quantitativos. Com o advento dos marcadores moleculares, Cockerham & Zeng (1996) desenvolveram uma metodologia genético-estatística associando o delineamento III com marcadores moleculares. Esta metodologia foi proposta visando estimar, com o uso de quatro contrastes ortogonais, os efeitos aditivos, dominantes e epistáticos dos QTLs ligados a marcadores moleculares. O objetivo desta pesquisa foi usar ambas as metodologias para análise genética da produção de grãos, componentes da produção e número de ramificações do pendão em uma população referência F2 de milho. Duzentos e cinqüenta progênies F2:3 foram retrocruzadas com ambas linhagens genitoras, dando origem a 500 progênies de retrocruzamento. Estas progênies foram alocadas em cinco látices 10x10 e avaliadas em seis ambientes em três estações experimentais próximas a Piracicaba, SP, com duas repetições por ambientes. Estimativas de variância aditiva e de dominância, assim como o grau médio de dominância dos caracteres avaliados, apresentaram magnitudes similares às reportadas em populações de milho temperado para todos os caracteres. Estimativas do grau médio de dominância foram inferiores a um para o diâmetro da espiga, número de fileiras, peso de 500 grãos e número de ramificações do pendão, mostrando que os efeitos aditivos foram mais importantes que os efeitos de dominância para estes caracteres. Para prolificidade, comprimento da espiga e número de grãos por fileira, o grau médio de dominância não diferiu de dominância completa, sugerindo que os efeitos de dominância foram importantes para estes caracteres. Para produção de grãos, o resultado do grau médio de dominância sugeriu sobredominância. Porém, como é conhecido, o desequilíbrio de ligação causa viéses nas estimativas de grau médio de dominância e, conseqüentemente, estas estimativas podem ser menores, sendo que, provavelmente tenha ocorrido pseudo-sobredominância para produção de grãos. A análise do delineamento III com marcadores moleculares mostrou que os QTLs estão distribuídos em todos os cromossomos para todos caracteres. As somas em módulo dos efeitos dos QTLs mostraram que para produção de grãos, prolificidade, comprimento da espiga, e número de grãos por fileira, os efeitos de dominância foram superiores aos efeitos aditivos, e estes superiores aos efeitos epistáticos; para diâmetro da espiga, peso de 500 grãos, número de fileiras, e número ramificações do pendão, os efeitos aditivos foram maiores que os efeitos de dominância, e estes superiores aos efeitos epistáticos, exceto para número de fileiras em que os efeitos epistáticos foram maiores que os efeitos de dominância. Os efeitos epistáticos foram detectados para todos caracteres e contribuíram mais para os componentes da produção que para a produção de grãos per se. A análise clássica do delineamento III e a associada a marcadores moleculares forneceram resultados de grande utilidade, mas o delineamento III com marcadores permitiu a estimação dos efeitos genéticos de regiões específicas do genoma e sugeriu que os efeitos epistáticos foram muito importantes na expressão e na herança dos caracteres analisados. / The Design III was proposed to estimate additive and dominance variances, and the average levels of dominance of quantitative traits. With the advent of the molecular markers, Cockerham & Zeng (1996) developed a genetic-statistical procedure using the Design III with molecular markers. This procedure was designed to estimate additive, dominance and epistatic effects of the QTLs linked to molecular markers from four orthogonal contrasts. The objectives of this research were to use both methodologies for the genetic analysis of grain yield, yield components, and number of tassel branches in an F2 reference maize population. Two-hundred and fifty F2:3 progenies were backcrossed to the two parental inbred lines, which gave rise to 500 backcrossed progenies. These progenies were allocated in five 10x10 lattices design, and evaluated in six environments in three experimental stations near Piracicaba, SP, with two replications per environment. Estimates of additive and dominance variances, as well as the average levels of dominance for the traits evaluated, had magnitudes similar to those already reported for temperate maize populations for all traits. Estimates of the average level of dominance were lower than one for ear diameter, kernel row number, weight of 500 kernels, and tassel branches number, showing that the additive effects were more important than the dominance effects for these traits. For prolificacy, ear length, and kernels per row number, the average levels of dominance did not differ from complete dominance, suggesting that the dominance effects were important for these traits. For grain yield, the result suggested overdominance as the average level of dominance. However, as is well-known, linkage disequilibrium causes biases in the estimates of the average levels of dominance and, therefore, these estimates could be lower, and probably for grain yield a pseudo-overdominance was detected. The analysis of the Design III with molecular markers showed that QTLs were distributed in all chromosomes for all traits. The sum in module of the QTLs effects showed that for grain yield, prolificacy, ear length, and kernels per row number, dominance effect was greater than additive effect, and the latter greater than epistatic effect; whereas for ear diameter, weight of 500 kernels, kernel row number, and tassel branches number, additive effect was greater than dominance effect, and the latter greater than epistatic effect, except for kernel row number where epistatic effect was greater than dominance effect. Epistatic effects were detected for all traits, and had higher contribution for the yield components than for yield per se. Both traditional and QTL analysis of the Design III presented very useful results, but the Design III with molecular markers allowed the estimation of the genetic effects from specific genomic regions, and suggested that the epistatic effects play a very important role for the expression and inheritance of the traits assessed.

O uso da microfluídica na área de análises genéticas possibilita não apenas a diminuição de custos, mas também menor manipulação de amostras e reagentes e ainda maior portabilidade das análises. Com isso aumenta a possibilidade da sua utilização em locais remotos, sem a infraestrutura de um laboratório bem equipado. Dispositivos capazes de usar apenas a força centrifuga para movimentação de fluidos juntamente com a utilização de válvulas passivas para controle dos fluidos pode potencializar a sua utilização nos diagnósticos Point-of-Care. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um microdispositivo descartável de poliéster para análises genéticas, visando a extração e amplificação do DNA alvo, de forma rápida, barata, integrada e automatizada. Os resultados confirmam a viabilidade dos dispositivos poliéster-toner (PeT) e poliéster-fita dupla face (PeDF) automatizados de extração, obtendo por meio da extração dinâmica em fase sólida de amostras complexas, DNA com qualidade compatível à técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR). Esses resultados foram confirmados por meio da amplificação por PCR dos genes β-globina nas amostras de sangue e urina, e o gene malB nas amostras de Escherichia coli. Também foi confirmado a compatibilidade dos dispositivos de PeT para amplificação por PCR mediado por infravermelho (IV-PCR) do gene malB presente no DNA genômico de bactéria E. coli. Por fim, os dispositivos de extração e amplificação foram interligados para obtenção de um dispositivo integrado e automatizado formado pela combinação de dispositivos fabricados com diferentes filmes e métodos, PeT e PeDF. O controle de todas as soluções no interior dos dispositivos foi realizado por meio da força centrífuga combinada a válvulas passivas, sem qualquer necessidade de equipamento adicional. Portanto, podemos concluir que o dispositivo integrado PeDF - PeT possui grande potencial para aplicações em análises genéticas de forma mais barata, portátil e com menor manipulação das amostras pelo analista. / The development of microfluidics for genetic analysis allows not only cost reduction but also reduces sample and reagents handling, and increases the chances of a portable analysis. With this, increasing the possibility to use the techniques on remote places without the infrastructure of an equipped laboratory. Microdevices capable of using the centrifugal force in combination with passive valves to fluidic control can promote Point-of-Care analysis. The primary goal of this thesis was to associate these tools for the development of a disposable microdevice for genetic analysis, aiming faster, inexpensive, integrated and automated DNA extraction and amplification. The results confirmed the viability of PeT and PeDF automated microdevices, for DNA dynamic solid phase extraction, in providing high-quality DNA compatible to PCR analysis using complex samples. These results were confirmed by the β-globin PCR amplification using blood and urine samples, and the malB gene amplification in Escherichia coli samples. We have also verified the compatibility of the PeT microdevices with IV-PCR for malB gene amplification in genomic E. coli DNA. The extraction and amplification modules were interconnected to obtain an integrated and automated microdevice by the combination of devices made with different films and microfabrication methods, PeT and PeDF. The fluidic control in the devices was made using the centrifugal force combined to passive valves, with no requirement of any extra equipment. Therefore, we can conclude that the integrated PeDF - PeT microdevice has a great potential for cheaper and portable genetic analysis application, with less operator manipulation.

A produção de microssistemas de análises totais (µTAS) tem sido objeto de esforços intensos pela comunidade científica. A necessidade de produção de uma plataforma que realize extração, amplificação e separação de DNA--um verdadeiro \"lab on a chip\"--é impulsionada pelas vantagens associadas com as análises em plataformas miniaturizadas. Esta Tese foca no desenvolvimento de métodos para análises de DNA em dispositivos microfluídicos que podem ser associados em µTAS. Inicialmente, foi feito o desenvolvimento de um novo método de extração em fase sólida em que a eficiência de extração depende da manipulação magnética das partículas e não do fluxo da solução através da fase sólida. A utilidade desta técnica em isolar DNA puro de alta qualidade (amplificável) a partir de uma amostra biológica complexa foi demonstrada através da purificação de DNA a partir de sangue total e a subsequente amplificação do fragmento do gene β-globina. A técnica descrita é rápida, simples e eficiente, permitindo uma recuperação de mais de 60% de DNA a partir de 600 nL de sangue em concentração suficiente para amplificação via reação em cadeia da polimerase (PCR). Após o desenvolvimento da extração dinâmica de DNA em fase sólida (dSPE) em microchip de vidro, o método foi adaptado para o uso em microchips de poliéster-toner (PT). Além da extração, a amplificação e separação de DNA também foram realizadas em microchips de PT. O processo convencional de fabricação dos dispositivos de PT produz canais com 12 µm de profundidade. Este trabalho descreve um novo processo de fabricação dos microchips de PT com canais mais profundos. Uma cortadora a laser de CO2 é usada para definir a estrutura desejada no filme de poliéster recoberto com toner. Estes filmes de poliéster recobertos com toner e os canais recortados são utilizados com partes intermediárias no microchip. A tampa e a base (filmes de poliéster) são laminadas juntamente com as partes intermediárias. Desta forma microchips com canais mais profundos podem ser criados. Microchips com 4 filmes de poliéster (base, tampa, e dois filmes centrais) foram utilizados para realizar dSPE. Estes microchips possuem canais com ~270 µm de profundidade. A dSPE adaptada para os microchips de PT demonstrou ser capaz de extrair eficientemente DNA (~65%), e o DNA purificado apresentou qualidade suficiente para PCR. A PCR realizada em microchips de PT demonstrou que os dispositivos de PT são compatíveis com os reagentes da PCR e o sucesso da reação de PCR foi demonstrado através da amplificação do fragmento de 520 pares de bases do λ-DNA. A possibilidade de manipular diferentes soluções que são necessárias para realizar a extração e a PCR demonstra o grande potencial desta plataforma para realizar análises genéticas. Além da extração e amplificação, a separação também foi demonstrada nos dispositivos de PT. Duas integrações foram feitas nos microchips de PT, dSPE-PCR e PCR-separação. Na primeira integração a dSPE e PCR foram realizadas em uma única câmara, e a amplificação do fragmento de 520 pb do λ-DNA foi demonstrada. Na segunda integração, o dispositivo foi fabricado com espessuras diferentes para os diferentes domínios. No domínio da PCR as câmaras possuem profundidade de ~270 µm de profundidade, e para o domínio da eletroforese os canais apresentam 12 µm de profundidade. A integração realizada sem válvulas foi demonstrada através da amplificação e detecção do fragmento de 520 pb do λ-DNA em um mesmo microchip. Este trabalho demonstra o grande potencial dos microchips de PT para produzir dispositivos descartáveis totalmente integrados para análise genética. / Efforts to develop a microfluidic-based total analysis system (µTAS) have been intense in the scientific community. The goal of achieving a device comprising DNA extraction, amplification, and detection in a single device, a true \"lab on a chip,\" is driven by the substantial advantages associated with such a device. This Thesis focus on development of methods for DNA analysis on microdevices, that can be associated with µTAS. Sequentially, the first step was the development of a novel solid-phase extraction technique in which DNA is bound and eluted from magnetic silica beads in a manner that efficiency is dependent on the magnetic manipulation of the beads and not on the flow of solution through a packed bed. The utility of this technique in the isolation of reasonably pure, PCR-amplifiable DNA from complex samples is shown by isolating DNA from whole human blood, and subsequently amplifying a fragment of the β-globin gene. The technique described here is rapid, simple, and efficient, allowing for recovery of more than 60% of DNA from 600 nL of blood at a concentration which is suitable for PCR amplification. The second step was the use of polyester-toner (PT) microchips for DNA analysis (extraction, PCR and separation). The laser-printing of toner onto polyester films has been shown to be effective for generating PT microfluidic devices with channel depths on the order of 12 µm. We describe a novel and innovative process that allows for the production of multilayer PT microdevices with substantially larger channel depths. Utilizing a CO2 laser to create the microchannel in polyester sheets containing a uniform layer of printed toner, multilayer devices can easily be constructed by sandwiching the channel layer between uncoated cover sheets of polyester containing precut access holes. The process allows for the fabrication of channels several hundred microns in depth, with ~270 µm deep microchannels utilized here to demonstrate the effectiveness of multilayer PT microchips for dynamic solid phase extraction (dSPE) and PCR amplification. Dynamic SPE adapted for PT microchip was able to recover more than 65% of DNA from 600 nL of blood and the DNA was compatible with downstream microchip-based PCR amplification. The compatibility of PT microchips was demonstrated by successful amplification of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. The ability to handle the diverse chemistries associated with DNA purtification and extraction is a testimony to potential utility of PT microchips beyond separations, and presents a promising new platform for genetic analysis that is low cost and easy to fabricate. Two integrations were carrying out on PT microchip, dSPE - PCR and PCR-ME. The first integration was made in a single chamber and the amplification of 520 bp fragment of λ-phage was demonstrated. The second integration describes a process that allows the production of a multidomain microchip with different channel depths for the different domains for genetic analysis. The final device was made by the conventional sandwiching of the four polyester films of the PCR domain with the two polyester films for the electrophoresis domain. The successful valveless integration of PCR and separation was demonstrated by amplification and detection of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. This work shows the enormous potential of PT microchips to be used for total genetic analysis.

O uso da microfluídica na área de análises genéticas possibilita não apenas a diminuição de custos, mas também menor manipulação de amostras e reagentes e ainda maior portabilidade das análises. Com isso aumenta a possibilidade da sua utilização em locais remotos, sem a infraestrutura de um laboratório bem equipado. Dispositivos capazes de usar apenas a força centrifuga para movimentação de fluidos juntamente com a utilização de válvulas passivas para controle dos fluidos pode potencializar a sua utilização nos diagnósticos Point-of-Care. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um microdispositivo descartável de poliéster para análises genéticas, visando a extração e amplificação do DNA alvo, de forma rápida, barata, integrada e automatizada. Os resultados confirmam a viabilidade dos dispositivos poliéster-toner (PeT) e poliéster-fita dupla face (PeDF) automatizados de extração, obtendo por meio da extração dinâmica em fase sólida de amostras complexas, DNA com qualidade compatível à técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR). Esses resultados foram confirmados por meio da amplificação por PCR dos genes β-globina nas amostras de sangue e urina, e o gene malB nas amostras de Escherichia coli. Também foi confirmado a compatibilidade dos dispositivos de PeT para amplificação por PCR mediado por infravermelho (IV-PCR) do gene malB presente no DNA genômico de bactéria E. coli. Por fim, os dispositivos de extração e amplificação foram interligados para obtenção de um dispositivo integrado e automatizado formado pela combinação de dispositivos fabricados com diferentes filmes e métodos, PeT e PeDF. O controle de todas as soluções no interior dos dispositivos foi realizado por meio da força centrífuga combinada a válvulas passivas, sem qualquer necessidade de equipamento adicional. Portanto, podemos concluir que o dispositivo integrado PeDF - PeT possui grande potencial para aplicações em análises genéticas de forma mais barata, portátil e com menor manipulação das amostras pelo analista. / The development of microfluidics for genetic analysis allows not only cost reduction but also reduces sample and reagents handling, and increases the chances of a portable analysis. With this, increasing the possibility to use the techniques on remote places without the infrastructure of an equipped laboratory. Microdevices capable of using the centrifugal force in combination with passive valves to fluidic control can promote Point-of-Care analysis. The primary goal of this thesis was to associate these tools for the development of a disposable microdevice for genetic analysis, aiming faster, inexpensive, integrated and automated DNA extraction and amplification. The results confirmed the viability of PeT and PeDF automated microdevices, for DNA dynamic solid phase extraction, in providing high-quality DNA compatible to PCR analysis using complex samples. These results were confirmed by the β-globin PCR amplification using blood and urine samples, and the malB gene amplification in Escherichia coli samples. We have also verified the compatibility of the PeT microdevices with IV-PCR for malB gene amplification in genomic E. coli DNA. The extraction and amplification modules were interconnected to obtain an integrated and automated microdevice by the combination of devices made with different films and microfabrication methods, PeT and PeDF. The fluidic control in the devices was made using the centrifugal force combined to passive valves, with no requirement of any extra equipment. Therefore, we can conclude that the integrated PeDF - PeT microdevice has a great potential for cheaper and portable genetic analysis application, with less operator manipulation.

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No. of bitstreams: 1 TeseASMCS.pdf: 3312400 bytes, checksum: c898700835e5f7333425c663a26a29d4 (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The intense destruction of the environment contributed to the decline and isolation of wild populations, providing an intensification of genetic drift and inbreeding effects. These factors reduce the ability of individuals to adapt to environmental changes, making them more vulnerable to extinction. The two largest predators of the Americas, the cougar (Puma concolor) and jaguar (Panthera onca) are animals which are threatened by the reduction and fragmentation of habitats, especially in the Atlantic Forest, which is one of the most degraded biomes in the world due to human actions. The present study aimed to investigate both demographic parameters and the distribution of the genetic diversity of cougar and jaguar populations within Atlantic Forest remnants. The chosen areas (Serra da Mantiqueira, Serra do Mar continuous and Iguaçu National Park) are among the most important for the conservation of these cats. Mostly non-invasive samples (feces and hair) were collected in protected areas present in those remaining. The depositor species was confirmed by amplification of the ATP6 gene and the samples were individualized using microsatellite loci, which were also employed in population analyses. The sex of the individuals was determined using a small fragment of amelogenin gene. The results suggest that at least seven individuals of jaguars (4F:3M) inhabit the Iguaçu National Park and 12 (5F:7M) are present in the Serra do Mar continuous. These populations seem to be different, with evidence of low gene flow between them (lack of migrant and mixed individuals and pairs of highly related individuals). In Iguaçu is also estimated to exist at least seven cougars (3F:4M), also four (1F:3M) in the Serra da Mantiqueira and 14 (5F:9M) in the Serra do Mar continuous. Genetic structure was detected in this species, but evidencing gene flow maintenance between two detected populations (sign of migrants and mixed individuals and predominantly non related individuals). In both species high genetic diversity could be observed. This study obtained critical information and still unknown, about the demographic and structure of jaguar and cougar populations in the Atlantic Forest remain. These data will provide substantial information that can be used in monitoring, as well as being crucial and decisive in the increase of effective strategies for the conservation of these species. / A intensa devastação no ambiente vem contribuindo significativamente para o declínio e isolamento de populações selvagens, proporcionando uma intensificação dos efeitos da deriva genética e na taxa de endogamia. Estes fatores, por sua vez, reduzem a habilidade dos indivíduos se adaptarem às mudanças ambientais, tornando-os vulneráveis à extinção. Os maiores predadores das Américas, a onça-parda (Puma concolor) e a onça-pintada (Panthera onca) estão entre os animais ameaçados pela redução e fragmentação dos habitats, principalmente na Mata Atlântica, que é um dos biomas mundiais mais antropizados. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar parâmetros demográficos e a distribuição da diversidade genética de populações de onças presentes em remanescentes de Mata Atlântica. Os fragmentos elegidos (Serra da Mantiqueira, contínuo da Serra do Mar e Parque Nacional do Iguaçu) estão entre os mais importantes para a conservação desses felinos. Amostras predominantemente não invasivas (fezes e pelos) foram coletadas em Unidades de Conservação presentes nesses remanescentes. A espécie depositora das fezes foi confirmada através da amplificação do gene ATP6 e as amostras foram individualizadas por meio de locos de microssatélites, os quais também foram empregados nas análises populacionais. O sexo dos indivíduos foi determinado por meio de um fragmento do gene da amelogenina. Os resultados indicaram que ao menos sete indivíduos de onças-pintadas (4F:3M) habitam o Parque Nacional do Iguaçu e 12 (5F:7M) estão presentes no contínuo da Serra do Mar. Essas populações parecem estar diferenciadas, com evidência de baixo fluxo gênico entre elas (ausência de indivíduos migrantes e misturados, além de pares de indivíduos altamente relacionados). No Iguaçu também foi estimado existir pelo menos sete onças-pardas (3F:4M), além de quatro (1F:3M) na Serra da Mantiqueira e 14 (5F:9M) no contínuo da Serra do Mar. Estruturação genética foi detectada nessa espécie, entretanto, com indícios de fluxo gênico entre as duas populações detectadas (evidência de indivíduos migrantes e misturados, além de pares de indivíduos predominantemente não relacionados). Em ambas as espécies foram exibidos altos níveis de diversidade genética. Este estudo gerou informações primordiais, ainda desconhecidas, sobre a demografia e a estruturação de populações de onças na Mata Atlântica. Tais dados poderão ser utilizados em monitoramentos, além de serem cruciais e decisivos no incremento de estratégias efetivas para a conservação dessas espécies.

A produção de microssistemas de análises totais (µTAS) tem sido objeto de esforços intensos pela comunidade científica. A necessidade de produção de uma plataforma que realize extração, amplificação e separação de DNA--um verdadeiro \"lab on a chip\"--é impulsionada pelas vantagens associadas com as análises em plataformas miniaturizadas. Esta Tese foca no desenvolvimento de métodos para análises de DNA em dispositivos microfluídicos que podem ser associados em µTAS. Inicialmente, foi feito o desenvolvimento de um novo método de extração em fase sólida em que a eficiência de extração depende da manipulação magnética das partículas e não do fluxo da solução através da fase sólida. A utilidade desta técnica em isolar DNA puro de alta qualidade (amplificável) a partir de uma amostra biológica complexa foi demonstrada através da purificação de DNA a partir de sangue total e a subsequente amplificação do fragmento do gene β-globina. A técnica descrita é rápida, simples e eficiente, permitindo uma recuperação de mais de 60% de DNA a partir de 600 nL de sangue em concentração suficiente para amplificação via reação em cadeia da polimerase (PCR). Após o desenvolvimento da extração dinâmica de DNA em fase sólida (dSPE) em microchip de vidro, o método foi adaptado para o uso em microchips de poliéster-toner (PT). Além da extração, a amplificação e separação de DNA também foram realizadas em microchips de PT. O processo convencional de fabricação dos dispositivos de PT produz canais com 12 µm de profundidade. Este trabalho descreve um novo processo de fabricação dos microchips de PT com canais mais profundos. Uma cortadora a laser de CO2 é usada para definir a estrutura desejada no filme de poliéster recoberto com toner. Estes filmes de poliéster recobertos com toner e os canais recortados são utilizados com partes intermediárias no microchip. A tampa e a base (filmes de poliéster) são laminadas juntamente com as partes intermediárias. Desta forma microchips com canais mais profundos podem ser criados. Microchips com 4 filmes de poliéster (base, tampa, e dois filmes centrais) foram utilizados para realizar dSPE. Estes microchips possuem canais com ~270 µm de profundidade. A dSPE adaptada para os microchips de PT demonstrou ser capaz de extrair eficientemente DNA (~65%), e o DNA purificado apresentou qualidade suficiente para PCR. A PCR realizada em microchips de PT demonstrou que os dispositivos de PT são compatíveis com os reagentes da PCR e o sucesso da reação de PCR foi demonstrado através da amplificação do fragmento de 520 pares de bases do λ-DNA. A possibilidade de manipular diferentes soluções que são necessárias para realizar a extração e a PCR demonstra o grande potencial desta plataforma para realizar análises genéticas. Além da extração e amplificação, a separação também foi demonstrada nos dispositivos de PT. Duas integrações foram feitas nos microchips de PT, dSPE-PCR e PCR-separação. Na primeira integração a dSPE e PCR foram realizadas em uma única câmara, e a amplificação do fragmento de 520 pb do λ-DNA foi demonstrada. Na segunda integração, o dispositivo foi fabricado com espessuras diferentes para os diferentes domínios. No domínio da PCR as câmaras possuem profundidade de ~270 µm de profundidade, e para o domínio da eletroforese os canais apresentam 12 µm de profundidade. A integração realizada sem válvulas foi demonstrada através da amplificação e detecção do fragmento de 520 pb do λ-DNA em um mesmo microchip. Este trabalho demonstra o grande potencial dos microchips de PT para produzir dispositivos descartáveis totalmente integrados para análise genética. / Efforts to develop a microfluidic-based total analysis system (µTAS) have been intense in the scientific community. The goal of achieving a device comprising DNA extraction, amplification, and detection in a single device, a true \"lab on a chip,\" is driven by the substantial advantages associated with such a device. This Thesis focus on development of methods for DNA analysis on microdevices, that can be associated with µTAS. Sequentially, the first step was the development of a novel solid-phase extraction technique in which DNA is bound and eluted from magnetic silica beads in a manner that efficiency is dependent on the magnetic manipulation of the beads and not on the flow of solution through a packed bed. The utility of this technique in the isolation of reasonably pure, PCR-amplifiable DNA from complex samples is shown by isolating DNA from whole human blood, and subsequently amplifying a fragment of the β-globin gene. The technique described here is rapid, simple, and efficient, allowing for recovery of more than 60% of DNA from 600 nL of blood at a concentration which is suitable for PCR amplification. The second step was the use of polyester-toner (PT) microchips for DNA analysis (extraction, PCR and separation). The laser-printing of toner onto polyester films has been shown to be effective for generating PT microfluidic devices with channel depths on the order of 12 µm. We describe a novel and innovative process that allows for the production of multilayer PT microdevices with substantially larger channel depths. Utilizing a CO2 laser to create the microchannel in polyester sheets containing a uniform layer of printed toner, multilayer devices can easily be constructed by sandwiching the channel layer between uncoated cover sheets of polyester containing precut access holes. The process allows for the fabrication of channels several hundred microns in depth, with ~270 µm deep microchannels utilized here to demonstrate the effectiveness of multilayer PT microchips for dynamic solid phase extraction (dSPE) and PCR amplification. Dynamic SPE adapted for PT microchip was able to recover more than 65% of DNA from 600 nL of blood and the DNA was compatible with downstream microchip-based PCR amplification. The compatibility of PT microchips was demonstrated by successful amplification of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. The ability to handle the diverse chemistries associated with DNA purtification and extraction is a testimony to potential utility of PT microchips beyond separations, and presents a promising new platform for genetic analysis that is low cost and easy to fabricate. Two integrations were carrying out on PT microchip, dSPE - PCR and PCR-ME. The first integration was made in a single chamber and the amplification of 520 bp fragment of λ-phage was demonstrated. The second integration describes a process that allows the production of a multidomain microchip with different channel depths for the different domains for genetic analysis. The final device was made by the conventional sandwiching of the four polyester films of the PCR domain with the two polyester films for the electrophoresis domain. The successful valveless integration of PCR and separation was demonstrated by amplification and detection of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. This work shows the enormous potential of PT microchips to be used for total genetic analysis.

As imunodeficiências primárias são um grupo heterogêneo de doenças hereditárias do sistema. Aqui nós descrevemos 4 famílias (2 Turcas e 2 Brasileiras), que apresentaram infecções recorrentes desde os primeiros dias de vida. Após uma análise clínica bem detalhada, combinamos as técnicas de sequenciamento de alta geração para identificar novos defeitos genéticos que levam ao fenótipo de IDP. Finalizamos com a identificação e caracterização de três IDP, sendo que duas inéditas. A primeira identificada (P1) foi causada por uma mutação bialélica no sítio de splice do gene PRKCD (c.1352+1G>A). A segunda (P2 e P3) foi causada por uma mutação bialélica no gene que codifica NIK (c. C1694G; p. Pro565Arg). A terceira (P4) foi causada uma mutação no gene IL7Rα (c.G353A). Finalizamos a análise da P5, mas nenhum dos genes candidatos foi confirmado. A análise genética e a identificação do defeito genético, permite que nossos pacientes possam ter uma melhor sobrevida, podendo realizar um tratamento correto e permite o aconselhamento genético na família. / Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of inherited diseases of the immune system. Here we describe 5 patients from 4 families (2 Turks and 2 Brazilian), all patients had recurrent infections since the firsts days of life. After a very detailed clinical analysis, we applied the Next Generation Sequencing to identify new genes that could be lead to PID phenotype. We finished with the identification and characterization of 3 PID, where 2 of them was new. The first identified (P1) was a biallelic mutation in the splice site of the gene PRKCD (c.1352 + 1G>A). The second (P2 and P3) was a biallelic mutation in the gene encoding NIK (MAP3K14; c.C1694G;. p.Pro565Arg). The third (P4) has a mutation in the gene IL7Rα (c.G353A). We finished the analysis of P5, but no candidate gene was confirmed to be the defect cause. Genetic analysis and identification of the genetic defect allows our patients may have a better survival and can perform a proper treatment and genetic counseling allows the family.