A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p ≤0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p≤0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

Os Influenzavirus podem ser classificados de acordo com suas glicoproteínas externas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA), ambas apresentando alta variabilidade genética e antigênica. No presente estudo foi realizada análise molecular do gene HA, do vírus influenza A (IA) em amostras colhidas de crianças e lactentes com sintomatologia respiratória atendidas no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (USP), durante os anos de 1995 a 2006. Um total de 3.009 amostras foram analisadas por duplex RT-PCR e 4,38% (n=132) foram positivas, sendo 12,1% (n=16) Influenza B e 87,9% (n=116) IA, das quais 9% (n=9) eram H1N1, 91% (n=91) eram H3N2 e 13,8% (n=16) não foram subtipadas. A região HA1 do gene HA de 39 amostras foi sequenciada e as sequências comparadas com as cepas vacinais e circulantes dos respectivos anos. A região de ligação ao receptor foi conservada em todas as amostras e foram verificadas alterações de aminoácidos principalmente nos sítios antigênicos e arredores. No geral, as cepas vacinais foram compatíveis com as circulantes em São Paulo. / The Influenzavirus can be classified according to their external glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), both showing high genetic and antigenic variability. In the present study was carried out molecular analysis of the HA gene of influenza A (IA) in samples harvested from children and infants, with respiratory symptoms attended at University Hospital, University of Sao Paulo (USP), during the years 1995 to 2006. A total of 3,009 samples were analyzed by duplex RT-PCR and 4.38% (n = 132) were positive, being 12.1% (n = 16) Influenza B and 87.9% (n = 116) IA, where which 9% (n = 9) were H1N1 and 91% (n = 91) were H3N2 and 13.8% (n = 16) did not subtyped. The HA1 region of HA gene of 39 samples were sequenced and the sequences compared with vaccine strains and circulating strains in those years. The receptor-binding region was conserved in all samples and aminoacid changes were observed mainly in the antigenic sites and surroundings. Overall, the vaccine strains were consistent with those circulating in Sao Paulo.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roberto Alexandre.pdf: 1763581 bytes, checksum: c0c0eb448d286d60be56fecd5eb291e0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Human papillomavirus is responsible for lesions in the oral mucosa, anal and urogenital tract of male and female, transmitted by direct or indirect contact with infected skin or through sexual intercourse. In women these infections can progress to cervical cancer, which is estimated incidence for the Northern region in 2010 was the largest in Brazil. The nature of the infection depends on the degree of integration of viral DNA with host DNA linked primarily to genes of oncoproteins E6 and E7 of HPV. The determination of the viral types can be held from differences in the viral capsid L1 gene and the variants of a particular type of HPV can be identified through the study of viral non-coding region. Currently the development of prophylactic vaccines against HPV particles using "pseudo-viral" formed by the L1 protein of different subtypes of high risk, while a growing number of studies that use the oncoproteins E6 and E7 in the development of therapeutic vaccines. However, it is necessary for the development of such antiviral vaccines also consider the great diversity of variants of HPV types exist, since differences between the genomic regions of these variants may influence the degree of their infections. This paper describes the complete genome sequence of a variant of HPV 16, detected in Amazonian region, using techniques of genetic engineering and the analysis of this genome by bioinformatics tools. It was observed by analysis of genetic distance that the genome of this variant has a genetic proximity of those identified in the literature as "African variants, and phylogenetic analysis, performed from the non-coding region, support this hypothesis. In addition, several mutations were detected in the genome and obtained, resulting in changes in the positions and number of restriction sites in its sequence. The major differences between the genetic regions of the genome sequenced and the corresponding variants in Africa have been observed over E7. It is expected, with that work, look for future research projects involving protein expression and genomic analysis of HPV in the Amazon region to the regional peculiarities in variants and provide a concise and complete reference on the genome of HPV 16 in the region. / O Papillomavirus Humano é responsável por lesões na mucosa oral, anal e do trato urogenital masculino e feminino, transmitidas por contato direto ou indireto com a pele infectada ou através de relações sexuais. Na mulher essas infecções podem evoluir para um câncer de colo do útero, cuja estimativa de incidência para a região Norte no ano de 2010 foi a maior do Brasil. A natureza das infecções depende do grau de integração do DNA viral com o DNA do hospedeiro associada, principalmente, aos genes das oncoproteínas E6 e E7 do HPV. A determinação dos tipos virais pode ser realizada a partir de diferenças no gene L1 do capsídeo viral e as variantes de um determinado tipo de HPV podem ser identificadas por meio do estudo da Região Não Codificadora viral. Atualmente o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra o HPV utiliza partículas pseudo-virais formadas pela proteína L1 de tipos virais de alto risco, enquanto cresce o número de estudos que utilizam as oncoproteínas E6 e E7 no desenvolvimento de vacinas terapêuticas. Contudo, é necessário que o desenvolvimento de tais vacinas antivirais também considere a grande diversidade das variantes dos tipos de HPV existentes, uma vez que diferenças entre as regiões genômicas dessas variantes podem influenciar o grau de suas infecções. Este trabalho descreve o sequenciamento completo do genoma de uma variante do HPV 16, detectado no Estado do Amazonas, utilizando técnicas de Engenharia Genética, bem como a análise desse genoma por ferramentas de Bioinformática. Observou-se, pela análise de distâncias genéticas, que o genoma dessa variante apresenta grande proximidade genética dos exemplares identificados na literatura como variantes africanas , e as análises filogenéticas, realizadas a partir da Região Não Codificadora, reforçam essa hipótese. Além disso, também foram detectadas várias mutações ao longo do genoma obtido, resultando em alterações nas posições e na quantidade de sítios de restrição de sua sequência. As maiores diferenças entre as regiões gênicas do genoma sequenciado e as correspondentes nas variantes africanas foram observadas ao longo de E7. Espera-se, com esse trabalho, atentar os futuros projetos de pesquisa que envolvam expressão de proteínas e análises genômicas de HPV na região amazônica para as peculiaridades existentes nas variantes regionais e fornecer uma referência concisa e completa sobre o genoma do HPV 16 na região.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-07-19T15:40:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AutoassemblydSoftwareSubimissao.pdf: 2984364 bytes, checksum: 513e9d5eee40bbdd016076fd6635f412 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-07-21T12:42:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AutoassemblydSoftwareSubimissao.pdf: 2984364 bytes, checksum: 513e9d5eee40bbdd016076fd6635f412 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T12:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AutoassemblydSoftwareSubimissao.pdf: 2984364 bytes, checksum: 513e9d5eee40bbdd016076fd6635f412 (MD5) Previous issue date: 2014-01-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As tecnologias de sequenciamento de segunda geração proporcionaram um grande avanço dos estudos genômicos, tornando sua utilização um marco que revolucionou a biologia. Estas plataformas são caracterizadas pela redução no tempo de sequenciamento, alta produção de dados e baixo custo por base sequenciada, contudo, estes equipamentos em sua maioria produzem dados compostos por leituras curtas o que representa um grande desafio para reconstrução do genoma, devido a essa nova característica das leituras ferramentas computacionais tiveram que ser desenvolvidas para realizar a tarefa de montagem exemplo delas temos Velvet, Allpaths, ABySS, SOAPdenovo2, Edena. No entanto, a maioria destes aplicativos são executados através de linhas de comandos extensas compostas por vários parâmetros e devem obedecer a uma sintaxe adequada a sua utilização, pois em caso de erros existe a possibilidade de não obtenção do melhor resultado, com o intuito de resolver este problema apresentamos o AutoAssemblyD, que além de proporcionar a utilização destes montadores através de uma interface gráfica também possibilita a gerência destas execuções de forma remota. / Technologies for second-generation sequencing provided a major breakthrough of the genome, making its use a landmark that has revolutionized biology. These platforms are characterized by a reduction in sequencing time, high data production and low cost per base sequenced, however, these devices produce data mostly consist of short readings which represents a major challenge for reconstruction of the genome due to this new feature readings of computational tools had to be developed to accomplish the task of assembling their example we Velvet, AllPaths, Abyss, SOAPdenovo2, Edena. However, most of these applications are executed through command lines extended and composed of several parameters must follow the standard syntax to use, because in case of errors in the syntax is the possibility of not obtaining the best result, with the aim of solve this problem we present the AutoAssemblyD that besides providing the use of these assemblers through a graphical interface also enables the management of these executions remotely.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-12-19T17:43:43Z No. of bitstreams: 1 PhilippedeCastroLinsDissertacao2015.pdf: 2365075 bytes, checksum: c5628aa72f1ff54c00d7f8617a9d41dd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-19T17:43:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PhilippedeCastroLinsDissertacao2015.pdf: 2365075 bytes, checksum: c5628aa72f1ff54c00d7f8617a9d41dd (MD5) Previous issue date: 2015-04-10 / Gene promoters regulate gene expression quantitatively and qualitatively. The regulatory sequences have cis elements and with trans acting that will direct and correctly position the RNA polymerase which is the process of DNA transcription. Genetic engineering of plants by transforming plants expressing genes of interest, use in most studies, constitutive CaMV35S promoter character. A new promoter isolated from soybeans, which is called uceS8.3 showing a constitutive promoter driving expression in different plant tissues. The analysis of the expression of the uidA gene, GUS, demonstrated that the expression profile uceS8.3 controlled by the promoter is comparable or superior to the CaMV35S promoter in plant tissues such as flower buds and roots. Were identified following the uceS8.3 promoter cis regulatory elements that may be responsible for gene expression profile controlled by this promoter. Modules of this promoter, when compared with the CaMV35S promoter and the uceS8.3 itself demonstrated a difference in expression in plant tissues. Cis regulatory elements as ROOTMOTIFPABOX1, POLLEN1LELAT52, MRE, Sp1 and Ibox. The set of specific cis elements located in the promoter uceS8.3 modules may be the minimum necessary elements to control expression in leaf and flower bud tissues. The quantitative expression analysis and fluorometric GUS assays leaf and root tissues have demonstrated a correlation between transcript levels and the specific activity levels of a ??-glucuronidase enzyme in module 2 (720pb), but there is a difference in the balance of these levels between uceS8.3 promoter and Module 4 (170pb). The studies presented here demonstrated that the promoter and its modules has high ability to drive expression in flower tissues and roots, may be used and applied to different types of biotechnologically biotic stresses, including insect pests and nematodes. / Promotores g??nicos regulam a express??o de genes, quantitativamente e qualitativamente. As sequ??ncias regulat??rias possuem elementos cis e trans atuantes que v??o direcionar e posicionar corretamente a RNA polimerase para que haja o processo de transcri????o do DNA. A engenharia gen??tica de plantas, por meio da transforma????o de plantas, expressando genes de interesse, vem utilizando, na maioria dos estudos, o promotor CaMV35S de car??ter constitutivo. Um novo promotor isolado de soja, denominado uceS8.3 ?? tamb??m um promotor constitutivo demonstrando conduzir a express??o em diferentes tecidos vegetais. A an??lise da express??o do gene uidA, GUS, demonstrou que o perfil de express??o controlada pelo promotor uceS8.3 ?? compar??vel ou superior ao promotor CaMV35S em tecidos vegetais, como bot??o floral e raiz. Foram identificados, na sequ??ncia do promotor uceS8.3, elementos cis regulat??rios que podem ser respons??veis pelo perfil de express??o g??nica controlada por esse promotor. Os m??dulos desse promotor, quando comparados com o promotor CaMV35S, e o pr??prio uceS8.3 demonstraram uma diferen??a de express??o nos tecidos vegetais. Elementos cis regulat??rios como ROOTMOTIFPABOX1, POLLEN1LELAT52, MRE, Sp1 e I-box. O conjunto de elementos cis espec??ficos, localizados nos m??dulos do promotor uceS8.3, podem ser os elementos m??nimos necess??rios para controlar a express??o em tecidos de folha e bot??o floral. A an??lise de express??o quantitativa e de ensaios fluorim??tricos de GUS nos tecidos folha e raiz, demonstraram uma correla????o entre os n??veis de transcrito e os n??veis de atividade espec??fica da enzima ??-glucuronidase no m??dulo 2 (720pb), por??m h?? uma diferen??a na correla????o destes n??veis entre o promotor uceS8.3 e o m??dulo 4 (170pb). Os estudos aqui apresentados demonstraram que o promotor uceS8.3 e seus m??dulos possuem alta capacidade de conduzir express??o em tecidos florais e ra??zes, podendo ser utilizado e aplicado biotecnologicamente para diferentes tipos de estresses bi??ticos, incluindo insetos-praga e nemat??ides.

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Xylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica, responsável por doenças em diversas plantas de importância econômica. Diversas cepas têm sido estudadas, porém, pouco se sabe a respeito da resposta a estresses ambientais em X. fastidiosa. Utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA, verificou-se a resposta global aos estresses térmico, salino e osmótico em nível de transcrição. Os experimentos foram realizados em séries temporais, os perfis de expressão gênica dos genes diferencialmente expressos foram agrupados e validados por RT-PCR quantitativo. No choque térmico, 261 genes foram induzidos (9,7%) e 222 genes foram reprimidos (8,3%). Dentre os genes altamente induzidos, destacam-se os que codificam proteínas de choque térmico (Hsps), que previnem a desnaturação e a formação de agregados protéicos ou degradam polipeptídeos irreversivelmente desnaturados. A partir da determinação do início de transcrição de seis genes altamente induzidos no choque térmico, propôs-se um consenso para promotores dependentes do fator sigma alternativo que controla a resposta ao choque térmico, sigma32. Observou-se também a indução de genes relacionados ao estresse extracitoplasmático, que são regulados pelo fator sigma alternativo sigmaE. No choque osmótico e salino, os genes codificando a maioria das Hsps foram reprimidos na exposição prolongada a esses estresses, indicando que a resposta não é mediada por sigma32 ou sigmaE. Dos 142 genes induzidos tanto no estresse salino como osmótico, 57% codificam proteínas hipotéticas ou hipotéticas conservadas, indicando uma possível função na resposta a estes estresses. Observou-se a repressão de genes relacionados à síntese protéica e ao metabolismo intermediário nos três estresses analisados, além da indução de genes relacionados à virulência como toxinas e adesinas, revelando a complexa rede de genes envolvida na resposta a estresses ambientais. Para auxiliar a análise de dados de microarranjos de DNA, foram desenvolvidas três ferramentas de bioinformática: HTself, utilizada na determinação de genes diferencialmente expressos; BayGO, utilizada na análise categorias funcionais altamente representadas dentre os genes de interesse e SpotWhatR, uma plataforma que integra programas utilizados nas diversas etapas da análise e pré-processamento de dados de microarranjos, com uma interface de fácil utilização. Estas ferramentas foram utilizadas com sucesso e estão disponíveis livremente para outros pesquisadores. / Xylella fastidiosa is a phytopathogenic bacterium responsible for diseases in many economically important crops. Although different strains have been studied, little is known about X. fastidiosa stress responses. To investigate X. fastidiosa genes involved in heat, salt and osmotic shock responses, we performed a whole genome microarray analysis in time-course experiments. The expression profiles of the differentially expressed genes were grouped and their expression patterns were validated by quantitative RT-PCR experiments. During heat shock, 261 genes were induced (9.7%) and 222 genes were repressed (8.3%). Among the differentially expressed genes, the ones presenting the highest induction ratios encode heat shock proteins (Hsps), which prevents protein misfolding and aggregation or promote the degradation of the irreversibly denatured polypeptides. We determined the transcription start sites of six heat shock inducible genes and analyzed their promoter regions, which allowed us to propose a putative consensus for sigma32 promoters in X. fastidiosa. We also observed the induction of genes related to the extracytoplasmic stress response, that are regulated by the alternative sigma factor sigmaE. During prolongued exposure to salt and osmotic stress, genes encoding most of the Hsps were repressed, indicating that the response is not mediated by sigma32 or sigmaE. Among the 142 genes induced by both salt and osmotic stress, 57% encode hypothetical or conserved hypothetical proteins, indicating a possible role of these genes in the stress response. In addition, we observed the repression of genes related to protein biosynthesis and intermediary metabolism during the three stresses tested, besides the induction of genes related to virulence such as toxins and adhesins, revealing the complex network of genes that work together in response to environmental stresses. To facilitate the microarray data analysis process, we developed three bioinformatics tools: HTself, which is used to determine the differentially expressed genes; BayGO, which aims at finding over-represented gene categories and SpotWhatR, a system that integrates programs used in different steps of microarray data analysis in a user-friendly interface. These tools were successfully used and are freely available to the research community.

Exon shuffling foi primeiramente proposto por Walter Gilbert em 1978 como um mecanismo em que exons de diferentes genes podem ser combinados, levando à formação de novos genes. O mecanismo de exon shuffling é favorecido por recombinações intrônicas e está correlacionado com a simetria de exons. Evidências deste mecanismo provém de análises de combinações de fases de introns, correlações entre bordas de exons e de domínios protéicos e da recorrência de domínios em diversas proteínas. Dessa forma, a evolução de proteínas formadas por exon shuffling pode ser inferida considerando a organização exon-intron dos genes, o padrão de combinações de fases de introns e a organização de domínios nas proteínas. Neste sentido, regiões protéicas que possivelmente foram originadas por eventos de exon shuffling foram identificadas através de análises em larga escala em diferentes espécies eucarióticas. A estratégia foi baseada no alinhamento entre todas as proteínas anotadas de uma determinada espécie e a verificação da presença de introns e suas respectivas fases em torno das regiões alinhadas. Nós verificamos que eventos de exon shuffling em eucariotos antigos, de origem anterior aos Metazoa, são predominantemente simétricos 0-0, enquanto nos metazoários a predominância é de unidades simétricas 1-1. Esses dados confirmam idéias anteriores de que a transição para a multicelularidade animal foi marcada pelo embaralhamento extensivo de exons e domínios 1-1. O metazoário basal Trichoplax adhaerens pode ser considerado um representante desta transição, evidenciada pelas freqüências balanceadas de regiões simétricas 0-0 e 1-1. O sinal de flanqueamento por introns em torno das bordas de domínios protéicos confirmou os resultados obtidos através dos alinhamentos, com a prevalência de domínios 0-0 em não metazoários e 1-1 em metazaoários. Um agrupamento hierárquico de domínios flanqueados por introns foi construído, permitindo identificar domínios ou grupos de domínios com evidência de expansões em períodos específicos, como nos vertebrados. Por fim, os genes envolvidos em eventos de exon shuffling foram analisados quanto ao enriquecimento em termos do Gene Ontology. Os resultados indicaram que este mecanismo contribuiu significativamente para a formação de genes relacionados com uma grande diversidade de termos, alguns dos quais envolvidos diretamente com características de metazoários e vertebrados, tais como matriz extracelular, adesão, coagulação sangüínea, processos do sistema imune e sistema nervoso / Exon shuffling was first proposed by Walter Gilbert in 1979 as a mechanism in which exons from different genes could be combined to lead the creation of new genes. The mechanism of exon shuffling is favored by intronic recombinations and it is correlated with symmetry of exons. Evidence of this mechanism come from analyses of intron phase combinations, correlations between the borders of exons and domains and domain recurrence in several proteins. Taking this into account, the evolution of proteins formed by exon shuffling can be inferred regarding the exonintron organization of the genes, the pattern of intron phase combinations and the protein domain organization. In this sense, protein regions that were probably arose by exon shuffling events were identified through a large scale analysis in several eukaryotic species. The strategy was based on alignments between all annotated proteins from a given species. Then, the aligned regions were verified in respect with intron phase combinations surrounding them. We have found that exon shuffling events in early eukaryotes are preferentially symmetric of phase 0, while in metazoans, the preference is for 1-1 symmetric units. These data confirms previous ideas that the transition to animal multicellularity was marked by extensive 1-1 exon shuffling. The basal metazoan Trichoplax adhaerens is a representative of this transition, evidenced by the balanced frequencies of 0-0 and 1-1 symmetric regions. The signal of intron flanking around the borders of protein domains corroborated previous analyses, showing that non metazoans have higher frequencies of 0-0 domains and metazoans have higher frequencies of 1-1 domains. A hierarchical clustering of domains flanked by introns was built, allowing us to identify domains or groups of domains with evidence of expansions during specific periods, such as in vertebrates. Finally, genes involved in exon shuffling events were analyzed regarding the Gene Ontology enriched terms. The results indicated that this mechanism significantly contributed to the creation of genes related with a large diversity of terms, some of them are directly involved with features of metazoans and vertebrates, such as extracellular matrix, cell adhesion, blood coagulation and immune and nervous system processes

As micobactérias não tuberculosas (NTM) podem ser encontradas em diversos ambientes, como solo, sistemas aquáticos naturais, sistemas de abastecimento de água potável e também em eucariotos. As micobactérias de crescimento rápido são um subgrupo de NTM que têm prevalência significativa em infecções relacionadas a traumas cutâneos, procedimentos cirúrgicos vídeo-assistidos e em infecções pulmonares, sendo Mycobacterium abscessus a espécie mais relevante desse grupo. Durante um pseudo-surto de infecções pulmonares pós-broncoscopia, ocorrido na cidade de São Paulo em 2007, cepas de M. abscessus subsp. bolletii (\"M. massiliense\") pertencentes ao clone epidêmico BRA100 foram detectadas em amostras coletadas do único broncoscópio usado e em amostras de lavado broncoalveolar. Todas as cepas, com exceção da F1660, apresentaram tolerância ao glutaraldeído, uma característica marcante do clone BRA100. Foi realizado o sequenciamento completo do genoma utilizando-se o sistema Illumina com metodologia de pares casados e as sequências obtidas foram comparadas, com enfoque na análise de genes potencialmente envolvidos na tolerância ao glutaraldeído. Encontramos em ambas as cepas cromossomos com 4,6 Mpb, com 64% de conteúdo GC. As sequências de nucleotídeos possuem 99% de identidade entre si. Ambos os cromossomos possuem 4.616 sequências codificantes de proteínas. Elementos de profago, como proteínas de bacteriófagos, estão presentes nos cromossomos. Bem como diversos genes associados à resistência a antibióticos e biocidas. Foram localizados operons mce, associados com a capacidade de sobrevivência em amebas e invasão de macrófagos e componentes da família T7SS, relacionadas à virulência em diversas espécies de micobactérias, como M. tuberculosis e também à transferência genética horizontal em M. smegmatis. Adicionalmente, foi detectada em ambas as cepas uma estrutura extracromossômica circular, de 97 Kbp, com 62,7% de conteúdo GC e 121 sequências codificantes. Embora a maioria das proteínas preditas tenha função desconhecida, foi possível encontrar um bloco de genes que pertencem ao sistema de secreção do tipo sete (T7SS), similar ao encontrado em plasmídeos de micobactérias de crescimento lento, sugerindo a troca de material genético entre essas espécies. Apenas na cepa tolerante ao glutaraldeído - F1725 - foi detectado um plasmídeo do grupo IncP, designado pBRA100, que contém genes que codificam resistência à kanamicina, amônio quaternário, sulfonamidas e estreptomicina, e um novo gene fosI, descrito neste estudo, que confere resistência à fosfomicina. Não foram encontradas nos cromossomos diferenças que possam justificar a tolerância ao glutaraldeído. A diferença marcante entre os dois genomas é a presença do plasmídeo pBRA100 na cepa tolerante ao glutaraldeído / Non-tuberculous mycobacteria (NTM) can be found in diverse environments as soil, water plant, natural water systems as well as in Eukaryotes. Among the NTM group, rapid growth mycobacteria (RGM) have a substantial prevalence in infections following cutaneous trauma, lung infection and after video assisted surgeries. Mycobacterium abscessus is considered to be the most relevant pathogen pertaining to the RGM group. During a pseudooutbreak of lung infections occurred in the city of São Paulo in 2007, strains from M. abscessus subsp. bolletii (\"M. massiliense\") pertaining to the BRA100 clone were detected in samples from the biopsy channel of the only bronchoscope in use as well as from bronchoalveolar lavage. All the strains but F1660 exhibited tolerance to glutaraldehyde, which is a remarking characteristic of the BRA100 clone. We report here the complete genome sequences for the strains F1725 and F1660, respectively tolerant and susceptible to glutaraldehyde. The genomes of both strains consist of a 4.6 Mpb chromosome with 4,616 coding sequences and high GC content of 64%. The chromosomes encode diverse proteins related to antibiotic and biocide resistance. Operons involved in virulence, as mce, are present as well as components from T7SS family, related to virulence in Mycobacterium tuberculosis and in horizontal gene transfer in M. smegmatis. Both strains harbored a circular extra-chromosomal structure, with T7SS system elements related to those found in plasmids from slow growing mycobacteria. It is circular, has 97 kbp and 121 open reading frames. Additionally, only F1725 strain has an IncP multidrug resistant plasmid, named pBRA100. It confers resistance to kanamycin, quaternary ammonium, sulfamethoxazole and streptomycin and also has new fosfomycin resistance gene fos I. No differences were found in the chromosomes that could justify tolerance to glutaraldehyde. The remarkable difference between the two genomes is the presence of plasmid pBRA100 in the glutaraldehyde tolerant strain

Agente da clorose variegada dos Citrus (CVC) ou amarelinho, Xylella fastidiosa, uma bactéria gram-negativa limitada ao xilema, tem grande importância na agricultura do Estado de São Paulo. Identificada em 1987, na região de Bebedouro, a CVC já está presente em quase todas as áreas citrícolas do país, afetando a produção de frutos e seus derivados. O projeto genoma, criado pela FAPESP em 1997 com o apoio do FUNDECITRUS, habilitou laboratórios da capital e interior paulistas a seqüenciar o genoma deste fitopatógeno, contribuindo internacionalmente para a elucidação de sua completa informação genética. Nosso laboratório (QR) obteve aproximadamente 1.900 leituras de bibliotecas aleatórias de \"shotgun\". Seqüenciamos 13 cosmídeos perfazendo um total linear de 533.571 pares de bases. Anotamos 125 genes prováveis de cinco cosmídeos e realizamos a análise de uma categoria dos genes anotados, referente à biossíntese de pequenas moléculas, onde incluem-se a biossíntese de aminoácidos, purinas e pirimidinas, ácidos graxos, poliaminas, cofatores, grupos prostéticos e transportadores de elétrons. X. fastidiosa possui, mesmo que incompletas, as vias metabólicas para a produção de todos os aminoácidos, sendo provavelmente a glutamina, o principal meio para a obtenção de nitrogênio. Estão presentes as vias para a biossíntese de ribonucleotídeos de purina e pirimidina. X. fastidiosa parece conseguir elongar ácidos graxos a partir de acetil-CoA e é capaz de sintetizar uma grande variedade de cofatores e grupos prostéticos, entretanto, estão ausentes os genes envolvidos na biossíntese de biotina, cobalamina e enterobactina. / Abstract not available.