Os polimorfismos do gene da paraoxonase 1 (PON1) estão relacionados ao metabolismo lipídico conferindo efeito marginal e modesto nas concentrações séricas das lipropoteínas e sobre o risco de desenvolvimento de doença arterial coronária (DAC). O objetivo primário deste estudo é avaliar se há associação entre os polimorfismos da PON1: R192Q- rs662, R160G: rs13306698, Leu55Met: rs854560, Promoter_161: rs705381 e rs3917464 e eventos cardiovasculares em 5 anos numa sub-população com DAC estável do estudo MASS II (Medical, Angioplasty or Surgery Study II). Como objetivos secundários, investigamos a influência destes polimorfismos nas concentrações lipídicas iniciais e após 5 anos de acompanhamento, e também a sua relação com os desfechos cardiovasculares combinados no grupo randomizado para tratamento clínico exclusivo. Foram randomizados 611 pacientes para o MASS II. A população alvo deste estudo foi constituída por 518 pacientes que tiveram material genético coletado (MASS II Genético). Os polimorfismos avaliados, apesar de estarem associados ao metabolismo do HDL-c, apresentaram baixa associação com os níveis lipídicos e com o seu comportamento ao longo de 5 anos. Houve diferença nas concentrações médias de HDL-c entre os genótipos do Promoter_161, o alelo T associado a concentrações mais baixas de HDL-c (p=0,0369). Análise univariada mostrou que houve associação entre o raro alelo G do polimorfismo R160G (5 pacientes) e aumento da mortalidade, porém quando incluído no modelo ajustado por regressão logística multivariada não se mostrou preditor independente de óbito nesta população. Na análise do grupo randomizado para o tratamento médico, o polimorfismo R192Q está associado de forma independente ao novo infarto agudo do miocárdio, óbito, e eventos combinados. Genótipo GG aumentou o risco de óbito em 7,69 vezes (IC: 1.65- 35.76) e de IAM em 6,58 vezes (IC: 1.39- 30.46) quando comparado ao genótipo AA. Alelo A estava independentemente associado a ocorrência de eventos cardiovasculares combinados com um OR de 3,03 (IC: 1.29- 7.07). Em conclusão, o nosso estudo mostrou associação do alelo G na posição R160G com risco aumentado de óbito em pacientes com DAC estável. Em pacientes mantidos no tratamento clínico a posição R192Q está associada ao maior risco de óbito, IAM e eventos cardiovasculares combinados. / Paraoxonase 1 (PON1) gene polymorphisms have a known relation with lipid metabolism, conferring a marginal and modest effect on serum lipoprotein concentrations and also on development of coronary artery disease (CAD). The primary objective of this study is to investigate the association between PON1 polymorphisms: R192Q- rs662, R160G: rs13306698, Leu55Met: rs854560, Promoter_161: rs705381, and rs3917464 and 5-year follow-up cardiovascular events in a subpopulation with stable CAD from MASS II (Medical, Angioplasty or Surgery Study II). Secondary objectives will be to evaluate the influence of these polymorphisms on baseline and 5-year follow-up lipid concentrations and also its association with combined cardiovascular events in the MASS II group randomized for medical treatment. MASS II had 611 patients randomized. Target population comprises 518 patients who had genetic material sampled. Even though the polymorphisms were linked to HDL-c metabolism, there was a low association with lipid levels and changes over the 5-year follow-up. HDL-c mean concentrations were different in the Promoter_161 genotypes, T-allele was associated with lower levels (p=0.0369). Univariate analysis showed association between the rare G-allele of polymorphism R160G (5 patients) and increased mortality, but when adjusted in the multivariate logistic regression model this variable was not independent predictor of mortality in this population. In the medical treatment group, r192Q is associated with new myocardium infarction (MI), combined events and death. When compared to AA genotype, GG genotype increased the risk of death by 7.69 (CI: 1.65- 35.76) and of MI by 6.58 (CI: 1.39- 30.46). A-allele is independently associated with combined cardiovascular events with a OR of 3.03 (CI: 1.29- 7.07). In conclusion, this study showed association between G-allele on R160G position with increased mortality in patients with stable CAD. R192Q polymorphism is associated with higher risk of death, MI and combined cardiovascular events in patients treated medically.

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O objetivo deste estudo foi investigar a atividade da PON1 e sua associação a polimorfismos genéticos, fatores bioquímicos e nutricionais em crianças de 5 a 7 anos de idade atendidas em ambulatórios de pediatria de duas cidades do sul do Rio Grande do Sul. Foi realizado um estudo transversal no período de Janeiro de 2014 a Fevereiro de 2015. O consumo alimentar foi avaliado pelo questionário do SISVAN. Medidas de peso, altura e circunferência da cintura da criança foram utilizadas para avaliar o estado nutricional. Uma amostra de sangue foi coletada e utilizada para avaliação do perfil lipídico e da atividade arilesterase da PON1, medida utilizando fenilacetato como substrato. A amostra biológica também serviu para a determinação do polimorfismo PON1 C(-107)T, realizada pela amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão com enzima de restrição. Os dados coletados foram analisados no programa Stata versão 12, assumindo-se um nível de significância de 5%. A mediana da atividade arilesterase da PON1 foi de 89,4kU/L, semelhante entre meninos e meninas. A análise do polimorfismo revelou que o genótipo mais frequente foi o heterozigoto CT (52,1%). O polimorfismo se mostrou em equilíbrio de Hardy-Weinberg. O genótipo CC mostrou valores mais elevados de atividade enzimática do que os apresentados pelo genótipo TT (p<0,01). Níveis desejáveis de HDL relacionaram-se a um incremento significativo da enzima na população total. As concentrações desta lipoproteína foram significativamente maiores apenas nas crianças eutróficas portadoras do genótipo CC em comparação às portadoras do alelo T. Este é o primeiro estudo investigando o consumo alimentar como possível determinante dos níveis enzimáticos da PON1 em crianças. Foi verificado que aquelas que consumiram salada crua regularmente mostraram maiores níveis (p<0,01) de atividade enzimática. A associação entre o genótipo -107CC, consumo regular de salada crua, maior atividade da PON1 e concentração de HDL-C em crianças eutróficas sugere que os fatores genéticos e suas interações com o ambiente estão relacionados a um perfil protetor contra o desenvolvimento de DCV. / Childhood is a vulnerable period for the start of endothelial lesions, which may be aggravated by exposure to nutritional risk factors. On the other hand, it is proven that an elevated concentration of high density lipoprotein (HDL) protects against the emergence of these lesions, resulting in a lower risk of cardiovascular disease (CVD) development. The main antioxidant and anti-inflammatory enzyme that contributes to the antiatherogenic property attributed to HDL is paraoxonase 1 (PON1). Its serum activity may be influenced by several parameters including genetic polymorphisms, nutritional factors, lifestyle, age, drugs, health status and oxidative stress. The aim of this study was to investigate the serum PON1 activity and its association to genetic polymorphisms, biochemical and nutritional factors in children aged 5-7 years, attending pediatric clinics in two cities in southern Rio Grande do Sul. A cross-sectional study was conducted from January 2014 to February 2015. Dietary intake was assessed by SISVAN questionnaire. Weight, height and waist circumference of the child were used to evaluate nutritional status. A blood sample was collected and used to assess lipid profile and PON1 arylesterase activity, measured using phenylacetate as substrate. The biological sample was also used to determine the polymorphism PON1 C(-107)T, genotyped by PCR amplification followed by restriction digestion. Data were analyzed in Stata program version 12, assuming a 5% significance level. The median PON1 arylesterase activity was 89,4kU/L, similar between boys and girls. The polymorphism analysis revealed that the most common genotype was the heterozygous CT (52.1%). The polymorphism was in Hardy-Weinberg equilibrium. The CC genotype showed higher levels of enzyme activity than those presented by TT genotype (p<0.01). Desirable levels of HDL were related to a significant increase of the enzyme in the entire population. These lipoprotein concentrations were significantly higher only in normal weight children carrying the CC genotype compared to those carrying the allele T. This is the first study investigating food consumption as a potential determinant of PON1 enzymatic levels in children. It was verified that those who regularly consumed raw vegetables showed higher levels (p<0.01) of enzyme activity. The association between -107CC genotype, regular consumption of raw vegetables, higher PON1 activity and HDL-C concentration in normal weight children suggests that genetic factors and their interactions with the environment are related to a protective profile against the development of CVD.

Abstract Pulmonary surfactant is a lipid-protein mixture that lines the inner surface of the lung. The main function of surfactant is to reduce surface tension at the air-liquid interface, thus preventing alveolar collapse at the end of expiration. Lack of surfactant is the main cause of respiratory distress syndrome (RDS) in preterm infants. Very preterm babies are at risk of developing a lung disease called bronchopulmonary dysplasia (BPD). The surfactant proteins SP-A, -B, -C and -D have important functions in surfactant structure, homeostasis and innate immunity of the lung. The genes of these proteins have been studied as candidates for several multifactorial lung diseases both in adults and in children. The aim of the present study was to examine the genetic variation in SP genes and to evaluate the role of SP gene polymorphism in the etiology of severe pulmonary infantile diseases, including RDS, BPD and severe respiratory syncytial virus (RSV) infection among the Finnish population. Conventional allelic association methods in combination with multiparameter analysis and family-based transmission disequilibrium test (TDT) were used. The SP-D Met11 allele was associated with a risk for severe RSV bronchiolitis in a matched case-control setting of 84 infants with severe RSV infection and 93 control infants. The variants of the SP-C gene had no detectable association with BPD. However, a modest association of SP-C Asn138 and Asn186 alleles with RDS was found. A length variation in the SP-B gene was associated with BPD among very preterm infants born before 32 weeks of gestation. The SP-B intron 4 deletion variant allele increased the risk for BPD especially in very low birth weight infants. The association was confounded by birth order, being evident only among presenting infants, who are more prone to ascending infections during a preterm birth process. The present study provides new evidence about the significance of SP gene polymorphisms in the etiology of complex infantile pulmonary diseases, including RDS, BPD and severe RSV bronchiolitis. The results help us to understand the molecular mechanisms underlying these diseases and may, in the long run, enable better treatment of these life-threatening diseases. / Tiivistelmä Keuhkosurfaktantti on keuhkon sisäpintaa peittävä kalvomainen rasva-proteiinikompleksi, jonka tärkein ominaisuus on pintajännityksen vähentäminen keuhkorakkuloissa. Surfaktantin puutos ennenaikaisesti syntyneillä lapsilla aiheuttaa hengitysvaikeusoireyhtymän, RDS-taudin (respiratory distress syndrome). Alle 30 raskausviikon iässä syntyneistä, useimmiten RDS-taudin saaneista keskosista n. 30 % sairastuu vakavaan krooniseen keuhkotautiin, BPD-tautiin (bronchopulmonary dysplasia). Surfaktanttiproteiineilla SP-A, -B, -C ja -D on osoitettu olevan tärkeä tehtävä surfaktantin toiminnassa ja keuhkon synnynnäisessä immuniteetissa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää surfaktanttiproteiineissa esiintyvän geneettisen muuntelun määrää ja merkitystä keskosten RDS- ja BPD-taudeissa sekä pienten lasten vakavassa respiratory syncytial -viruksen (RSV) aiheuttamassa keuhkotulehduksessa. Tutkimuksen laajin osa keskittyi tutkimaan keskosten BPD-tautia ja surfaktanttiproteiinien geenien osuutta siinä. Geneettisen muuntelun merkitystä tarkasteltiin populaatiogeneettisin keinoin tapaus-verrokkiasetelmissa ja perheaineistojen avulla. Yhteensä analysoitiin noin tuhannen lapsen ja yli kahdensadan vanhemman DNA-näytteet. Tutkimuksessa havaittiin SP-D-geenissä olevan metioniini11-geenimuodon liittyvän pienten lasten vakavaan RSV-infektioon. Lisäksi saatiin uutta tietoa SP-C-geenin populaatiotason yleisestä muuntelusta ja todettiin SP-C:n asparagiini138 ja asparagiini186 -geenimuotojen yhteys keskosten RDS-taudin esiintymiseen. Merkittävin löydös oli SP-B-geenissä olevan deleetiovariantin kytkeytyminen alle 32-viikkoisina syntyneiden keskosten BPD-tautiin. Geneettisen altistuksen lisäksi BPD-tautiin sairastumiseen vaikuttivat lukuisat keskosuudelle ominaiset seikat, kuten alhainen syntymäpaino, RDS-tauti ja syntymähetkellä todettu hapenpuute. Geneettisen tekijän vaikutus oli voimakkain erittäin pienipainoisilla keskosilla. Tutkimuksen tulokset ovat tuoneet arvokasta lisätietoa surfaktanttiproteiinien geenien osuudesta keskosten RDS- ja BPD-taudeissa sekä pienten lasten vakavassa RSV-infektiossa. Ne auttavat ymmärtämään näiden molekyylibiologisia syntymekanismeja ja voivat ajan mittaan olla edistämässä uusien hoitomuotojen kehittämistä.

FUNDAMENTOS: O polimorfismo e a atividade da enzima conversora da angiotensina (ECA) contribuem, de forma significante, na expressão fenotípica e no prognóstico de pacientes com cardiomiopatia. OBJETIVOS: Determinar o polimorfismo da ECA, realizar a sua dosagem sérica e correlacioná-los com o grau de hipertrofia miocárdica e o índice de massa do ventrículo esquerdo em pacientes com cardiomiopatia hipertrófica (CMH) nas formas familiar e não familiar. CASUÍSTICA E MÉTODO: Foram estudados 136 pacientes consecutivos com CMH (69 da forma familiar e 67 da forma não familiar) com média de idade de 40,53±17,45 anos, sendo 76 do sexo masculino. Os indivíduos foram submetidos ao ecocardiograma para obtenção das medidas do septo interventricular, parede posterior e massa do ventrículo esquerdo e coleta de sangue para determinação do polimorfismo e dosagem sérica da atividade da ECA. RESULTADOS: Quanto ao genótipo do polimorfismo do gene da ECA, encontramos DD 47(35%), ID 71(52%) e II 18 (13%), sendo que do genótipo DD 34% na forma familiar e 36% na forma não familiar. A média da atividade da ECA foi de 56.414±19.236 para os pacientes com CMH na forma familiar e de 55.085±22.634 para a forma não familiar (p = 0,714). A média do índice de massa do ventrículo esquerdo na forma familiar foi 154±63 g/m2 e na forma não familiar foi 174±57 g/m2 (p = 0,008). A média do septo interventricular nas formas familiar e não familiar foi, respectivamente, 19±5 mm e 21±5 mm (p = 0,020). A média da parede posterior do ventrículo esquerdo nas formas familiar e não familiar foi, respectivamente, 10±2 mm e 12±3 mm (p = 0,0001). Não observamos correlação entre o polimorfismo e o grau de hipertrofia miocárdica (p = 0,651). Houve correlação positiva entre a atividade da ECA e o índice de massa do ventrículo esquerdo (p = 0,038). Os pacientes com a forma familiar, pela curva de regressão logística, possuíam o risco de apresentar índice de massa maior ou igual 190 g/m2, somente com o dobro do valor da atividade da ECA, quando comparados aos pacientes com a forma não familiar (p = 0,022). CONCLUSÕES: Não houve diferença estatisticamente significante entre o genótipo do polimorfismo e da atividade da ECA nos pacientes com CMH nas formas familiar e não familiar. Não houve correlação entre o polimorfismo da ECA e o grau de hipertrofia miocárdica. Houve correlação positiva entre a atividade da ECA e o índice de massa do ventrículo esquerdo. / BACKGROUND: The polymorphism and the activity of the angiotensin converting enzyme (ACE) contributes of significant form in the phenotypic expression and the prognostic of patients with cardiomyopathy. OBJECTIVES: To determine the ACE polymorphism and ACE plasma levels in patients with hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in the familial and nonfamilial forms and to correlate it with the degree of myocardium hypertrophy and with the left ventricular mass index. PATIENTS AND METHODS: 136 consecutive patients with HCM (69 of familial and 67 of nonfamilial forms) were studied. The mean age was 40.53±17.45 years, 76 were male. The individuals were submitted to the Echo-Doppler for the measurement of interventricular septum, wall thickness and the left ventricular mass index. The blood samples were taken for extraction of the DNA for the polymerase reaction and measurement of ACE plasma levels. RESULTS: Regarding the genotype of the ACE gene polymorphism, we found DD 47 (35%), ID 71 (52%) and II 18 (13%), being that of genotype DD 34% in the familial and 36% in the nonfamilial forms. The mean of the activity of the ACE was 56.414±19.236 for the patients with HCM in the familial form and 55.085±22.634 in the non familial form (p = 0.714). The mean of the left ventricular mass index in the familial form was 154±63 g/m2 and in the nonfamilial form was 174±57 g/m2 (p = 0.0080). The mean of interventricular septum in the familial and nonfamilial forms was 19±5 mm and 21±5 mm (p = 0.0200), respectively. The mean of the wall thickness in the familial and nonfamilial forms was 10±2 mm and 12±3 mm (p = 0.0001), respectively. We did not observe correlation between the polymorphism and the degree of myocardium hypertrophy (p = 0.651). A positive correlation between the activity of the ACE and the left ventricular mass index (p = 0.038) was observed. In patients with the familial form, using a logistic regression curve, they had the risk to present the left ventricular mass index >= 190 g/m2, only with the double of the value of the activity of the ACE, when compared with the patients in the nonfamilial form (p = 0.022). CONCLUSIONS: There was no difference between the patients with HCM in the familial and nonfamilial forms regarding genotype of the polymorphism and activity of the ACE. There was no correlation between the polymorphism of the ACE with the degree of myocardium hypertrophy. Positive correlation with the activity of the ACE and the left ventricular mass index was observed.

Variantes genéticas trombogênicas podem aumentar o risco de eventos adversos em pacientes com coronariopatia crônica. Estudos prévios demonstraram que o Haplótipo H2 do gene do receptor P2Y12 apresenta uma maior agregação plaquetária e está associado com a presença de isquemia arterial periférica. A metaloprotease ADAMTS13 é responsável pela clivagem do fator de von Willebrand e recentemente foi associada com doença isquêmica coronariana. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das variantes genéticas funcionais trombogênicas dos Haplótipos H1 e H2 do receptor plaquetário P2Y12 e dos polimorfismos C1342G (Q448E), C1852G (P618A) e C2699T (A900V) da metaloprotease ADAMTS13 em 611 pacientes com doença arterial coronariana multiarterial com função ventricular preservada, acompanhados por um período de 05 anos no ensaio clínico do projeto MASS II (Medical, Angioplasty, or Surgery Study II) em relação aos eventos morte, infarto agudo do miocárdio, angina refratária necessitando um novo procedimento e acidente vascular cerebral. Neste estudo, a avaliação dos Haplótipos H1 e H2 nos pacientes do MASS II não encontrou diferença entre estes haplótipos e os eventos estudados. A análise dos polimorfismos da ADAMTS13 não encontrou associação entre os polimorfismos e os eventos estudados, exceto para a variante genética T2699 (Val900) que está associada com o evento morte (OR: 1,67 95%IC: 1-2,78, p= 0,049) e morte por causa cardiovascular (OR: 2,23 95%IC: 1,2-3,94, p=0,004) e apresenta uma diminuição na sobrevida livre de morte por causa cardíaca para os portadores do genótipo TT relacionado à este polimorfismo. A análise dos haplótipos e das combinações alélicas destes polimorfismos não apresentou associação com eventos ou com a sobrevida livre dos eventos nestes pacientes. / Thrombotic genetic variants could improve the risk of adverse events related to coronary arterial disease (CAD). P2Y12 platelet receptor H2 haplotype showed higher aggregation index and a positive association was described between such genetic variant and peripheral artery disease. DAMTS13 is a metaloprotease responsible to von Willebrand factor cleavage recently found correlated to CAD. We tested the genetic variants P2Y12 receptor H1 and H2 haplotypes and ADAMTS13 polymorphisms C1342G (Q448E), C1852G (P618A) and C2699T (A900V) in a group of 611 patients enrolled in the Medical, Angioplasty, or Surgery Study II (MASS II), a randomized trial comparing treatments for patients with coronary artery disease (CAD) and preserved left ventricular function in a follow up period of 05 years. The incidence of the end points of death and death from cardiac causes, myocardial infarction, refractory angina requiring revascularization and cerebrovascular accident was determined for P2Y12 H1 and H2 haplotypes and ADAMTS polymorphisms. In our study, we did not disclose any association between H1 or H2 haplotype groups regarding the incidence of any of the studied cardiovascular end-points. The association of ADAMTS13 genotypes and cardiovascular events did not showed any association between C1342G (Q448E), C1852G (P618A) variants and cardiovascular end points. Our date provide a strong association between T2699 variant and increased risk to death (OR: 1,67 CI: 1-2,78, p= 0,049) and cardiac death (OR: 2,23 CI: 1,2-3,94, p=0,004) in a population with CAD. The allelic combinations and haplotypes obtained from ADAMTS13 polymorphisms were not associated to cardiac end points and survival differences between MASS II patients.

3 vidéos sont dans des fichiers complémentaires à ce mémoire / Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) ont une structure génétique très particulière et certains aspects de leur génétique sont encore incompris et peu documentés. Les CMA se reproduisent par voie asexuée à l’aide de spores multinucléées. Dans cette étude, j’ai cherché à comprendre les mécanismes de l’hérédité génétique des noyaux par la voie de la reproduction asexuée chez les CMA. La première étape était de déterminer le contenu en noyaux des spores matures, ainsi que celui des spores en formation. Des analyses statistiques ont été utilisées pour vérifier le type de relation entre le nombre de noyaux et le diamètre des spores. Quatre espèces du genre Glomus ont été observées au microscope confocal. Les résultats démontrent une hétérogénéité entre les spores dans leur contenu en noyau pour un même diamètre en plus d’une relation positive entre le nombre de noyau et le diamètre de la spore. Afin de vérifier le contenu en noyaux dans les phases extraracinaires, trois différentes structures du mycélium ont été observées au microscope confocal. Aucune structure n’a été retrouvée avec un seul noyau, ce qui permet de conclure que les CMA ne possèdent vraisemblablement pas de stade uninucléé dans leurs phases extraracinaires. Pour étudier l’hérédité des noyaux, deux différentes approches ont été utilisées: (i) Glomus irregulare a été mis sur milieu complémenté avec de l’aphidicoline pour inhiber la mitose. Des observations au microscope confocal ont permis de dénombrer les noyaux qui sont issus des hyphes et non des mitoses. Les résultats indiquent que la population de noyaux présents dans les spores matures provient d’une migration massive de noyaux à l’intérieur des spores en formation suivie d’un nombre faible de mitoses. (ii) La deuxième approche est l’observation microscopique en temps-réel de spores en formation de G. diaphanum qui a permis de confirmer cette affirmation, car il a été possible de voir plusieurs noyaux entrer dans la spore. Dans la dernière partie de cette étude, je me suis intéressée aux échanges génétiques horizontaux chez les CMA qui sont possibles grâce aux anastomoses. Quatre isolats de l’espèce G. irregulare ont été croisés en co-culture par couple de deux isolats (six croisements) pour permettre une proximité propice aux anastomoses et aux échanges génétiques. Ces croisements ont été maintenus pendant deux ans en culture par le repicage des racines colonisées. Des spores des deux différents isolats ont été confrontées sur eau gélifiée, afin d’observer la formation d’anastomose. Un pourcentage de 13% de formation de fusions d’hyphes pour une des confrontations suggère que l’échange des marqueurs parentaux a pu avoir lieu entre les deux isolats grâce aux anastomoses. Un marqueur moléculaire mitochondrial nommé Indel 5 a été développé et utilisé pour l’analyse des spores filles. Ce marqueur possède entre les isolats une délétion de 39 pb et la différence entre les isolats est facilement détectable sur gel d’électrophorèse après amplification PCR. Le génotypage par PCR des spores individuelles a montré que certaines des spores filles issues du croisement possèdent un des deux marqueurs parentaux alors que d’autres spores ont un génotype qui semble posséder les deux marqueurs. Même si la fusion d’hyphes entre spores en germination est possible, d’autres recherches devront être réalisées pour confirmer qu’un échange génétique est possible entre deux isolats très éloignés géographiquement. Le fait qu’il n’existe aucun stade uninucléé au cycle de vie des CMA et qu’il y ait une migration massive de noyaux lors de la formation des spores permet de limiter la dérive génique lors de la reproduction asexuée. Les anastomoses, quant à elles, permettent de rétablir la diversité génétique. Ces deux particularités de la génétique des CMA ont été fort importantes au cours de leur évolution pour permettre de maintenir une variabilité génétique élevée et permettre ainsi une grande adaptation à différents type d’habitats. / Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) have a particular and complex genetic structure. Yet, many aspects of their genetics are still misunderstood and poorly documented. These organisms reproduce by asexual multinucleate spores. In this study, I investigated the mechanisms of genetic inheritance of nuclei through asexual reproduction in AMF. First, I determined the number of nuclei in mature and juveniles spores; I used statistical analysis to determine the relationship between the number of nuclei and the spore diameter. Four species from the genus Glomus were observed with a confocal microscope. The results showed that the number of nuclei has a significant positive relationship with spore diameter and more importantly, surprising heterogeneity in the number of nuclei among sister spores was found. To determine the number of nuclei in extraradical phases, three different structures from the mycelia were carefully examined with a confocal microscope. All the structures possessed more than one nucleus and showed that AMF probably lack a single-nucleus stage during their extraradical phases. To study the nuclei’s heritance, two different approaches were used: (i) Glomus irregulare was grown on medium complemented with aphidicolin to inhibit the mitosis. Observations with a confocal microscope permit to count the nuclei that come from the hyphae and not from the mitosis. The results showed that massive nuclear migration and mitosis are the mechanisms by which AMF spores are formed. (ii) The second approach confirm these results because with time-laps live cellular imaging of young spores of Glomus diaphanum it was possible to see many nuclei to get in the spores. In a second part of this thesis, I studied horizontal gene exchanges among AMF isolates through anastomoses. Thus, four isolates of the species G. irregulare were used in in vitro crossing experiments, in total six combinations using two isolates per crossing experiment. These crossing co-cultures were maintained over two years by subculturing. Spores of two different isolates were confronted in vitro prior to observation of anastomoses. 13% of spores formed anastomoses suggesting the occurrence of genetic exchange between two isolates. A mitochondrial molecular marker referred as Indel 5, was used to genotype individual spores of crossing progenies. A 39 bp deletion occurs in the marker among different isolates and is clearly discriminated by PCR. PCR patterns showed that some spores seem to have both parental markers demonstrating that genetic exchange could occur between the two isolates used in crossing experiment. Even though hyphal fusions occur between germinating spores, subsequent research needs to be done to confirm genetic exchange among different isolates from different geographic areas. The finding that AMF lack a single nuclear stage in their extraradical phases and that mitosis and nuclear migration are the mechanisms by which AMF spores are formed reduce genetic drift that acts on these organisms during asexual reproduction. Anastomoses are likely a mechanism that maintains the genetic diversity in AMF. These genetic characteristics of AMF were very important during their evolution to maintain a high genetic variability that allows their adaptation to many different ecosystems.

A deficiência da 21-hidroxilase é uma freqüente doença autossômica recessiva caracterizada por manifestações hiperandrogênicas, que se iniciam na infância, puberdade ou vida adulta. Observa-se existência de forte correlação do comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com a forma clínica e com as concentrações basais e pós-estímulo da 17OH-progesterona. Entretanto, não se observa a mesma correlação com a intensidade, idade de início das manifestações e com as concentrações séricas de testosterona. Sugere-se que variações individuais na sensibilidade periférica aos andrógenos ou no metabolismo da testosterona poderiam estar implicadas na variabilidade fenotípica desta doença. Porém, os possíveis mecanismos nunca foram estudados na literatura. Os andrógenos têm sua ação mediada pelo receptor de andrógenos (AR), cujo gene apresenta um trato polimórfico de repetições CAG, o qual modula sua atividade de transativação. Em tecidos periféricos a ação androgênica pode ser ainda potencializada pela enzima 5 alfa-redutase, que transforma testosterona em dihidrotestosterona. O seu gene codificador (SRD5A2) possui vários polimorfismos que alteraram esta atividade de biotransformação nos tecidos periféricos. No clearance da testosterona, os citocromos hepáticos P4503a4, P4503a5 p4503a7 e P4502c19 são os principais envolvidos. Além disso, outro citocromo, o P450c17 representa uma enzima chave na via de produção de andrógenos. Para os citocromos P450 tipo 2, tanto da via de clearance como de síntese dos andrógenos, é necessário ainda a interação com o P450 óxido-redutase para realizar suas reações de hidroxilação. São descritos polimorfismos em todos os genes acima referidos, que alteram sua expressão ou a eficiência catalítica e, consequentemente, tem sido envolvidos na etiologia de doenças andrógeno-dependentes. Consideramos que alterações nos genes codificadores das proteínas relacionadas ao metabolismo e/ou ação periférica dos andrógenos possam atuar na modulação do fenótipo da forma não clássica. Objetivos: Correlacionar o nCAG do gene AR e os polimorfismos nos genes CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19 e CYP17A1, POR e SRD5A2 com a idade de aparecimento dos sintomas, score de Ferriman do hirsutismo ao diagnóstico, presença de virilização, com as concentrações séricas basais de testosterona, bem como com a ausência ou presença de sintomas. Casuística: Selecionamos 122 pacientes com diagnóstico de forma não clássica confirmado por 17OH-progesterona basal ou pós-estímulo com ACTH 10 ng/mL. Todos os pacientes tiveram o diagnóstico molecular, ou seja, mutações identificadas nos dois alelos do gene CYP21A2. As pacientes foram divididas de acordo com o comprometimento da atividade da 21-OH predito pelo genótipo em grupos A/C (grave) e C/C (moderado). As pacientes também foram divididas em grupos pediátrico e adulto, início das manifestações antes e após os 12 anos, respectivamente. Metodologia: O DNA foi extraído de leucócitos periféricos. As regiões de repetições CAG foram amplificadas por PCR e os produtos submetidos à eletroforese capilar e análise pelo software GeneScan. Amostras de DNA das pacientes heterozigotas para o número de repetições CAG foram digeridas com a enzima Hpa II e os produtos submetidos à amplificação da região CAG para se determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Os genes CYP3A5, CYP3A4, CYP3A7, CYP17A1, CYP2C19, POR e SRD5A2 foram amplificados por PCR e submetidos à reação de seqüenciamento ou à reação de digestão enzimática para rastreamento das variantes alélicas. Os resultados foram comparados com as respectivas seqüências selvagens depositadas no GeneBank. Na análise estatística foram empregados os testes t de Student, ANOVA, Wilcoxon rank-sun, Kruskall Wallis rank e regressão linear. Resultados: Observamos uma frequência significativamente menor de alelos longos (> 26 repetições) do trato CAG do AR no grupo pediátrico em relação ao de adultos com genótipo 21-OH do grupo C/C (p=0,01). Adicionalmente, a média ponderada do trato CAG foi significativamente menor nas pacientes com clitoromegalia (19,1 ± 2,7) em comparação com a de pacientes sem virilização (21,6 ± 2,5), correlação que independeu do genótipo da 21-OH. A mediana das concentrações séricas de testosterona foi significativamente maior nas carreadoras da variante CYP17A1*A2 (145,7 ng/dL, 126-153) em relação às carreadoras da variante selvagem (57 ng/dL, 36-87) com genótipo 21-OH do grupo A/C. As demais variantes não se correlacionaram com os fenótipos clínico e hormonal. Conclusão: Observamos que o trato CAG apresentou efeito na modulação do fenótipo de virilização de mulheres com forma não clássica. Além disso, o trato CAG pode ter contribuído no período de início das manifestações, uma vez que o grupo pediátrico com genótipo C/C teve freqüência menor de alelos longos em relação às adultas. Dentre as variantes alélicas pesquisadas, que alteram a síntese e/ou metabolismo dos andrógenos, identificamos associação do alelo CYP17A1*A2 com concentrações maiores de testosterona. Embora tenhamos avaliado uma casuística expressiva para esta patologia, para as demais correlações com resultados negativos, não podemos afastar um efeito do tamanho da amostra. / Introduction: The 21-hydroxylase deficiency is a common autosomal recessive disease characterized by clinical hyperandrogenism, which could begin at childhood, puberty or adulthood. There is a strong correlation among impairment of enzymatic activity conferred by genotypes, clinical forms, basal and post-stimulation 17OH-progesterone (17-OHP) levels. However, we did not observe the same correlation with the intensity, age at onset of manifestations and basal testosterone levels. It is suggested that individual variations in the androgen peripheral sensitivity and/or metabolism could be implicated in the phenotypic variability of this disease. However, potential mechanisms have never been studied before. The androgen action is mediated by the androgen receptor (AR), whose gene has a polymorphic CAG repeat that modulates its transactivation activity. In the peripheral tissues, the androgen action is modified by the 5 alpha-reductase type 2 activity, which converts testosterone into a potent androgen, dihydrotestosterone. Its coding gene (SRD5A2) carries several polymorphisms altering its catalytic activity in the peripheral tissues. Regarding the testosterone clearance, hepatic cytochromes P4503a4, P4503a5 p4503a7 P4502c19 are the most important. In addition, another cytochrome, P450c17, is a key enzyme in the androgen production pathway. For the cytochrome P450 type 2 activities, involved in the androgen clearance and/or synthesis, an interaction with the P450 oxidoreductase is still necessary. Polymorphisms are described in all the aforementioned genes, which change their expression and/or catalytic efficiencies; consequently, they have been implicated in the etiology of androgen-dependent diseases. We supposed that changes in the coding genes for the aforesaid proteins could act in modulating the nonclassical phenotype. Objectives: To compare the nCAG of AR gene and polymorphisms of CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19, and CYP17A1, SRD5A2 and POR genes with the age of onset of symptoms, Ferriman score of hirsutism at diagnosis, presence of virilization, basal testosterone levels, as well as with the absence or the presence of symptoms. Patients: We selected 122 patients with basal or post-ACTH 17-OHP 10 ng/mL. All patients had confirmed nonclassical molecular diagnoses. Patients were divided according to the impairment of 21-OH activity predicted by genotype groups into A/C (severe) and C/C (moderate). Patients were also classified according to the onset of manifestations into pediatric and adult groups, younger than or older than 12 years, respectively. Methods: DNA was extracted from peripheral leukocytes. CAG repeat regions were PCR amplified, products submitted to capillary electrophoresis and analyzed by GeneScan software. DNA samples from CAG heterozygous patients were digested with the Hpa II enzyme and also submitted to PCR, in order to determine X-chromosome inactivation pattern. The CYP3A5, CYP3A4, CYP3A7, CYP17A1, CYP2C19, POR and SRD5A2 genes were PCR amplified and submitted to sequencing or enzymatic assays to screen the allelic variants. The results were compared with their wild sequences in the GenBank. Statistical comparisons employed Student\'s t tests, ANOVA, Wilcoxon rank-sun, Kruskal Wallis rank and linear regression. Results: We observed a significantly lower frequency of longer CAG alleles (> 26 repeats) of AR in the pediatric group compared to the adults carrying the 21-OH genotype from group C/C (p = 0.01). Additionally, the weighted biallelic mean of the CAG tract was considerably lower in patients with clitoromegaly (19.1 ± 2.7) in comparison to patients without it (21.6 ± 2.5), a correlation that was independent of the 21-OH genotype severity. The median of testosterone levels was significantly higher in the CYP17A1*A2 carriers (145.7 ng/dL, 126-153) compared to the ones carrying the wild allele (57 ng/dL, 36-87), from the group A/C of 21-OH genotype. The other variants did not show a correlation with clinical and hormonal phenotypes. Conclusions: We observed that the CAG tract was effective in modulating the phenotype of virilization in nonclassical women as well as influenced the period of onset of manifestations of patients carrying moderate CYP21A2 genotype. Considering the remaining allelic variants, which alter the androgen synthesis or metabolism, we identified the association of CYP17A1*A2 alleles with higher testosterone levels. Although we evaluated a significant number of patients with 21-OHD, we cannot rule out a sample size effect.

A Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma proteína que reconhece carboidratos na superfície microbiana levando à ativação do sistema complemento. Este processo é mediado por Serino Proteases tal como a MASP-2. O complexo MBL/MASP-2 é responsável pela formação da C3 convertase C4bC2b. Os níveis séricos de MBL e a MASP-2 (genes MBL2 e MASP-2, respectivamente) são geneticamente determinados, e podem ser influenciados pela presença de polimorfismos em um único nucleotídeo SNPs em genes codificadores destas proteínas. OBJETIVO: Determinar os níveis séricos e polimorfismos gênicos da MBL e MASP-2 em uma amostra da população brasileira. MÉTODOS: 294 amostras de doadores de sangue [mediana = 36,51 ± 10,56; 18-63 anos; 91/294 (30,95%) sexo feminino, 203/294 (69,05%) sexo masculino] foram genotipadas para os SNPs do éxon 1 (MBL2): SNPs localizados nos códons 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) e 57 (GlyGlu) e SNP Asp371Tyr (D371Y, A>C ) do gene da MASP-2 (éxon 9). Foi utilizado o ensaio de temperatura de dissociação para éxon 1 (MBL2) e sequenciamento direto dos promoters (H/L, X/Y e P/Q, nas posições -550, -221 e +4, respectivamente). A combinação das variantes do éxon 1 MBL2 foram agrupadas e denominadas alelo O e o genótipo selvagem foi denominado A. O éxon 9 da MASP-2 foi genotipado através da plataforma TaqMan. RESULTADOS: MBL2: 58,5% A/A, 36,39% A/O e 5,1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplótipos encontrados: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA e 4% HYPO. Quanto à produção, 56,12% produziram altos níveis de MBL, 30,61% níveis médios e 13,27% níveis baixos ou insuficientes de MBL. Para MASP-2: 38,78% A/A, 44,56% A/C e 16,67% C/C. CONCLUSÃO: A prevalência (5,1%) SNP O/O do éxon 1 (MBL2) está de acordo com a literatura brasileira, é semelhante à européia (4%) e japonesa (5%), menor que a africana (10-14%). Níveis séricos de MBL corresponderam aos genótipos determinados. Esta é a primeira avaliação da frequência do SNP D371Y do gene MASP-2 em uma população brasileira. Os resultados deste trabalho fornecem subsídios para estudos sobre repercussão de MBL e MASP-2 em situações clínicas / BACKGROUND: Mannose-binding lectin (MBL) is a protein that recognizes carbohydrates on microbial surface leading to complement activation. This process is mediated by MBL-associated serine proteases, such as MASP-2. MBL/MASP-2 complex is responsible for generating the C3 convertase C4bC2b. Both MBL and MASP-2 levels are genetically determined, and can be influenced by the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes encoding for these proteins (namely MBL2 and MASP-2). OBJTECTIVE: to determine MBL and MASP-2 serum levels and the frequencies of MBL2 and MASP-2 gene polymorphisms in a Brazilian population sample. METHODS: 294 blood donor samples [median age = 36.51 ± 10.56 years, range 18-63, 91/294 (31%) females and 203/294 (69%) males] were genotyped for MBL2 exon 1 SNPs: single point mutation in codon 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) and 57 (GlyGlu), and MASP-2 polymorphism Asp371Tyr (D371Y, A>C) (exon 9). A melting temperature assay was used to perform the genotyping of MBL2 SNPs. The combination of variants of MBL2 were grouped together as allele O, wild types were indicated as A. Exon 1 promoters were evaluated by direct genotype sequencing- alleles H/L, X/Y and P/Q (positions -550, -221 and +4, respectively). MASP-2 exon 9 genotyping was performed by using TaqMan pre-developed assay. RESULTS: MBL2: 58.5% A/A, 36.39% A/O, 5.1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplotypes: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA and 4% HYPO. MASP-2: 38.78% A/A, 44.56% A/C and 16.67% C/C. CONCLUSION: The prevalence (5.1%) of O/O genotype of MBL2 exon 1 SNPs in our population is in accordance with Brazilian reports, similar to European (4%) and Japanese (5%); lower than Africans (10-14%). There is a correlation between MBL serum levels and genotyping. Moreover, this is the first report of D371Y MASP-2 polymorphism frequency in a Brazilian population. Our data may contribute to new insights on the role of MBL and MASP-2 in clinical conditions

A hepatite auto-imune (HAI) é uma doença inflamatória crônica do fígado, de etiologia desconhecida, que acomete preferencialmente mulheres, com destruição progressiva do parênquima hepático e que, sem tratamento imunossupressor, evolui freqüentemente para cirrose. É uma doença rara na infância, com menos de 10% dos pacientes com doença hepática crônica, porém de alta mortalidade. Caracteriza-se pela presença de hipergamaglobulinemia, auto-anticorpos não órgãos-específicos e infiltrado inflamatório portal linfoplasmocitário. Cerca da metade dos pacientes atendidos no Instituto da Criança, apresenta também níveis elevados de IgE, sem causas aparentes como parasitoses ou atopia. A suscetibilidade genética à doença está principalmente associada a genes que codificam as moléculas de histocompatibilidade (HLA). A presença do HLA-DR é importante, mas não suficiente para o desenvolvimento dessa doença rara, fazendo inclusive supor um forte componente externo/ambiental no desencadeamento da doença. Genes recém descritos, localizados na região de classe III do Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) e ligados ao controle da resposta imune, em especial, alguns próximos à junção com a região de classe I, têm sido investigados como \"loci\" secundários para o desenvolvimento de doenças auto-imunes. A forte associação da HAI com genes na região do MHC, bastante comuns na população, aliada a incidência muito baixa da doença, leva à questão da presença de genes adicionais de suscetibilidade, que, junto com o HLA-DR, seriam responsáveis pela suscetibilidade genética observada. Dessa forma, o HLADRB1* 13, além de um fator por si, também pode ser um marcador da região cromossômica, ou seja, de um haplótipo específico e que, portanto, carrega mais de um gene de suscetibilidade. Estudamos polimorfismos, tipo SNP, de xx genes próximos ao HLA-DRB1, como TNFA, LTA, NFKBIL1 e BAT1, buscando haplótipos de susceptibilidade à doença, em pacientes HAI-1 (n=105) e controles sadios (n=227). O haplótipo ancestral 8.1 que inclui HLA-DRB1*03 e o alelo raro na posição -308 do gene TNFA estava aumentado (p=0.0005). Já o alelo HLA-DRB1*13, presente na maioria dos pacientes, não mostrou haplótipo específico associado. Também avaliamos genes de citocinas envolvidas na produção de IgE, elevado em parte dos pacientes HAI-1. Na comparação com controles, a freqüência dos SNPs IL- 4+33 e IL13+110, localizados em genes vizinhos, apresentou aumento estatisticamente significante nos pacientes, sugerindo haver um grupo gênico adicional no cromossomo 5q31 envolvido na susceptibilidade à HAI / Autoimmune hepatitis (AIH) is an inflammatory chronic liver disease of unknown etiology found predominantly in females, leading when untreated, to cirrhosis. It is a rare disease in the childhood, corresponding to about 10% of patients with chronic hepatitis, but exhibits high mortality. It is characterized by hipergammaglobulinemia, organ nonspecific circulating autoantibodies, and an inflammatory liver-infiltrating lymphocytes and plasma cells. Almost half of patients investigated at Instituto da Criança had increased plasma IgE levels, without any apparent cause such as parasite infestation or atopy. Genetic predisposition to AIH has been mainly linked to genes coding for HLA class II molecules. HLA-DR is important but not sufficient to explain this rare disease, suggesting there is an external/environmental component triggering the disease. Recently, several genes in the class III region of MHC, linked to immune responses, especially near the junction with the MHC class I region have been investigated as secondary loci for autoimmune disease susceptibility. The strong association of AIH with genes in the MHC region, common in the population, but a disease with the very low incidence, suggests additional genes linked with HLA-DR could add to the disease susceptibility. So, HLA-DR*13 besides being a factor by itself, could also be a chromosomal region marker, taking part of a specific haplotype carrying more than one susceptibility gene. We studied single nucleotide polymorphisms (SNP) in genes near HLA-DRB1, like TNFA, LTA, NFKBIL1 and BAT1 searching for disease susceptibility haplotypes, in HAI-1 patients (n=105) compared to healthy controls (n=227). The ancestral haplotype 8.1, which includes HLA-DRB1*03 and the rare TNFA allele at position -308 was increased (p=0.0005). However, HLA-DRB1*13, though present in the majority of the patients, did not show any specific haplotype associated to it. xxii We also analyzed cytokine genes involved in IgE production, which is increased in a part of the AIH type 1 patients. In comparison with controls, the frequency of the SNPs IL-4+33 and IL13+110 was significantly increased, suggesting the existence of an additional gene cluster in chromosome 5q31 involved in the susceptibility to AIH

-- Thèse fournie sans page de titre --Afin de mieux comprendre la physiopathologie des causes gastriques de malabsorption de la vitamine B12, nous nous sommes intéressés au déficit congénital en facteur intrinsèque, une maladie rare caractérisée par une diminution de la sécrétion de facteur intrinsèque (FI) fonctionnel dans le suc gastrique. Dans cette étude, nous rapportons cinq cas porteurs hétérozygotes du variant GIF c.290T>C (p.M97T) et deux cas porteurs hétérozygotes du variant GIF c.435_437delGAA (p.K145_N146delinsN). L'étude fonctionnelle des FI recombinants mutés produits par mutagenèse dirigée a mis en évidence une diminution de l'affinité du FI p.K145_N146delinsN pour la vitamine B12 n'expliquant toutefois pas totalement le phénotype observé chez les sujets. Par ailleurs, une association a été récemment décrite entre le polymorphisme rs601338, c.461 G>A du gène FUT2, codant pour une [alpha]1,2-fucosyltransférase, et les taux plasmatiques de vitamine B12. Afin de compléter notre étude, nous avons évalué l'influence du polymorphisme FUT2 c.461 G>A sur les taux de vitamine B12, de folates et d'homocystéine dans les populations Européennes et Africaines chez 1466 sujets. Notre étude démontre un effet du polymorphisme FUT2 c.461 G>A sur les taux plasmatiques de vitamine B12 et de folates indépendamment de l'âge, du sexe et de l'origine géographique. En conclusion, nos résultats démontrent que le gène du FI (GIF) n'est pas le seul gène impliqué dans la physiopathologie du déficit congénital en facteur intrinsèque. L'étude des malabsorptions d'origine gastrique de la vitamine B12 passe par une approche polygénique dans laquelle le gène FUT2 occupe une place importante / There are multiple causes of gastric vitamin B12 malabsorption. To get a better understanding of their physiopathology, we are interested in inherited gastric intrinsic factor (GIF) deficiency, a vitamin B12 absorption defect characterized by GIF impaired activity. In this study, we report five cases heterozygous carriers of the variant GIF c.290T>C (p.M97T) and two cases heterozygous carriers of the variant GIF c.435_437delGAA (p.K145_N146delinsN). The study of recombinant mutated GIF produced by site-directed mutagenesis evidenced a reduced affinity for vitamin B12 in the case of GIF p.K145_N146delinsN which does not explain fully the phenotypes observed in our subjects. Recently, an association was described between the FUT2 polymorphism rs601338, c.461 G>A, coding for a fucosyltransferase, and plasma levels of vitamin B12. To complete our study, we assessed the influence of FUT2 c.461 G>A polymorphism on vitamin B12, folate and homocysteine in European and African populations in 1466 subjects. Our study demonstrate a clear effect of FUT2 c.461 G>A polymorphism on both plasma levels of vitamin B12 and folate, regardless of age, gender, and geographic origin. In conclusion, our results demonstrate the GIF gene is not the only gene involved in the physiopathology of inherited GIF deficiency. It is necessary to study the gastric causes of vitamin B12 malabsorption through a polygenic approach, in which the FUT2 gene is an important element