Apesar da grande melhora nos resultados de desenvolvimento embrionário in vitro, cerca de 40% dos oócitos bovinos fecundados não completam o desenvolvimento na fase de pré-implantação. Diversos fatores estão relacionados a este fenômeno, conhecido como bloqueio do desenvolvimento embrionário. Partindo da premissa que o bloqueio no desenvolvimento ocorre normalmente, durante a ativação do genoma embrionário, aproximadamente, no 4º ciclo celular em bovinos, formulou-se a hipótese de que os genes transcritos no momento da ativação do genoma embrionário estão relacionados ao bloqueio. Nesta tese, um sistema fluorescente de Differential Display PCR (DDPCR) foi desenvolvido para isolar e identificar fragmentos de mRNAs expressos diferencialmente entre embriões que se desenvolvem mais rápido e com melhor taxa de desenvolvimento e aqueles que apresentam desenvolvimento mais lento e com maior taxa de bloqueio. Dentre 176 fragmentos recuperados, 27 foram clonados, seqüenciados e 30 genes identificados. Dois genes, PI3K e ITM2B foram quantificados pela PCR em tempo real. Os resultados sugerem que duas diferentes ativações do genoma podem estar ocorrendo: o grupo de desenvolvimento rápido ativa genes ligados ao desenvolvimento embrionário e, o grupo lento ativa os genes ligados à sobrevivência ou morte celular. / The embryonic developmental block occurs at the 8-cell stage in bovine and is characterized for a lengthening of the cell cycle. At the same stage, also takes place the maternal-embryonic transition (i.e. the activation of the embryonic genome). These events are highly correlated and many genes are activated at the 4th cell cycle however, their functions are mostly unknown. The study of gene expression during this stage will help understand the mechanisms involved in the maternal-embryonic transition and ultimately lead to improvements of in vitro embryo production rates. The aim of this study was to identify genes differentially expressed between bovine embryos with or without developmental competence to reach the blastocyst stage, using Differential Display PCR methodology. Embryos with fast cleavage divisions showing 8 cells at 48 hpi and high potential of development (R8), and embryos with slow cleavage divisions showing 4 cells at 48hpi (L4) and 8 cells at 80 hpi (L8), both with reduced rates of development to blastocyst, were analyzed. We developed an alternative protocol for amplification and recovery of differentially expressed genes from extremely small initial amounts of RNA (10 to 25 pg of mRNA) from preimplantation bovine embryos without need of radio-isotopes. A total of 176 differentially expressed bands were recovered, 27 isolated-fragments were cloned and sequenced confirming the expected primer sequences and allowing the recognition identification of 30 gene transcripts related to bovine embryonic physiology. Two genes, PI3K and ITM2B were chosen for relative quantification of mRNA using Real-Time PCR. Results suggest two different embryonic genome activation mechanisms: fast-developing embryos activate genes related to embryonic development, and slow-developing embryos activate genes related to cellular survival and/or death.

Exon shuffling foi primeiramente proposto por Walter Gilbert em 1978 como um mecanismo em que exons de diferentes genes podem ser combinados, levando à formação de novos genes. O mecanismo de exon shuffling é favorecido por recombinações intrônicas e está correlacionado com a simetria de exons. Evidências deste mecanismo provém de análises de combinações de fases de introns, correlações entre bordas de exons e de domínios protéicos e da recorrência de domínios em diversas proteínas. Dessa forma, a evolução de proteínas formadas por exon shuffling pode ser inferida considerando a organização exon-intron dos genes, o padrão de combinações de fases de introns e a organização de domínios nas proteínas. Neste sentido, regiões protéicas que possivelmente foram originadas por eventos de exon shuffling foram identificadas através de análises em larga escala em diferentes espécies eucarióticas. A estratégia foi baseada no alinhamento entre todas as proteínas anotadas de uma determinada espécie e a verificação da presença de introns e suas respectivas fases em torno das regiões alinhadas. Nós verificamos que eventos de exon shuffling em eucariotos antigos, de origem anterior aos Metazoa, são predominantemente simétricos 0-0, enquanto nos metazoários a predominância é de unidades simétricas 1-1. Esses dados confirmam idéias anteriores de que a transição para a multicelularidade animal foi marcada pelo embaralhamento extensivo de exons e domínios 1-1. O metazoário basal Trichoplax adhaerens pode ser considerado um representante desta transição, evidenciada pelas freqüências balanceadas de regiões simétricas 0-0 e 1-1. O sinal de flanqueamento por introns em torno das bordas de domínios protéicos confirmou os resultados obtidos através dos alinhamentos, com a prevalência de domínios 0-0 em não metazoários e 1-1 em metazaoários. Um agrupamento hierárquico de domínios flanqueados por introns foi construído, permitindo identificar domínios ou grupos de domínios com evidência de expansões em períodos específicos, como nos vertebrados. Por fim, os genes envolvidos em eventos de exon shuffling foram analisados quanto ao enriquecimento em termos do Gene Ontology. Os resultados indicaram que este mecanismo contribuiu significativamente para a formação de genes relacionados com uma grande diversidade de termos, alguns dos quais envolvidos diretamente com características de metazoários e vertebrados, tais como matriz extracelular, adesão, coagulação sangüínea, processos do sistema imune e sistema nervoso / Exon shuffling was first proposed by Walter Gilbert in 1979 as a mechanism in which exons from different genes could be combined to lead the creation of new genes. The mechanism of exon shuffling is favored by intronic recombinations and it is correlated with symmetry of exons. Evidence of this mechanism come from analyses of intron phase combinations, correlations between the borders of exons and domains and domain recurrence in several proteins. Taking this into account, the evolution of proteins formed by exon shuffling can be inferred regarding the exonintron organization of the genes, the pattern of intron phase combinations and the protein domain organization. In this sense, protein regions that were probably arose by exon shuffling events were identified through a large scale analysis in several eukaryotic species. The strategy was based on alignments between all annotated proteins from a given species. Then, the aligned regions were verified in respect with intron phase combinations surrounding them. We have found that exon shuffling events in early eukaryotes are preferentially symmetric of phase 0, while in metazoans, the preference is for 1-1 symmetric units. These data confirms previous ideas that the transition to animal multicellularity was marked by extensive 1-1 exon shuffling. The basal metazoan Trichoplax adhaerens is a representative of this transition, evidenced by the balanced frequencies of 0-0 and 1-1 symmetric regions. The signal of intron flanking around the borders of protein domains corroborated previous analyses, showing that non metazoans have higher frequencies of 0-0 domains and metazoans have higher frequencies of 1-1 domains. A hierarchical clustering of domains flanked by introns was built, allowing us to identify domains or groups of domains with evidence of expansions during specific periods, such as in vertebrates. Finally, genes involved in exon shuffling events were analyzed regarding the Gene Ontology enriched terms. The results indicated that this mechanism significantly contributed to the creation of genes related with a large diversity of terms, some of them are directly involved with features of metazoans and vertebrates, such as extracellular matrix, cell adhesion, blood coagulation and immune and nervous system processes

Os marcadores microssatélites por serem de natureza codominante e multialélica tornam-se ideais para a caracterização, mapeamento e seleção assistida. Os locos microssatélites disponíveis têm sido utilizados efetivamente na caracterização de acessos de bananeira (Musa), porém muitos deles têm se mostrado com baixa eficiência de amplificação. Neste sentido, os objetivos deste trabalho foram: desenvolver novos locos de microssatélites, caracterizar 224 acessos de bananeira do banco de germoplasma da Embrapa em relação à ploidia e constituição genômica empregando abordagens moleculares e estabelecer relações genéticas entre eles. Foram desenvolvidos 50 novos locos de microssatélites dos quais 44 foram polimórficos entre os acessos analisados. Para a caracterização da ploidia dos acessos foi utilizado a citometria de fluxo, e para a definição da composição genômica foram empregados polimorfismo nos genes ribossomiais nucleares (rDNA) e 16 locos microssatélites, que também serviram para estabelecer as relações genéticas entre os acessos. Além disso, foram sequenciados regiões do rDNA de 17 acessos de bananeira para identificação de polimorfismo de base única (SNP) associados ao genoma A e B. A constituição genômica e/ou ploidia determinada por abordagens moleculares confirmou a classificação previamente estabelecida por descritores morfológicos, com exceção dos acessos Marmelo, Pitogo e Pisang Nangka. As regiões do rDNA sequenciadas permitiram identificar 17 SNPs específicos para M. balbisiana, que poderão ser utilizados para classificar acessos quanto a constituição genômica. A análise de agrupamento derivada da genotipagem dos acessos com 16 locos de microssatélites subdividiu os genótipos de acordo com a ploidia, constituição genômica e subgrupos de bananeira, enquanto que a abordagem empregando o modelo bayesiano corroborou de forma geral com essa categorização. Foi detectada uma ampla heterogeneidade nos acessos diplóides, onde poucos acessos triplóides tiveram sua ancestralidade definida nos grupos dos acessos diplóides. / Microsatellite markers are co-dominant and multiallelic, and the method of choice for genetic characterization, mapping, and assisted selection breeeding. Microsatellite loci have been effectively used to characterize banana (Musa) accessions, but in some cases they have shown low amplification efficiency. Thus, the objectives of this work were to develop new microsatellite loci; to characterize 224 accessions from the Embrapa germplasm collection of banana for ploidy and genomic constitution, as well as to establish genetic relationships among the accessions. Fifty new microsatellite loci were developed, from which 44 were polimorphic. Flow citometry was employed to characterize ploidy, while genomic constitution was determined by polymorphism at the nuclear ribosomal gene (rDNA) and 16 microsatellite loci, also used to establish the genetic relationship among the accessions. Additionally, rDNA regions were sequenced from 17 banana accessions to identify specific single nucleotide polymorphism (SNP) associated with the A or B genome. The genomic constitution and/or ploidy determined by various molecular approaches confirmed the previous classification established by morphological descriptors, except for Marmelo, Pitogo and Pisang Nangka. The sequenced rDNA regions allowed to identify 17 SNPs specific for M. balbisiana, which could be used to classify accessions according to genomic composition. Clustering analysis derived from accession genotyping using 16 microsatellite loci subdivided genotypes according to ploidy, genomic composition and banana subgroups, while the approach using a Bayesian model corroborated in general terms this categorization. A large heterogeneity of the diploid accessions was detected, which restrict the definition of ancestrality of triploid accessions in the diploid accession groups.

Xylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica, responsável por doenças em diversas plantas de importância econômica. Diversas cepas têm sido estudadas, porém, pouco se sabe a respeito da resposta a estresses ambientais em X. fastidiosa. Utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA, verificou-se a resposta global aos estresses térmico, salino e osmótico em nível de transcrição. Os experimentos foram realizados em séries temporais, os perfis de expressão gênica dos genes diferencialmente expressos foram agrupados e validados por RT-PCR quantitativo. No choque térmico, 261 genes foram induzidos (9,7%) e 222 genes foram reprimidos (8,3%). Dentre os genes altamente induzidos, destacam-se os que codificam proteínas de choque térmico (Hsps), que previnem a desnaturação e a formação de agregados protéicos ou degradam polipeptídeos irreversivelmente desnaturados. A partir da determinação do início de transcrição de seis genes altamente induzidos no choque térmico, propôs-se um consenso para promotores dependentes do fator sigma alternativo que controla a resposta ao choque térmico, sigma32. Observou-se também a indução de genes relacionados ao estresse extracitoplasmático, que são regulados pelo fator sigma alternativo sigmaE. No choque osmótico e salino, os genes codificando a maioria das Hsps foram reprimidos na exposição prolongada a esses estresses, indicando que a resposta não é mediada por sigma32 ou sigmaE. Dos 142 genes induzidos tanto no estresse salino como osmótico, 57% codificam proteínas hipotéticas ou hipotéticas conservadas, indicando uma possível função na resposta a estes estresses. Observou-se a repressão de genes relacionados à síntese protéica e ao metabolismo intermediário nos três estresses analisados, além da indução de genes relacionados à virulência como toxinas e adesinas, revelando a complexa rede de genes envolvida na resposta a estresses ambientais. Para auxiliar a análise de dados de microarranjos de DNA, foram desenvolvidas três ferramentas de bioinformática: HTself, utilizada na determinação de genes diferencialmente expressos; BayGO, utilizada na análise categorias funcionais altamente representadas dentre os genes de interesse e SpotWhatR, uma plataforma que integra programas utilizados nas diversas etapas da análise e pré-processamento de dados de microarranjos, com uma interface de fácil utilização. Estas ferramentas foram utilizadas com sucesso e estão disponíveis livremente para outros pesquisadores. / Xylella fastidiosa is a phytopathogenic bacterium responsible for diseases in many economically important crops. Although different strains have been studied, little is known about X. fastidiosa stress responses. To investigate X. fastidiosa genes involved in heat, salt and osmotic shock responses, we performed a whole genome microarray analysis in time-course experiments. The expression profiles of the differentially expressed genes were grouped and their expression patterns were validated by quantitative RT-PCR experiments. During heat shock, 261 genes were induced (9.7%) and 222 genes were repressed (8.3%). Among the differentially expressed genes, the ones presenting the highest induction ratios encode heat shock proteins (Hsps), which prevents protein misfolding and aggregation or promote the degradation of the irreversibly denatured polypeptides. We determined the transcription start sites of six heat shock inducible genes and analyzed their promoter regions, which allowed us to propose a putative consensus for sigma32 promoters in X. fastidiosa. We also observed the induction of genes related to the extracytoplasmic stress response, that are regulated by the alternative sigma factor sigmaE. During prolongued exposure to salt and osmotic stress, genes encoding most of the Hsps were repressed, indicating that the response is not mediated by sigma32 or sigmaE. Among the 142 genes induced by both salt and osmotic stress, 57% encode hypothetical or conserved hypothetical proteins, indicating a possible role of these genes in the stress response. In addition, we observed the repression of genes related to protein biosynthesis and intermediary metabolism during the three stresses tested, besides the induction of genes related to virulence such as toxins and adhesins, revealing the complex network of genes that work together in response to environmental stresses. To facilitate the microarray data analysis process, we developed three bioinformatics tools: HTself, which is used to determine the differentially expressed genes; BayGO, which aims at finding over-represented gene categories and SpotWhatR, a system that integrates programs used in different steps of microarray data analysis in a user-friendly interface. These tools were successfully used and are freely available to the research community.

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-01-23T17:15:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1818736 bytes, checksum: f0144bc2993d278c4694161930ed6b35 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T17:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1818736 bytes, checksum: f0144bc2993d278c4694161930ed6b35 (MD5) Previous issue date: 2016-10-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dentro da família Ixodidae, relatos recentes descreveram que o cruzamento de carrapatos de populações do táxon Amblyomma cajennense provenientes de diferentes regiões geográficas, apresentavam desempenho reprodutivo com taxa de fertilidade reduzida, podendo este táxon englobar um complexo de espécies diferentes, com subtipos determinados pela distribuição biogeográfica. Por estudos morfológicos, filogenéticos e de biogeografia, concluiu-se que este carrapato deveria ser diferenciado em seis clados definidos por regiões geográficas, todos pertencentes ao Complexo A. cajennense. Considerando este contexto, buscou-se neste estudo ampliar a base de conhecimentos acerca do genoma mitocondrial completo do carrapato Amblyomma sculptum, e diferenciá-lo do Amblyomma cajennense, ambos subtipos e pertencentes ao Complexo A. cajennense. Dentre os achados, destacam-se o gene ND5 e as regiões controle 1 e 2 com características que os credenciam a atuarem como marcadores moleculares evolutivos para a diferenciação destes dois subtipos de carrapatos. Análises comparativas futuras fazem-se necessárias com sequências mitogenômicas dos demais membros do Complexo A. cajennense. Na família Argasidae existem indivíduos que são morfologicamente de difícil identificação. Esta dificuldade ocorre tanto com espécimes adultos, quanto em estádios imaturos, constituindo assim, um importante obstáculo para o estabelecimento de arranjos taxonômicos mais precisos para esta família de carrapatos, sendo um ponto negativo para estudos filogenéticos e epidemiológicos. Desta forma, para o estudo referente à família Argasidae, realizou-se análises comparativa e filogenética do mitogenoma de Nothoaspis amazoniensis para com outros membros desta família, com o objetivo de promover uma melhor compreensão das inter- relações evolutivas entre os carrapatos argasídeos. Como conclusão, evidenciou-se que a abordagem filogenômica posicionou o mitogenoma de N. amazoniensis em um clado monofilético característico do arranjo taxonômico Cladísta, englobado por representantes das regiões Afrotropical e Neotropical, com parasitismo específico em morcegos, o que pode ser um indicativo de um processo evolutivo de coevolução entre vetor e seu hospedeiro. Paralelamente, também se investigou para o N. amazoniensis, a interação parasita-hospedeiro baseando-se na presença de material genético proveniente da ação hematófaga realizado por este argasídeo em seus hospedeiros. O mitogenoma completo referente ao hospedeiro de N. amazoniensis foi sequenciado, montado e anotado, caracterizando-o como oriundo de animal membro da ordem Chiroptera. Por análise filogenética comparando esta sequência contra outras de representantes da Ordem Chiroptera, depositadas em bancos de dados biológicos, obteve-se a identificação desta em nível de gênero, denominando-a como Pteronotus sp. PV-RO-BRA. Considerando os dados referentes à coleta do argasídeo N. amazoniensis, e aos resultados apresentados para este morcego, neste estudo, conclui-se que o N. amazoniensis apresenta uma dependência evolutiva, não somente ao seu provável hospedeiro do gênero Pteronotus, mas de uma forma geral, ao conjunto de condições específicas ecológicas bióticas e abióticas encontradas em seu ecossistema. No atual estudo, a abordagem filogenômica e o estabelecimento de genomas mitocondriais completos, como estratégias moleculares, foram de fundamental importância na inferência filogenética de carrapatos pertencentes às famílias Ixodidae e Argasidae, como também, no estudo sobre a associação evolutiva entre o N. amazoniensis, seu hospedeiro e o ecossistema habitado. / Within the Ixodidae family, recent reports have described that the crossing of populations of ticks Amblyomma cajennense taxon from different geographical regions, had reproductive performance with reduced fertility rate, which taxon may comprise a complex of different species, with subtypes determined by biogeographical distribution. Per morphologic, phylogenetic and biogeography studies have concluded that this tick should be differentiated into six clades defined by geographic regions, all belonging to the compound A. cajennense. In this context, this study targeted to expand the knowledge base about the complete mitochondrial genome of the tick Amblyomma sculptum, and differentiate it from Amblyomma cajennense, both subtypes and belonging to Complex A. cajennense. Among the findings, we can highlight the ND5 gene and control regions 1 and 2 which characteristics qualify them to act as evolutionary molecular markers for differentiation of these two subtypes of ticks. In the future is necessary more comparative analyzes with mitogenomics sequences of other members of the complex A. cajennense. In Argasidae family there are individuals who are morphologically difficult to identify. This difficulty occur in both, adult specimens and immature stages, then creating a major obstacle to the establishment of more precise taxonomic arrangements for this family of ticks, with a negative point for phylogenetic and epidemiological studies. Therefore, in the study relating to Argasidae family, it was carried comparative and phylogenetic analyzes of mitogenome of Nothoaspis amazoniensis to other members of this family, targeting a better understanding of the evolutionary interrelationships between ticks argasids. In conclusion, it was shown that the phylogenomic approach placed the mitogenome N. amazoniensis in a monophyletic clade typical of a taxonomic arrangement Cladist comprised by representatives of Afrotropical and Neotropical regions, with specific parasitism in bats, which may indicate an evolutionary process of coevolution between vector and its host. At the same time, it was also investigated for N. amazoniensis, the parasite-host interaction taking in account the presence of genetic material from hematophagous action performed by this argasid in their hosts. The complete mitogenome referring to the host of N. amazoniensis was sequenced, assembled and annotated, characterizing it as originated from an animal member of the order Chiroptera. Through phylogenetic analysis, comparing this sequence against other sequences of representatives of Chiroptera order, placed in biological databases, it was obtained an identification of this sequence in the genus level, terming it as Pteronotus sp. PV-RO-BRA. Considering the data regarding the collection of argasid N. amazoniensis, and the results presented for this bat in this study it was concluded that N. amazoniensis presents an evolutionary dependence, not only to the probable host Pteronotus gender, but in general, to the set of ecological specific conditions, biotic and abiotic, found in its ecosystem. In the current study, the phylogenomic approach and the establishment of complete mitochondrial genomes, as molecular strategies, have been of fundamental importance in the phylogenetic inference of ticks belonging to the Ixodidae and Argasidae families, as well as in the study of the evolutionary association between N. amazoniensis, its host and the ecosystem inhabited.

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Marilia de Freitas Calmon / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Resumo: No Brasil, a presença de ecossistemas com uma grande riqueza e diversidade de animais e cidades grandes e densamente povoadas oferece condições para a ocorrência de diversas arboviroses. Vários arbovírus transmitidos por mosquitos do gênero Culex pertencem ao gênero Flavivirus. Vírus desse gênero são conhecidos por causar doenças em humanos e animais, no entanto, flavivírus que não infectam ou causam doença em vertebrados, replicando somente em artrópodes têm sido descritos. O vírus Culex flavivirus é um exemplo. Ele foi isolado de espécies de mosquitos do gênero Culex na América do Norte, América Central, América do Sul, África e Ásia. Apesar dos estudos realizados em outras partes do mundo, no Brasil há ainda pouca informação sobre esse vírus. Nesse trabalho, realizamos o seqüenciamento do genoma completo do vírus Culex flavivirus (CxFV) isolado de mosquitos Culex de São José do Rio Preto (SP), por meio das técnicas de RT-PCR e seqüenciamento nucleotídico. O genoma viral do isolado CxFV_RPBR07_2007, o qual foi obtido no presente estudo apresentou 10.706 nucleotídeos com uma ORF de 10.092 nucleotídeos (3.364 aminoácidos) flanqueada por uma 5'UTR de 32 nucleotídeos e uma 3'UTR de 582 nucleotídeos. Análises filogenéticas revelaram que o CxFV_RPBR07_2007 agrupa-se com outros flavivírus de insetos, como o Cell fusing agent virus (CFAV) e o Kamiti River virus (KRV), e relaciona-se intimamente com isolados de CxFV do México (América Latina) e de Uganda (África); mantendo relação também com isolados dos Estados Unidos (América do Norte) e do Japão (Ásia). Esses agrupamentos foram também observados em outros estudos filogenéticos / Abstract: In Brazil, the presence of ecosystems with a wealth and diversity of animals, and cities large and densely populated offers conditions for the occurrence of many arboviruses. Several arboviruses transmitted by mosquitoes of the genus Culex belong to the genus Flavivirus. Viruses of this genus are known to cause disease in humans and animals, however, flaviviruses do not infect or cause disease in vertebrates, replicating only in arthropods have been described. Culex flavivirus virus is an example. He was isolated from species of mosquitoes of the genus Culex in North America, Central America, South America, Africa and Asia. Although studies conducted in other parts of the world, in Brazil there is still little information about this virus. In this work we performed the sequencing of the complete genome of Culex flavivirus virus (CxFV) isolated from Culex mosquitoes in São José do Rio Preto (SP) using the techniques of RT-PCR and nucleotide sequencing. The viral genome of the isolated (CxFV_RPBR07_2007) obtained in the present study presented 10.706 nucleotides with an ORF of 10.092 nucleotides (3.364 amino acids) flanked by a 5'UTR of 32 nucleotides and a 3'UTR of 582 nucleotides. Phylogenetic analyzes revealed that the CxFV_RPBR07_2007 groups with other insect flaviviruses such as the Cell fusing agent virus (CFAV) and Kamiti River virus (KRV), and is closely related to CxFV isolates from Mexico (Latin America) and Uganda (Africa); also maintaining relationship with isolates from the United States of America (North America) and Japan (Asia). These groupings were also observed in other phylogenetic studies / Mestre

[ES] En esta tesis, se realizaron análisis genómicos, metagenómicos y metabolómicos en líneas de conejo seleccionadas de forma divergente para alta y baja VE del tamaño de la camada (TC). Estos animales mostraron diferencias en su potencial de resiliencia. Por ello, estas poblaciones divergentes son un excelente material biológico para estudiar la resiliencia animal a través de la VE. Se realizaron estudios de asociación del genoma (GWAS) utilizando la regresión de un solo marcador y la regresión bayesiana de múltiples marcadores. Cuatro regiones genómicas se asociaron con la VE en el cromosoma 3 de Oryctolagus cuniculus (OCU), OCU7, OCU10 y OCU14, explicando el 8,6% de la varianza genética total para la VE. Además, el estudio de huellas de selección (SS) identificó 134 regiones genómicas que podrían estar bajo selección para la VE. El solapamiento entre ambos estudios se identificó en el OCU3, donde también se encontraron mutaciones funcionales para los genes DOCK2, INSYN2B y FOXI1. Los genes candidatos de GWAS y SS fueron aquellos con mutaciones funcionales identificadas mediante el análisis de secuenciación del genoma completo (WGS) con pools de ADN. Los genes candidatos destacados mostraron funciones biológicas relacionadas con el desarrollo de estructuras sensoriales, la respuesta inmunitaria, la respuesta al estrés y el sistema nervioso. Todas ellas son funciones relevantes para modular la resiliencia de los animales. Por otra parte, los estudios metagenómicos y metabolómicos mostraron que la selección para la VE modificó el microbioma intestinal y la composición de su metaboloma. Las especies microbianas beneficiosas como Alistipes prutedinis, Alistipes shahii, Odoribacter splanchnicus y Limosilactobacillus fermentum eran más abundantes en la población resiliente. En cambio, las especies microbianas nocivas, como Acetatifactor muris y Eggerthella sp, fueron más abundantes en los animales no resistentes. Los genes relacionados con la formación de biofilms, el metabolismo de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y el metabolismo del glutamato también se expresaron de forma diferencial entre las poblaciones de conejos. Además, se identificaron 15 metabolitos intestinales como potenciales biomarcadores para discriminar y predecir adecuadamente entre las poblaciones de conejos resistentes y no resistentes. Cinco de ellos, el equol, el 3-(4-hidroxifenil)lactato, el 5-aminovalerato, la N6-acetilisina y la serina son metabolitos de origen microbiano. Este es el primer estudio que desvela importantes mecanismos biológicos de la resiliencia animal generada por la selección de la VE de TC. El genoma y el microbioma intestinal y la composición del metaboloma se modificaron a lo largo del proceso de selección, afectando a la respuesta inmunitaria y al estrés. Se encontraron resultados coincidentes entre los estudios metagenómicos y del metaboloma. Por otro lado, en esta tesis desarrollamos por primera vez una herramienta flexible para simular la coevolución del genoma y el microbioma a través de un proceso de selección. La clave de esta herramienta fue la implementación de la herencia del microbioma. Está construida en R y basada en AlphaSimR para que el usuario pueda modificar el código e implementar diferentes escenarios. Esta tesis es el primer paso para desarrollar futuras estrategias y nuevas investigaciones para mejorar la resiliencia de los animales. Una selección que combine información genómica y metagenómica puede mejorar la respuesta de selección. Además, los metabolitos derivados del intestino con evidencia de crosstalk pueden utilizarse como biomarcadores para identificar animales resilientes por plasma, evitando la extracción de muestras fecales para determinar la composición del microbioma. Si estos estudios tienen éxito, estas estrategias podrían mejorar la resiliencia de los animales con el objetivo de buscar un sistema ganadero más sostenible. / [CA] En aquesta tesi, es van realitzar anàlisis genòmiques, metagenòmiques i metabolòmiques en línies de conill seleccionades de manera divergent per a alta i baixa VE de la grandària de la ventrada (GV). Aquests animals van mostrar diferències en el seu potencial de resiliència. Per això, aquestes poblacions divergents són un excel·lent material biològic per a estudiar la resiliència animal a través de la VE. Es van realitzar estudis d'associació del genoma (GWAS) utilitzant la regressió d'un solo marcador i la regressió bayesiana de múltiples marcadors. Quatre regions genòmiques es van associar amb la VE en el cromosoma 3 de Oryctolagus cuniculus (OCU), OCU7, OCU10 i OCU14, explicant el 8,6% de la variància genètica total per a la VE. A més, l'estudi de petjades de selecció (SS) va identificar 134 regions genòmiques que podrien estar sota selecció per a la VE. El solapament entre tots dos estudis es va identificar en l'OCU3, on també es van trobar mutacions funcionals per als gens DOCK2, INSYN2B i FOXI1. Els gens candidats de GWAS i SS van ser aquells amb mutacions funcionals identificades mitjançant l'anàlisi de seqüenciació del genoma complet (WGS) amb pools d'ADN. Els gens candidats destacats van mostrar funcions biològiques relacionades amb el desenvolupament d'estructures sensorials, la resposta immunitària, la resposta a l'estrés i el sistema nerviós. Totes elles són funcions rellevants per a modular la resiliència dels animals. D'altra banda, els estudis metagenòmiques i *metabolòmiques van mostrar que la selecció per a la VE va modificar el microbioma intestinal i la composició de la seua metaboloma. Les espècies microbianes beneficioses com Alistipes prutedinis, Alistipes shahii, Odoribacter splanchnicus i Limosilactobacillus fermentum eren més abundants en la població resilient. En canvi, les espècies microbianes nocives, com Acetatifactor muris i Eggerthella sp, van ser més abundants en els animals no resistents. Els gens relacionats amb la formació de biofilms, el metabolisme d'aminoàcids aromàtics (fenilalanina, triptòfan i tirosina) i el metabolisme del glutamat també es van expressar de manera diferencial entre les poblacions de conills. A més, es van identificar 15 metabòlits intestinals com a potencials biomarcadores per a discriminar i predir adequadament entre les poblacions de conills resistents i no resistents. Cinc d'ells, el equol, el 3-(4-hidroxifenil)lactat, el 5-aminovalerato, la N6-acetilisina i la serina són metabòlits d'origen microbià. Aquest és el primer estudi que revela importants mecanismes biològics de la resiliència animal generada per la selecció de la VE de GC. El genoma i el microbioma intestinal i la composició del metaboloma es van modificar al llarg del procés de selecció, afectant la resposta immunitària i a l'estrés. Es van trobar resultats coincidents entre els estudis metagenòmiques i del metaboloma. D'altra banda, en aquesta tesi desenvolupem per primera vegada una eina flexible per a simular la coevolució del genoma i el microbioma a través d'un procés de selecció. La clau d'aquesta eina va ser la implementació de l'herència del microbioma. Està construïda en R i basada en AlphaSimR perquè l'usuari puga modificar el codi i implementar diferents escenaris. Aquesta tesi és el primer pas per a desenvolupar futures estratègies i noves investigacions per a millorar la resiliència dels animals. Una selecció que combine informació genòmica i metagenòmique pot millorar la resposta de selecció. A més, els metabòlits derivats de l'intestí amb evidència de crosstalk poden utilitzar-se com biomarcadores per a identificar animals resilients per plasma, evitant l'extracció de mostres fecals per a determinar la composició del microbioma. Si aquests estudis tenen èxit, aquestes estratègies podrien millorar la resiliència dels animals amb l'objectiu de buscar un sistema ramader més sostenible. / [EN] Disclosing the biological mechanisms of the VE can help to gain some insight into the biological basics of animal resilience. In this thesis, genomic, metagenomic, and metabolomic analyses were performed on rabbit lines divergently selected for high and low VE of litter size (LS). These animals showed differences in their resilience potential. Thus, these divergent populations are an excellent biological material for studying animal resilience through the VE. Genome-wide association studies (GWAS) were performed using single marker regression, and Bayesian multiple marker regression approaches. Four genomic regions were associated with the VE in the Oryctolagus cuniculus chromosome (OCU) 3, OCU7, OCU10, and OCU14, explaining 8.6% of the total genetic variance for the VE. In addition, the signature of selection (SS) study identified 134 genomic regions which could be under selection for VE. Overlapping between both studies was placed in the OCU3, where functional mutations for the DOCK2, INSYN2B and FOXI1 genes were also found. Candidate genes from GWAS and SS were those with functional mutations identified using whole genome sequencing (WGS) analysis with pools of DNA. Highlighted candidate genes showed biological functions related to the development of sensory structures, the immune response, the stress response, and the nervous system. All of them are relevant functions to modulate animal resilience. On the other hand, metagenomic and metabolomic studies showed that the selection for VE modified the gut microbiome and metabolome composition. Beneficial microbial species such as Alistipes prutedinis, Alistipes shahii, Odoribacter splanchnicus and Limosilactobacillus fermentum were more abundant in the resilient population. In contrast, harmful microbial species such as Acetatifactor muris and Eggerthella sp were more abundant in the non-resilient animals. Genes related to biofilm formation, aromatic amino acid metabolism (Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine), and glutamate metabolism were also differentially expressed between the rabbit populations. Furthermore, 15 gut metabolites were identified as potential biomarkers to properly discriminate and predict between the resilient and non-resilient rabbit populations. Five of them, the equol, 3-(4-hydroxyphenyl)lactate, 5-aminovalerate, N6-acetyllisine, and serine were microbial-derived metabolites. This is the first study unravelling important biological mechanisms under the animal resilience generated by VE of LS selection. Genome and gut microbiome and metabolome composition were modified throughout the selection process, affecting the immune and stress response. Overlapping results were found between the metagenomic and metabolome studies. On the other hand, in this thesis, we developed a flexible tool for simulating the coevolution of the genome and microbiome across a selection process for the first time. The key of this tool was the implementation of the microbiome inheritance. It is constructed in R and based on AlphaSimR so the user can modify the code and implement different scenarios. This thesis is the first step to develop future strategies and further research to improve animal resilience. A selection combining genomic and metagenomic information may improve the selection response. Moreover, gut-derived metabolites with evidence of crosstalk can be used as biomarkers to identify resilient animals by plasma, avoiding the extraction of faecal samples to determine the microbiome composition. If these studies suceed, these strategies could improve animal resilience with the aim of search a more sustainable livestock system. Lastly, the simulation tool developed could help unravel the microbiome's implications in animal breeding programs. / This study was supported by projects AGL2014-5592, C2-1-P and C2-2-P, and AGL2017-86083, C2-1-P and C2-2-P, funded by the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MIC)-Agencia Estatal de Investigación (AEI) and the European Regional Development Fund (FEDER). Projects PID2020-115558GB-C21, funded by the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MIC)-Agencia Estatal de Investigación (AEI) and the European Regional Development Funds (FEDER) FPU17/01196 scholarship from the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities. / Casto Rebollo, C. (2023). Unravelling the Environmental Variance of Litter Size Through the Genome and Gut Microbiome [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192460

O desenvolvimento embrionário é o resultado de uma sequência controlada de eventos modulados por sinais ambientais e mecanismos intracelulares. Em Hymenoptera, esse processo tem um caráter especial devido ao sistema de determinação do sexo (Haplodiploide). Neste sistema, os ovos fecundados se desenvolvem em fêmeas (diploides) e os ovos não fecundados em machos (haploides). Assim, eventos importantes, como a ativação do ovo e transição materno-zigótica, eventos iniciais da embriogênese, são elementos-chave para compreender o desenvolvimento de ambos os tipos de embriões. Ativação do ovo é um evento complexo acionado em resposta a estímulos externos, necessários para o início da embriogênese. Em abelhas a ativação ovo ocorre independentemente da fecundação e parece ser desencadeado durante a passagem pelo trato reprodutivo da mãe. Além disso, se o ovócito não for fecundado ele irá se desenvolver em um organismo haploide. No entanto, se o ovo recebe o espermatozóide até 30 minutos depois da ativação, o ovo se desenvolve em um organismo diploide. Em Drosophila, a ativação do ovo é também idependente da fecundação. O estímulo inicial que desencadeia o desenvolvimento é devido tensões mecânicas sofridas pelo ovócito durante a ovulação pela passagem através do trato reprodutivo. Neste modelo, o primeiro sinal de ativação inclui a ativação da via dependente de cálcio. Moléculas maternas que são incorporados no ovócito durante ovogênese, atuam durante a ativação do ovo, bem como no início da embriogênese. Os eventos iniciais da embriogênese também são caracterizados pela ausência de altos níveis de transcrição zigótica. As moléculas depositadas atuam na ativação do ovo, quebrando a dormência da divisão celular permitindo a ocorrência do início do desenvolvimento embrionário. Mas, o embrião em desenvolvimento gradualmente degrada e substitui essas moléculas herdadas da mãe, em um processo conhecido como transição materno-zigótica. Nosso principal objetivo foi o entendimento da comunicação entre as moléculas herdadas e as recém produzidas durante os primeiros passos do desenvolvimento de Apis mellifera. Para alcançar nosso objetivo, 16 bibliotecas de RNAseq (mRNA e miRNA) foram construídas utilizando amostras de RNA total de embriões diploides e haploides de diferentes idades e ovócitos maduros. A análise do transcriptoma mostrou que existem genes diferencialmente expressos entre os dois tipos de embriões já em 1 h de desenvolvimento. Além disso, nossa análise permitiu a identificação de mRNAs e miRNAs maternos e zigóticos, além de processos com que estas moléculas se relacionam. As análises mostraram também que um mesmo miRNA pode atingir diferentes mRNAs em cada tipo de embrião, na mesma fase de desenvolvimento. Além disso, um mesmo gene pode ser diferentemente regulado nos dois tipos de embriões. Por exemplo, broad/GB48272, que é classificado como materno em embriões dipoides é regulado por quatro miRNAs diferentes e em embriões haploides é classificado como zigótico, regulado por apenas um miRNA. Análise das bibliotecas de RNAseq e hibridação in situ mostrou o padrão de expressão de zelda em embriões jovens de abelhas. Zelda é um ativador chave do genoma zigótico em Drosophila e regula eventos importantes na embriogênese se ligando a um motivo conservado, TAGteam. Em A. mellifera, encontramos um motivo TAGteam putativo que tem sido relacionado à transcrição zigótica precoce. Além disso, a hibridização in situ e PCR mostraram três primiRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p e ame-mir-263b-5p) que se expressam durante a clivagem. A presença de pri-miRNAs evidenciou a início da transcrição zigótica durante a clivagem. Em suma, podemos dizer que este é o primeiro trabalho em Apis mellifera a descrever os eventos de iniciais do desenvolvimento embrionário comparando embriões haploides e diploides usando os recentes protocolos de bioinformática e os avanços da biologia molecular. / Embryonic development is the result of a precisely controlled sequence of events modulated by environmental signals and intracellular mechanisms. In Hymenoptera, this process takes a special character due the sex-determination system (haplodiploidy). In this system, fertilized eggs develop in females (diploid) and unfertilized eggs in males (haploid). Thus, important events such as egg activation and maternal-zygotic transition, events of the early embryogenesis are key elements to understand the development of both types of embryos. Egg activation is a complex event triggered in response to external stimuli and necessary for the onset of embryogenesis. In honeybees egg activation occurs independently of fertilization and seems to be triggered during the passage through mother\'s reproductive tract. Furthermore, if the egg is not fertilized it will develop into haploid organism. However, if the egg receives the sperm up to 30min after activation, this egg develops into a diploid organism. In Drosophila, the egg activation is also fertilization independent. Initial stimulus that triggers the development is due mechanical stresses suffered by the egg during ovulation and passage through the reproductive tract. In this model, the first activation signal includes activation of calciumdependent pathway. Maternal molecules that are incorporated into the oocyte during ovogenesis, act during egg activation, as well as in early embryogenesis. Early embryogenesis events are also characterized by absence of high levels of zygotic transcription. The deposited molecules drive egg activation, breaking cell division dormancy permitting the beginning of embryonic development. But, the developing embryo gradually degrades and substitutes these mother-inherited molecules, in a process known as mother-to-zygote transition. Our main objective was the understanding of the deep crosstalk among the inherited molecules and the newly ones produced during the first steps of Apis mellifera embryogenesis. To achieve our objective 16 deep sequenced RNA (mRNA, miRNA) libraries were constructed using different age diploid and haploid embryos, and mature oocytes. Genome-wide transcriptome analysis was performed and interactive regulatory networks were constructed. Our analysis permitted the identification of maternal and zygotic mRNAs and miRNAs and related processes. Based on expression profiles of mRNAs and miRNAs in mature oocytes and haploid and diploid embryos of 2, 6 and 18-24 h of development, we constructed integrative regulatory networks (miRNA:mRNA) showing that the same miRNA could target different mRNAs in each type of embryo, in the same phase of development. As example we cite broad/GB48272, which is classified as maternal in diploid embryos and regulated by four different miRNAs. However, in haploid embryos it is zygotic and regulated by only one miRNA. Analysis of RNAseq and in situ hybridization showed the expression pattern of zelda in early honeybee embryos. Zelda is a key activator of Drosophila early zygotic genome and regulates important events in early embryogenesis binding to TAGteam motif. In A. mellifera, we found a putative TAGteam motif that has been implicated in early zygotic transcription. Moreover, in situ hybridization and PCR assay showed three pri-miRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p and ame-mir-263b-5p) expressed during cleavage. The presence of pri-miRNAs is the first evidence of early zygotic transcription during cleavage. In short, we could say that this is the first work on Apis mellifera describing the early embryonic developmental events comparing haploid and diploid embryos using modern bioinformatics tools and advanced molecular analysis.

Molibdênio é um elemento traço envolvido na fixação de nitrogênio, enxofre e carbono. Oligopeptídeos estão envolvidos na nutrição bacteriana e diversos outros processos de sinalização intercelular. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel funcional das proteínas ligadoras dos sistemas de captação de molibdato (ModA) e oligopeptídeo (OppA) em Xanthomonas axonopodis pv. citri em condições in vitro e in vivo. O mutante ModA mostrou uma produção diminuída de goma xantana, alteração do biofilme e adesão prejudicada em condições in vitro. In vivo a interação do mutante modA mostrou alterações nas lesões causadas em folhas de grapefruit possivelmente resultado da baixa expressão do gene gumB. O mutante na proteína OppA apresentou células mais co-agregadas alterando a estrutura do biofilme e consequentemente diminuindo sua capacidade de adesão. In vivo, a linhagem mutante não alterou o fenótipo de patogenicidade, mas a sua capacidade de crescimento foi afetada no início da fase estacionária sugerindo que o sistema Opp desempenha um papel nutricional. / Molybdenum is a trace element involved in nitrogen fixation, sulfur and carbon. Oligopeptides are involved in bacterial nutrition and several other intercellular signaling processes. The aim of this study was to investigate the functional role of binding proteins of molybdate (ModA) and oligopeptide (OppA) uptake systems of Xanthomonas campestris pv. citri in in vitro and in vivo conditions. ModA mutant showed a decreased production of xanthan gum, altered biofilm and adhesion impaired in vitro conditions. In vivo ModA mutant interaction showed changes in injuries on leaves of grapefruit possibly due to low expression of the gumB gene. The OppA mutant showed more cells co-aggregated by changing the structure of the biofilm and consequently reducing their capacity to adhere. In vivo, the mutant strain did not modify the phenotype of pathogenicity, but its ability for growth was affected at the early stationary phase suggesting that the Opp system plays a nutritional role.