O estudo de fungos endofíticos tem sido intensificado nos últimos anos e abrange principalmente a descrição de novas espécies, o potencial de utilização no controle biológico de fitopatógenos e a produção de metabólitos secundários com atividades biológicas diversas. No entanto, a interação e a possível função destes organismos em plantas de clima tropical são pobremente estudadas e pouco compreendidas. A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido à produção de etanol para uso como biocombustível. Um grande avanço no conhecimento das comunidades microbianas endofíticas desta planta tem sido alcançado, abrindo a possibilidade de estudo sobre as funções destes organismos na interação endofítica, bem como de seu potencial biotecnológico. Uma espécie que coloniza consistentemente os tecidos de cana-de-açúcar é o fungo Epicoccum nigrum. Este fungo é conhecido por sua atividade de biocontrole de fitopatógenos e por apresentar metabolismo secundário altamente desenvolvido e diverso. Nesse contexto, este trabalho teve por objetivos: 1) estudar a diversidade genética de isolados endofíticos de Epicoccum de cana-de-açúcar e de outros hospedeiros; 2) desenvolver um sistema de transferência de genes repórteres, visando à análise da interação in vitro e in vivo com cana-deaçúcar; 3) avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de isolados endofíticos de Epicoccum contra diferentes fitopatógenos e patógenos humanos; 4) obter mutantes insercionais com atividade antimicrobiana ausente, visando à identificação de genes envolvidos no metabolismo secundário. O trabalho foi iniciado com o isolamento de Epicoccum de cana-de-açúcar. A análise por meio de abordagem polifásica resultou na separação dos isolados em dois taxa distintos (Grupo 1, E. nigrum; Grupo 2, Epicoccum sp.), demonstrando que a classificação de E. nigrum como uma única espécie variável deve ser reavaliada. A seguir, transformantes resistentes a higromicina B e expressando GFP foram obtidos por meio de transferência gênica mediada por A. tumefaciens. Ensaios de colonização de cana-de-açúcar in vitro e in vivo com a linhagem selvagem e transformada demonstraram a natureza não patogênica das linhagens e que E. nigrum é capaz de colonizar endofiticamente e persistir nas folhas desta planta. A análise da atividade antimicrobiana revelou extensa variação fisiológica, a qual foi correlacionada com a variabilidade genética dos isolados. Uma biblioteca de agrotransformantes de E. nigrum e Epicoccum sp. foi caracterizada quanto à perda da atividade antimicrobiana. A análise das seqüências flanqueadoras do T-DNA obtidas por TAIL-PCR a partir dos mutantes revelou que a inserção ocorreu em diferentes locais do genoma, muitos com elevada similaridade com proteínas hipotéticas de fungos, algumas sem função conhecida, e outras contendo domínios conservados envolvidos em diferentes funções celulares, como regulação da expressão gênica, transporte, obtenção de energia e outras funções enzimáticas. A análise do extrato orgânico por meio de bioautografia revelou a perda da atividade antimicrobiana de alguns mutantes insercionais, em comparação ao extrato da linhagem selvagem. O grande número de mutantes obtidos e caracterizados constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário deste fungo endofítico, auxiliando o entendimento da biossíntese de diversos compostos com estruturas complexas produzidos por esta espécie. / The study of endophytic fungi has increased in last few years and includes mainly the description of new species, biological control and production of compounds with biological activity. However, due the fact that few studies have been done, the role of these microorganisms inside the host plant from tropical areas is poorly understood. Sugarcane is one of the most important crop in Brazil, mainly due the biofuel production. Therefore, studies have been done to better understanding the role of endophytic microbial diversity inside the sugarcane plants, allowing the possibility to use this interaction in sugarcane production and also find endophytic isolates with biotechnological potential. Previous studies have shown that an important sugarcane endophytic fungus is Epicoccum nigrum, which species has been associated to biological control of many phytopathogens and also production of different secondary metabolites. In this way, the aims of the present study were to 1) study the genetic diversity of sugarcane endophytic Epicoccum; 2) develop a genetic transformation system for Epicoccum spp., allowing the in vitro and in vivo study of the interaction with sugarcane; 3) evaluate the in vitro antimicrobial activity of Epicoccum; 4) obtain mutants defective to antimicrobial activity and identification of genes associated to this activity. The polyphasic approach indicated that the evaluated Epicoccum population present two different genotypes (Group 1: E. nigrum and Group 2: Epicoccum sp.), suggesting that the classification of E. nigrum in only one species should be revised. Mutants resistant to hygromicin B and expressing GFP gene were obtained by transformation with Agrobacterium tumefaciens. In vitro and in vivo sugarcane colonization showed that the Epicoccum isolates and mutants were able to settling endophytically inside sugarcane without induce disease symptoms, and live up to leaves. The results shown that the antimicrobial activity was related to genetic variability, and this activity was better characterized by analysis of a obtained mutant library of E. nigrum and Epicoccum sp. The TAIL-PCR analysis revealed that the T-DNA introduced into the mutants was inserted in different regions of the fungi genome, truncating different genes those coding fungi hypothetical proteins, conserved domain associated to cellular function, such as genetic regulation, energy obtaining and others enzymatic activity. The analysis by bioautography indicated that some mutants lose the antimicrobial activity, allowing the correlation between the truncated genes and antimicrobial compound production. The evaluation of this mutant library showed that different genes are associated to antimicrobial compound production and may be an important tools to study the secondary metabolism in this endophytic fungus, allowing the understanding of biochemical pathway associated to biosynthesis of complex molecules produced by this fungus.

La fibrillation atriale (FA) est un problème de santé publique majeur dans le monde entier. Le remodelage électrique, structurel et neuronal est sous-jacent à la myopathie atriale. La pharmacothérapie actuelle est souvent inefficace en raison du manque de connaissance de la pathophysiologie de la FA.Pour comprendre comment se réalise le remodelage atrial, une approche Omique qui explore le transcriptome, l'épigénome (méthylome et microOme) et le génome de patients atteints de FA a été réalisée. Parallèlement, le phénotype de vieux rats spontanément hypertendus (SHRs) a été caractérisé et une étude pharmacologique avec la décitabine (5-Aza-2'-deoxycitidine) a été menée. Les patients atteint de FA présentent un profil transcriptomique et d'expression de miRNA alteré dans l'oreillete gauche (OG), soulignant le rôle important d'un processus de "œmorphogénèse de la structure anatomique". L'expression réduite de Pitx2 était inversement corrélée à la taille de l'OG et ne pouvait pas être expliquée ni par le facteur de transcription ni par la surexpression de Smyd2, une cible de miR-519b. Les SHRs, similairement aux observations chez l'homme, ont développé des arythmies dépendantes de l'âge associées au remodelage atrial et ventriculaire gauche. La FA a été trouvée associée à l'hyperméthylation du promoteur de Pitx2 à la fois chez l'homme et chez les SHRs. L'agent hyperméthylant décitabine a amélioré le profil arhytmique de l'ECG et les activités SOD, et la réduction de la fibrose dans le ventricule gauche des SHRs. En utillisant une approche NGS basée sur un panel personnalisé de 55 gènes candidats à la myopathie atriale dans une cohorte de 94 patients atteints de FA, 11 nouvelles variantes faux-sens potentiellement pathogènes impliqués dans le remodelage structurel ont été identifiés. Des études fonctionnelles de ces variants ont débuté. Trois patients sont également des porteurs de variantes dans les gènes connus de FA. Les résultats actuels suggèrent que 1) la régulation épigénétique peut jouer un rôle dans la pathophysiologie de la FA 2) les agents hypométhylants doivent être considérés comme une nouvelle thérapie de la FA 3) une approche Omique peut aider à découvrir de nouveaux mécanismes sous-jacents à la myopathie atriale / Atrial fibrillation (AF) is a major public health care problem worldwide. Electrical, structural, and neural remodeling underlie atrial myopathy. Current pharmacotherapy is often ineffective due to the lack of knowledge of AF pathophysiology. To understand how atrial remodeling occurs, an Omic approach that explore the transcriptome, epigenome (methylome and microOme) and genome of AF patients was performed. In parallel, ageing spontaneously hypertensive rats (SHRs) were phenotypically characterised and a pharmacological study with decitabine (5-Aza-2’-deoxycitidine) was conducted. AF patients presented an altered transcriptomic and microRNA expression profile in the left atria (LA), emphasizing the important role of an "anatomical structure morphogenesis" process. The Pitx2 reduced expression was inversely correlated with LA size, and could not be explained by transcriptor factor. Smyd2 is a target of miR-519b-3p. SHRs, similar to what is observed in humans, developed age-dependent arrhythmias associated with left atrial and ventricular remodeling. AF was found to be associated with Pitx2 promoter hypermethylation both in humans and in SHRs. The hypomethylating agent decitabine improved ECG arrhythmic profiles and superoxide dismutase activities, and reduced fibrosis in the left ventricle of SHRs. Using a next-generation sequencing approach based on a custom panel of 55 atrial myopathy candidate genes in a cohort of 94 AF patients, 11 novel potentially pathogenic missense variants involved in structural remodeling were identified. Functional studies of these variants have started. Three patients were also carriers of variants in known AF-causing genes. The present results suggest that 1) epigenetic regulation may play a role in the pathophysiology of AF 2) hypomethylating agents have to be considered as a new AF therapy 3) an Omic approach may help to uncover new mechanisms underlying atrial myopathy

A cultura do milho (Zea mays L.) apresenta grande importância cultural, social e econômica, tanto no Brasil como no mundo. Entre os fatores que contribuem grandemente para a diminuição de sua produtividade estão as doenças. A mancha de cercospora ou cercosporiose, causada pelo fungo Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, é uma das principais doenças da cultura em vários países. Uma vez que o uso de híbridos resistentes é a medida mais eficiente para o seu controle, a caracterização e a discriminação de genótipos de milho quanto ao nível de resistência e de isolados do patógeno quanto ao nível de agressividade é uma etapa fundamental de qualquer programa de melhoramento. Isolados de C. zeae-maydis podem ser classificados em dois grupos genéticos, denominados I e II, segundo análise por marcadores AFLP e por restrição da região intergênica espaçadora do rDNA 5.8S. No Brasil, há ocorrência dos dois grupos, mas nos Estados Unidos há uma prevalência do grupo I sobre o grupo II, ao passo que em países do sul da África verifica-se somente a presença de indivíduos do grupo II. Presentemente, não há nenhum relato sistemático sobre diferenças em agressividade entre indivíduos destes grupos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a agressividade de 20 isolados de C. zeae-maydis dos grupos genéticos I e II quando inoculados em um híbrido de milho suscetível e também testar o comportamento de 10 linhagens de milho frente a oito isolados em dois ambientes para verificar a possível presença de interação diferencial entre isolado, linhagem e local. Para tanto, os isolados foram cultivados em sementes de sorgo para produção de inóculo. Sementes colonizadas foram depositadas no cartucho das plantas e as avaliações foram realizadas utilizando-se escalas diagramáticas. No experimento em casa de vegetação foi verificada uma variação em agressividade entre os isolados do grupo genético I, do grupo genético II e entre os grupos. Observou-se ainda que isolados pertencentes ao grupo genético II são, em média, mais agressivos que isolados do grupo genético I. Este é o primeiro relato de diferenças em agressividade entre os grupos genéticos. No experimento em campo não foram observadas diferenças significativas quanto à agressividade dos isolados avaliados em Jardinópolis (SP) e Indianópolis (MG). Entretanto, observou-se forte interação entre linhagens e locais, indicando que o ambiente exerce influência na doença. Dessa forma, recomendam-se avaliações em ambientes diferentes e a utilização de isolados mais agressivos e pertencentes aos dois grupos genéticos a fim de otimizar a discriminação de genótipos de milho com relação à resistência a C. zeae-maydis. / Maize (Zea maydis L.) is of great social, cultural and economical importance in Brazil and in the world. Maize diseases are the main factors that reduce crop yield. Gray leaf spot, caused by the fungus Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, is one of the most important diseases in many countries. Given that the disease can be controlled by the use of resistant maize hybrids, the characterization and discrimination of maize genotypes according to their level of resistance and of pathogen isolates according to their aggressiveness are fundamental steps in any breeding program. Isolates of C. zeae-maydis can be classified into two genetic groups, named I and II, by analysis with AFLP markers and restriction of the intergenic spacer region of the 5.8S rDNA. In Brazil, both groups occur whereas in the United States isolates from group I prevail and in some South African countries only isolates from group II can be found. Presently, there are no systematic reports on differences in aggressiveness between these groups. Therefore, the objective of this study was to evaluate the aggressiveness of 20 isolates of C. zeae-maydis from both genetic groups when inoculated in a susceptible maize hybrid and also to test the reaction of 10 maize inbreds to eight C. zeae-maydis isolates in two environments in order to assess the possible occurrence of differential interaction between isolates, inbreds, and locations. Isolates were cultivated in sorghum seeds for innoculum production. Colonized seeds were placed into the whorl of the plants and the disease reaction was evaluated using a diagrammatic scale. In the greenhouse experiment significant variation in aggressiveness was observed among isolates of group I, group II and between groups. Also, it was observed that isolates from group II were, on average, more aggressive than isolates from group I. This is the first report on differences in aggressiveness between the two genetic groups of C. zeae-maydis. In the field experiment no significant differences were observed in aggressiveness among isolates evaluated in Jardinópolis (SP) and Indianópolis (MG) for the inbreds tested. However, a strong interaction between reactions of maize inbreds and regions was observed indicating that the environment influences the disease. Thus, evalutions in several locations with aggressive isolates from both groups is recommended in order to optimize the discrimination of maize genotypes regarding their resistance to C. zeae-maydis.

Este trabalho diz respeito à diversidade genética de Myrciaria floribunda (West ex Willdenow) Berg (cambuí), uma espécie arbórea de sub-bosque, em paisagem fragmentada da Serra da Mantiqueira, MG. A diversidade genética foi estudada a partir dos dados de análises eletroforéticas de isoenzimas. Foram coletadas folhas de indivíduos jovens em duas populações dentro de um fragmento controle (5810,27 ha) e em dois fragmentos menores (18 e 10 ha), sendo quarenta plantas por fragmento. Através da análise de sete locos isoenzimáticos foi avaliada o número médio de alelos por loco (Â), número médio de alelos por loco polimórfico (Âp), porcentagem de locos polimórficos ( $ P ), heterozigosidade média esperada ( $ He ), heterozigosidade observada ( $ Ho ) e freqüências alélicas, utilizando-se alelos de baixa freqüência. A heterozigosidade observada para os quatro fragmentos foi elevada (entre 0,288 a 0,386). A variação genética intrapopulacional, avaliada pela riqueza alélica foi menor nos fragmentos menores que nas populações contida no fragmento controle. Alguns alelos encontrados em menor freqüência no fragmento controle tiveram suas freqüências reduzidas nos fragmentos menores, sendo que um alelo foi perdido nos fragmentos menores, provavelmente devido à redução do tamanho populacional durante a fragmentação, ou à deriva genética após a fragmentação ou a amostragem realizada. O índice de diversidade gênica de Nei (heterozigosidade esperada) não foi muito diferente entre as quatro populações, apesar de mostrar uma tendência à diminuição nos fragmentos menores. Os indivíduos jovens analisados apresentaram valores de f ˆ = 0,0864, sugerindo que estas populações tem vindo de cruzamentos panmíticos, provavelmente anteriores ao processo de fragmentação. Estas quatro populações apresentaram pequena diferenciação genética entre elas ( p q ˆ = 0,0555), o número estimado de migrantes foi relativamente alto (Nm= 4,25). Este trabalho desta forma não foi capaz de detectar o efeito da fragmentação na endogamia desta espécie. / This research is about effects of forest fragmentation on the genetic diversity of Myrciaria floribunda (West ex Willdenow) Berg (cambuí), a tropical tree species from the Atlantic Forest (Mantiqueira hills), State of Minas Gerais. This work is about genetic diversity studies of de Myrciaria floribunda (cambuí), a late successional species from fragmented landscapes of the Mantiqueira hills. Genetic diversity was assessed using electrophoresis of isozymes. Leaves from juveniles trees were collected from four populations, two within a control fragment (5810,27 ha) and from two other small fragments (18 e 10 ha). Forty plants were sampled per populations. Seven loci were studied regarding the average number of alleles per locus (Â), the average number of alleles per polymorphic loci (Âp), percentage of polymorphic loci ( $ P ), expected ( $ He ) and observed heretozigosity ( $ Ho ), and allelic frequency, using alleles of low frequency. The observed heterozigosity was high for all fragments (from 0,288 to 0,386). Within population genetic diversity, measured by allelic richness was lower in small fragments compared with the large fragment. Low frequency alleles found in the large fragment showed an even lower frequencies in the two small fragments. One allele was lost in the small fragments, probably due to a reduction in population size because of the fragmentation process, and probably due to genetic drift or sampling strategy. Nei’s diversity index (expected heterozigosity) did not differ among populations, although lower in the small fragments. The result for f ˆ = 0,0864 indicated that the current populations probably were originated from panmmitic populations, established before the fragmentation process. Little genetic differentiation was detected among populations ( p q ˆ = 0,0555), however the number of migrants was considerably high (Nm= 4,25). Therefore this work was not able to detect the effects of endogamy due to the forest fragmentation on the studied species.

A dificuldade de transformação de tecido adulto de espécies lenhosas é uma barreira ainda a ser contornada para a maioria das cultivares de laranja doce de importância na citricultura brasileira. Esta dificuldade está relacionada ao alto nível de contaminação, ao baixo potencial regenerativo e à baixa capacidade de transformação de tecidos adultos de espécies lenhosas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar o protocolo de transformação genética de tecido adulto de três cultivares de laranja doce. Com ajustes no cultivo in vitro, foi possível obterem-se gemas adventícias transgênicas via Agrobacterium tumefaciens de três cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra e Valência, utilizando material adulto como fonte de explantes. As gemas transgênicas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e confirmados pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento 817 pb, correspondente a parte do gene uidA amplificada. A utilização de meio de co-cultivo com a adição de auxinas e citocininas (2,0 mg L-1 de 2,4 D; 2,0 mg L-1 de AIA e 1,0 mg L-1 de 2-iP), foi o mais eficiente para as três cultivares avaliadas. Meios de seleção com altas concentrações de citocinina (3 mg L-1) favoreceram a regeneração e, conseqüentemente, a transformação de gemas adventícias para as três cultivares estudadas. O uso da sonicação não foi eficiente para diminuir a contaminacão endofítica. Além disso, esta operação diminuiu a eficiência de transformação dos explantes. As eficiências médias de transformação genética encontradas para as três cultivares foram 2,5% para laranja Hamlin, 1,4% para laranja Pêra e 3,7% para laranja Valência. / The difficulty of tissue transformation of adult woody species is still an obstacle to be overcome for most sweet orange cultivars in the Brazilian citrus industry. This difficulty is related to the high level of contamination, low regenerative potential and low transformation capacity of adult tissues of woody species. Thus, the objective of this work was to optimize the protocol for genetic transformation of adult tissue of three cultivars of sweet orange. Therefore, with in vitro culture adjustments, it was possible to obtain transgenic adventitious buds though Agrobacterium tumefaciens of three sweet orange cultivars (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra and Valencia, using adult material as explants source. The transgenic buds were identified as transgenic by the GUS histochemical test and confirmed by the PCR analysis, which showed fragment amplification of 817 bp corresponding to the part of the amplified uidA gene. The use of co-culture media rich in auxins and cytokinins (2.0 mg L-1 of 2.4 D, 2.0 mg L-1 of AIA and 1.0 mg L-1 of 2-iP) was more efficient for all three cultivars. Selection media with high concentrations of cytokinin (3 mg L-1) promoted the regeneration and, consequently, the transformation of adventitious buds in the three cultivars. The use of sonication was not effective to reduce endophytic contamination. Moreover, this procedure reduced transformation efficiency of explants. The average efficiencies of genetic transformation for the three varieties were 2.5% for Hamlin, 1.4% for Pêra and 3.7% for Valência.

O patógeno Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae causa a mancha oleosa ou bacteriose do maracujazeiro, uma doença que acarreta prejuízos à cultura em decorrência da baixa produção de frutos, podendo causar a morte das plantas. Uma coleção de 87 isolados deste patovar, oriundos de 22 cidades dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Paraná e do Distrito Federal, foi usada para estudar a diversidade genética por rep-PCR e AFLP. Nove isolados de outros patovares foram incluídos nas análises genéticas. A técnica rep-PCR revelou pouca diversidade entre os isolados do patovar passiflorae, mas diferenciou, claramente, os diferentes patovares. Todavia, a técnica AFLP revelou considerável diversidade genética entre os isolados do patovar passiflorae. A análise molecular da variância mostrou que a maior parte da diversidade (49,4%) se encontra entre as cidades de coleta. O agrupamento gerado com base nos coeficientes de similaridade e os resultados do teste de atribuição pelo programa Structure revelaram clusters genotípicos homogêneos. Isto evidencia que a variação está mais associada à geografia, ou seja, às cidades de coleta, e que o fluxo desses isolados é pequeno. Cinco conjuntos de primers foram desenhados para a detecção do patógeno em plantas. Desses, um conjunto de primers foi desenhado a partir da seqüência intergênica 16S-23S rRNA e se mostrou específico para o patovar passiflorae. Nenhum amplicon foi detectado nos patovares controles. O restante dos primers foi desenhado a partir do seqüenciamento de locos de AFLP, monomórficos para o patovar passiflorae e ausentes nos demais patovares. Estes primers não foram totalmente específicos; no entanto, todos podem ser recomendados para o diagnóstico da mancha oleosa, uma vez que não há registros de outras Xanthomonas em pomares de maracujá. / The pathogen Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is responsible for the bacterial leaf spot of passion fruits, a disease that provokes commercial losses due to low levels of fruit production and even plant death. A group of 87 isolates of this pathovar, collected from 22 localities of São Paulo, Minas Gerais and Paraná States as in the Federal District was used to evaluate the genetic diversity based on rep-PCR and AFLP. Isolates from other nine pathovars were included in the genetic analyses. Low level of genetic diversity was revealed by the rep- PCR technique, which clearly distinguished the different pathovars. However, considerable diversity between isolates of the pathovar passiflorae was revealed by the AFLP technique. The analysis of molecular variance showed that differences between localities contributed to most part of the variance (49.4%). Groups generated based on similarity coefficients as well as results produced by the software Structure assigning isolates to groups, revealed homogeneous genotypic clusters. This confirms that variance is associated with geographic origin e.g. sampling localities, and that flow of isolates is restricted among localities. Five primer sets were designed for pathogen detection in plants; a primer set was designed for PCR amplification of the intergenic sequence 16-23S rRNA, which was shown to be specific to the pathovar passiflorae. No amplicons were detected in the controls. The remaining primers were designed after sequencing AFLP bands that were monomorphic within the pathovar passiflorae but absent in the other pathovars. These primers were not absolutely specific but all could be recommended for diagnosis of leaf spot as there is no report on the occurrence of other Xanthomonas species in passion fruit orchards.

O conhecimento a respeito de mecanismos de reprodução e geração de diversidade genética de organismos do gênero Leishmania vem sendo alterado com o advento de novas tecnologias. Estudos de laboratório demonstraram ocorrência de reprodução sexuada experimentalmente em organismos do gênero Leishmania. Relatos na literatura mostram a ocorrência de híbridos no ambiente natural, associada a casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA). A partir da caracterização fenotípica realizada utilizando anticorpos monoclonais e eletroforese de isoenzimas em linhagens isoladas de pacientes com LTA na região Amazônica do Brasil, sete isolados (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 e M19697) apresentaram um padrão intermediário entre as espécies L. (V.) shawi shawi e L. (V.) guyanensis. O presente estudo visou realizar a confirmação da identidade híbrida desses parasitas através da clonagem dos isolados, seguida da análise do polimorfismo pela clivagem do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR RFLP) tendo como alvo a enzima de choque térmico de 70 quilodaltons (hsp70). O hsp70 PCR RFLP também foi utilizado para análise comparativa da intensidade dos produtos de digestão, para estimar a ploidia dos híbridos e a proporção da herança dos alelos de hsp70. Foi realizada ainda, avaliação do comportamento biológico in vitro e experimental in vivo desses parasitas. A curva de crescimento foi realizada na 4° e 12° passagem após isolamento do parasita. Infecções experimentais de BALB/c foram realizadas para avaliação da evolução da infecção causada pelo isolado híbrido selvagem M19672 e sua comparação com as cepas parentais L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi. Foi determinada a carga parasitaria em pele, linfonodo e baço dos animais infectados e análise histopatológica das lesões. Os resultados obtidos a partir da clonagem dos isolados demonstraram que se tratavam de populações homogêneas de parasitas. Três isolados apresentaram padrão heterozigoto de L. (V.) guyanensis/L. (V.) s. shawi e quatro isolados apresentaram padrão homozigoto, apresentando somente os alelos de L. (V.) s. shawi. O ensaio de clivagem de sequências polimórficas amplificadas (SNP-CAPS) mostrou que os homozigotos apresentaram o mesmo número de cópias de hsp70 de L. (V.) s. shawi, enquanto que nos heterozigotos os alelos de L. (V.) guyanensis são mais representativos. Os parasitas híbridos apresentaram uma maior plasticidade fenotípica no crescimento in vitro. A infeção de BALB/c pelos parasitas híbridos apresentou uma evolução rápida tendo seu maior pico entre 14 e 28 dias pós-infecção, com regressão posterior da lesão. Esse período foi acompanhado da maior carga parasitária na pele e linfonodo. A infecção causada pelas cepas parentais mostrou aumento progressivo da lesão a partir do 21° dia de infecção para L. (V.) guyanensis e 35° dia para L. (V.) s.shawi. As alterações histopatológicas da lesão causada pelo híbrido apresentaram um padrão intermediário entre as de L. (V.) s. shawi e L. (V.) guyanensis, guardando, no entanto, mais características desta última. Nossos achados confirmam que as cepas analisadas são híbridas entre L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi da região do Baixo Amazonas, estado do Pará, área com alta ocorrência de casos de LTA na Brasil e grande diversidade de espécies do parasita, vetores e reservatórios / Knowledge about the mechanisms of reproduction and generation of genetic diversity of the genus Leishmania organisms has been changed with the advent of new technologies for it studies. Laboratory researches have shown the occurrence of experimentally sexual reproduction in the genus Leishmania. Reports in the literature shows the occurrence of hybrids in the natural environment, associated with cases of american cutaneous leishmaniasis (ACL). From the phenotypic characterization performed using monoclonal antibodies and isozymes in strains isolated from patients with ACL in the Amazon region of Brazil, seven isolates (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 and M19697) showed an intermediate pattern between species L. (V.) shawi shawi and L. (V.) guyanensis. This study aimed to perform the confirmation of the hybrid identity of these parasites by performing cloning of the isolated, followed by analysis of polymorphism by cleavage of the polymerase chain reaction product (PCR RFLP) targeting heat shock enzyme 70 kilodaltons (hsp70). The hsp70 PCR RFLP was also used for comparative analysis of the intensity of the digestion products to estimate the ploidy of the hybrids and the proportion of the inheritance of hsp70 alleles. It was also observed in this study the biological in vitro behavior of these parasites. The growth curve in vitro was held at 4° and 12° passage after the isolation of mammalian host. Experimental infections of BALB /c mice were carried out to evaluate the evolution of the infection caused by the hybrid wild strain M19672 compared to the parental strains L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi. The parasitic load was determined on the skin, lymph nodes and spleen of infected animals and histopathology of the lesions. The results from the cloning of the isolates showed that these are homogeneous populations of parasites. Three isolates presented heterozygous L.(V.) guyanensis/ L.(V.) s. shawi pattern and four presented homozygous pattern with only the L.(V.) s. shawi alleles. The cleavage amplified polymorphic sequences assay (SNP-CAPS) showed that the homozygous had the same number of copies of hsp70 L. (V.) s. shawi, whereas in the heterozygous alleles L. (V.) guyanensis are more representative. Hybrid parasites demonstrated a higher phenotypic plasticity growth in vitro. BALB /c infection by M19762 hybrids showed a rapid evolution with a peak between 14 and 28 days post-infection, with subsequent lesion regression. The period of greatest development of the lesion was accompanied by higher parasite burden in the skin and lymph nodes. The infection caused by parental strains showed a progressive increase in the lesion from the 21th day of infection for L. (V.) guyanensis, and day 35 PI for L. (V.) s. shawi The alteration in the histopathological lesions caused by the hybrid strain showed an intermediate pattern between those of L. (V.) s. shawi and L. (V.) guyanensis, keeping, however, more characteristics of the latter. Our findings confirm that the strains analyzed are true hybrids between L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi from Amazon region, Pará state, an area with high occurrence of ACL in Brazil and diversity of parasite species, vectors and reservoirs

Os vírus possuem potencial de variabilidade genética muito alto, isso porque necessitam divergir seu material genético suficientemente para se adaptar às inúmeras mudanças às quais são submetidos. Portanto, a variabilidade genética é essencial para a sobrevivência desses organismos; é o primeiro passo para a adaptação em um novo hospedeiro, quebra de resistência, alterações nos sintomas e virulência, o que justifica o interesse em estudos nessa área. Os estudos de variabilidade consistem numa excelente ferramenta para a compreensão da evolução dos vírus e busca pelo manejo adequado de doenças virais. Por isso objetivou-se estudar a variabilidade genética da ORF p29 do CiLV-C, a fim de gerar informações relevantes acerca do patossistema e da preponderância de isolados, com possíveis implicações na epidemiologia da doença e seu manejo no campo, além de uma melhor compreensão sobre a evolução desse vírus, que até então nunca havia sido explorada. Neste trabalho foram avaliadas plantas de citros e outras hospedeiras potenciais do CiLV-C. Os resultados sugerem que as plantas de tangerina Cravo, Tardia da Sicília, Cleópatra, Vermelha, tangor Ortanique, laranja Azeda e trapoeraba são suscetíveis à doença e também podem servir como fontes de inóculo do vírus para citros. Já as plantas de limão Siciliano e Cravo, e limas ácidas Tahiti e Galego e Mimosa caesalpiniaefolia mostraram-se resistentes à doença, mas não à colonização do ácaro vetor. As plantas de Malvaviscus arboreus e Solanum violaefolium não apresentaram sintomas, mas mostraram-se possíveis fontes de inóculo do vírus para plantas de citros. Além disso, foram avaliadas as respostas de 62 genótipos de tangerinas e seus híbridos à doença, sendo que 15 mostraram-se resistentes e podem, posteriormente, ser utilizados em programas de melhoramento genético, que é uma das alternativas para reduzir o uso de pesticidas para o controle do vetor. Foi identificada baixa variabilidade genética entre os isolados do CiLV-C, independentemente do hospedeiro ou localidade, entretanto, o isolado de São José do Rio Preto pareceu ser o mais divergente e capaz de passar suas alterações durante sua transmissão a outros hospedeiros. Mais estudos devem ser feitos para que conclusões inquestionáveis sejam tiradas desse assunto, mas os resultados obtidos abriram um novo leque de possibilidades para futuros estudos nessa área até então pouco explorada. / Viruses have, potentially, broad genetic variability because of their need to adapt to several changes that they are exposed to. Therefore, genetic variability is essential for their survival; it is the first step to adapt to a new host, to break resistance down, to change symptoms and virulence, which justifies the interest in studies in this area. These studies consist in a great tool for a better understanding on the virus evolution and the search for a proper management of viral diseases. Hence, it was aimed to study the genetic variability of ORF p29 from CiLV-C in order to generate relevant information about the pathosystem and the predominance of isolates with possible implications on the epidemiology of the disease and its management in the field, besides a better understanding on the evolution of this virus, which has never been explored before. In this work, we evaluated citrus plants and potential hosts for CiLV-C. The results suggest that the plants of Cravo, Tardia da Sicília, Cleopatra, and Vermelha mandarin, Ortanique tangor, Sour orange and spiderwort are susceptible to the disease and can also serve as sources of inoculum of the virus to citrus. Siciliano lemon, Rangpur, Tahiti, and Mexican limes, and Mimosa caesalpiniaefolia were resistant to the disease, but not to the colonization of the mite vector. Malvaviscus arboreus and Solanum violaefolium plants did not present symptoms, but can be considered possible sources of CiLV-C inoculum to citrus plants. In addition, we evaluated the response of 62 mandarin genotypes and their hybrids to the disease. Fifteen of them were considered resistant and could be used in breeding programs with the objective to reduce the use of pesticides to control the vector. Low genetic variability was found amongst CiLV-C isolates, regardless of the host or geographic region; however, the São José do Rio Preto isolate was the most divergent and the changes in nucleotides were transmitted to the other hosts. Further studies should be conducted before unquestionable conclusions can be drawn from this issue, but the results obtained here have opened a new range of possibilities for future studies in this area so far almost unexplored.

The White-bellied Sea-Eagle Haliaeetus leucogaster is widespread in Australia, but has been the subject of conservation concern due to suggested localised declines and extinctions. Regionalised monitoring programmes have addressed some aspects of local concern, however a broader approach is needed to gain an understanding of large-scale processes affecting long-term persistence at scales equivalent to the species Australian range. Ultimately, the ability to predict change in population size over time accurately depends on the scale of analysis. By necessity, ecological studies using direct sampling techniques are often made across spatial scales smaller than a species geographic range and across relatively short time frames. This seems counter-intuitive considering that long-term species persistence is often dependent on large-scale processes. The principal aim of this thesis was to identify historical and contemporary forces responsible for the current pattern of population structure in H. leucogaster. This required a multi-scale approach, and the resulting research uses genetic, distributional and morphometric data. Haliaeetus leucogaster is a large territorial raptor that historically has been associated with coastal regions, lakes and perennial river systems. It has an extensive worldwide distribution from the western coast of India throughout the Indomalaysian region, Papua New Guinea and Australia. By virtue of the species' large-scale distribution, in Australia it is fairly cosmopolitan in its use of habitat and prey types. Haliaeetus leucogaster is monomorphic for adult plumage colouration, but in body size displays reversed sexual dimorphism with female birds significantly larger. A discriminant function based on 10 morphometric characters was 100% effective in discriminating between 19 males and 18 females that had been sexed using molecular genetic methods. Re-classification using a jackknife procedure correctly identified 92% of individuals. The discriminant function should be a viable alternative to genetic sexing or laparoscopy for a large proportion of individuals within the Australo-Papuan range of this species; and can also be used to identify a small proportion of "ambiguous" individuals for which reliable sexing will require those other techniques. I used mitochondrial (mtDNA) control region sequence data to investigate the current distribution of genetic variation in this species at the continental level and within and between specified regional units. I was specifically interested in identifying breaks in genetic connectivity between the west and east of the continent and between Tasmania and the Australian mainland. Overall, genetic diversity was low and there was no significant level of genetic subdivision between regions. The observed genetic distribution suggests that the population expanded from a bottleneck approximately 160 000 years ago during the late Pleistocene, and spread throughout the continent through a contiguous range expansion. There is insufficient evidence to suggest division of the population into different units for conservation management purposes based on the theoretical definition of the 'evolutionary significant unit'. It is clear from the analysis that there are signatures of both historical and contemporary processes affecting the current distribution. Given the suggestion that population expansion has been relatively recent, additional sampling and confirmation of the perceived pattern of population structure using a nuclear marker is recommended to validate conservation monitoring and management at a continental scale. To determine the existence of perceived population declines across ecological time scales, I analysed the Australian Bird Atlas Data to identify the extent and pattern of change in range and density of the species between three Atlas Periods (1901-1976, 1977-1981 and 1998-2001) using a new standardised frequency measure, the Occupancy Index (OI) for 1° blocks (approx. 100km2) across the continent. At the continental scale, there was no significant difference in the spatial extent of occupancy between Atlas Periods. However, there were considerable changes in frequency and range extent between defined regions, and there were distinct differences in the pattern of change in OI between coastal and inland blocks over time. Coastal blocks showed much more change than inland blocks, with a clear increase in the use of coastal blocks, accompanied by a decrease in inland blocks, during the 1977-1981 Atlas Period, relative to both other Atlas Periods. The over-riding factor associated with distributional shifts and frequency changes was apparently climatic fluctuation (the 1977-1981 period showing the influence of El Nino associated drought). The impression of abundance was strongly dependent on both the temporal and spatial scale of analysis. To test for correspondence between geographic variation in morphology and geographic variation in mtDNA I analysed morphometric data from 95 individuals from Australia and Papua New Guinea. First, the degree of morphometric variation between specified regions was determined. This was then compared with the pattern of genetic differentiation. There was a strong latitudinal cline in body dimensions. However, there was no relationship between morphometric variation and patterns of genetic variation at least for mtDNA. Females showed a pattern of isolation by distance based on morphometric characters whereas males did not. Three hypotheses to explain the pattern of morphometric variation were considered: phenotypic plasticity, natural selection and secondary contact between previously isolated populations. I conclude that the pattern of morphometric variation is best explained by the suggestion that there is sufficient local recruitment for natural selection to maintain the observed pattern of morphometric variation. This implies that gene flow may not be as widespread as the mtDNA analysis suggested. In this instance either the relatively recent colonisation history of the species or the inability of the mtDNA marker to detect high mutation rates among traits responsible for maintaining morphometric variation may be overestimating the levels of mixing among regions. As might be expected given the physical scale over which this study was conducted, the pattern of genetic, morphometric and physical distribution varied dependent on the scale of analysis. Regional patterns of genetic variation, trends in occupancy and density and morphometric variation did not reflect continental patterns, reinforcing the contention that extrapolation of data from local or regional levels is often inappropriate. The combined indirect methodologies applied in this study circumvent the restrictions imposed by direct ecological sampling, because they allow survey across large geographic and temporal scales effectively covering the entire Australian range of H. leucogaster. They also allow exploration of the evolutionary factors underpinning the species' current distribution.

農林水産研究情報センターで作成したPDFファイルを使用している。