Atualmente, a salmonelose representa uma das zoonoses de maior importância em Saúde Pública no mundo, em razão da alta endemicidade, mortalidade, e dificuldade do seu controle. No município de São Paulo, é possível encontrar diferentes realidades no que se diz respeito às boas práticas de produção e ao controle de qualidade dos produtos de origem animal, principalmente quando se considera os pontos de venda direta ao consumidor. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a presença de Salmonella entérica em cortes de carne suína vendidos em mercados municipais, açougues e mercados de pequeno porte distribuídos nas cinco regiões do município de São Paulo. As estirpes isoladas foram caracterizadas quanto ao sorotipo, perfil de resistência a antimicrobianos, perfil genotípico através da eletroforese em campo pulsado (PFGE) e do polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP). A partir dos 394 cortes de carne avaliados 6% foram positivos para o isolamento de S. enterica. Dentre os 111 estabelecimentos examinados, 14,4% apresentaram pelo menos um corte de carne positivo. Dentre as 60 estirpes selecionadas para caracterização, os sorotipos identificados foram Typhimurium (33,3%), London (26,7%), Brandenburg (10,0%), Schwaezengrund (8,3%), Derby (8,3%), Infantis (6,7%), Javiana (6,7%). A determinação da concentração inibitória mínima indicou as seguintes frequências de resistência antimicrobiana: azitromicina (100%), sulfametoxazol (98,3%), ampicilina (50%), cloranfenicol (41,7%), tetraciclina (40%), ácido nalidixico (21,7%), gentamicina (16,7%), trimetoprim (15%) e ciprofloxacina (5%). Todos os isolados foram sensíveis à cefotaxima, ceftazidima, meropenem e tigeciclina. Multirresistência foi identificada em 58,3% das estirpes avaliadas. A caracterização das estirpes pela PFGE e pelo AFLP revelou uma tendência a agrupar os isolados de acordo com a origem e com os sorotipos. A partir do sequenciamento do genoma de 11 estirpes foi possível identificar os STs, a presença de genes de resistência e de ilhas de patogenicidade. Os dados obtidos foram discutidos frente aos perfis descritos de estirpes de Salmonella entérica oriundas de criações de suínos e casos de infecção alimentar relatados no país e no exterior. / Currently, salmonellosis represents one of the most important zoonoses in Public Health in the world, due to the high endemicity, mortality, and difficulty of its control. In the city of São Paulo, it is possible to find different realities regarding good production practices and quality control of animal products, especially when considering the points of direct sales to the consumer. The objectives of the present study were to evaluate the presence of Salmonella enterica in pork cuts sold in municipal markets, butchers and small markets distributed in the five regions of the city of São Paulo. Isolated strains were characterized for serotype, antimicrobial resistance profile, genotypic profile through pulsed field electrophoresis (PFGE) and amplified fragment length polymorphism (AFLP). From the 394 meat cuts evaluated 6% were positive for isolation of S. enterica. Among the 111 establishments examined, 14.4% had at least one positive meat cut. Among the 60 strains selected for characterization, the identified serotypes were Typhimurium (33.3%), London (26.7%), Brandenburg (10.0%), Schwaezengrund (8.3%), Derby (8.3%), Infantis (6.7%) andJaviana (6.7%). Determination of the minimum inhibitory concentration indicated the following frequencies of antimicrobial resistance: azithromycin (100%), sulfamethoxazole (98.3%), ampicillin (50%), chloramphenicol (41.7%), tetracycline (40%), nalidixic acid (21.7%), gentamicin (16.7%), trimethoprim (15%) and ciprofloxacin (5%). All isolates were sensitive to cefotaxime, ceftazidime, meropenem and tigecycline. Multiresistance was identified in 58.3% of the strains evaluated. Characterization of the strains by PFGE and AFLP revealed a tendency to group the isolates according to the origin and the serotypes. From the genome sequencing of 11 strains it was possible to identify STs, presence of resistance genes and pathogenicityislands. The data obtained were discussed in relation to the described profiles of S. enterica strains from pig herds and cases of food infection reported in the country and abroad.

A análise da informação contida em seqüências genéticas tem ganho cada vez mais importância nos dias atuais. A chamada anotação genética tem o objetivo de, a partir de uma ou mais seqüências, determinar suas características estruturais e funcionais. Muitos processos de anotação já foram realizados com êxito aumentando consideravelmente nosso conhecimento acerca do mecanismo genético de diversos organismos. A re-anotação genética é um processo que visa revisar o resultado da anotação, em virtude da disponibilidade de novas informações. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema de re-anotação automática, onde tarefas de análise repetitivas podem ser automatizadas e os dados na anotação re-analisados periodicamente, a fim de que possíveis modificações possam ser detectadas. O sistema é baseado na tecnologia de agentes. Cada agente é responsável pela execução de diferentes ferramentas de bioinformática. Ao final do processo, os resultados individuais são combinados a fim de atingir o objetivo da análise. O sistema demonstrou eficácia na análise realizada em organismos procariontes durante a fase de validação. Ambientes de re-anotação como este são ferramentas interessantes a serem futuramente integradas a sistemas de anotação existentes. / The analysis of the information present in genetic sequences is gaining more importance nowadays. The genetic annotation aims to determine structural and functional characteristics of the sequences. Many annotation processes have already been carried out, improving our knowledge about the genetic mechanism of several organisms. The genetic re-annotation is a process that aims to review the annotation results when new information is available. This work presents an automatic re-annotation system where repetitive analysis tasks can be automated and annotation data are periodically re-analysed in order to detect possible differences. The system is based on the agent technology and each agent must execute different bioinformatics tools and merge its results in order to reach the analysis goals. The system proved to be efficient on the analysis carried out in procariotic organisms in the validation process, becoming an interesting tool to be integrated in annotation systems in the future.

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_marcus_redu_eslabao.pdf: 801425 bytes, checksum: d5a120076fe65d76b21da14d5db5817b (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Leptospirosis is a neglected zoonosis with global distribution. The disease is caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, which affect humans and various domestic and wild animals, causing serious problems to human health and damage to livestock. The objective of this study was to determine the genome sequence of Leptospira borgpetersenii serogroup Ballum strain 4E, isolated from domestic mice (Mus musculus), one of the main reservoirs of this genus. The complete genome sequence was determined using SOLiDTM system, which generated over 85 million 50 bp reads. These reads were used to obtain scaffolds of the two chromosomes present in this organism through the ab initio sequence assembly with Velvet and Edena softwares and orientation of contigs with G4All software. With completion of the assembly process, the large chromosome was 3,071,053 bp, GC content of 40.58%, 36 tRNA, 4 rRNA and 2,908 open reading frames (ORF). The small chromosome has 305,940 bp, GC content of 40.25%, 277 ORFs, no tRNA or rRNA. A reduction in the large chromosome of 4E strain was observed compared to the large chromosome of L550 strain, where 99 genes of L550 strain are not present in the 4E strain and about 394 kb of non-coding region was also lost. The main hypothesis for this reduction is the effect of the presence of a large number of mobile genetic elements. Genome reduction has been observed in other strains of L. borgpetersenii. The Applied Biosystems SOLiD 4 method allowed determination of the genome sequence of L. borgpetersenii strain 4E, with wide coverage and accuracy. The ab initio assembly methods used allowed for complete utilization of the sequences generated. / A leptospirose é uma zoonose negligenciada com distribuição global. A doença é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, as quais acometem humanos e vários animais domésticos e silvestres, acarretando graves problemas à saúde humana e prejuízos na pecuária. O presente trabalho teve como objetivo sequenciar o genoma da Leptospira borgpetersenii sorogroupo Ballum cepa 4E, isolada de camundongo doméstico (Mus musculus), um dos principais reservatórios deste gênero. A sequência completa do genoma foi determinada através do sistema SOLiDTM, onde foram obtidas mais de 85 milhões de leituras com tamanho de 50 pb cada. Essas leituras foram utilizadas para obtenção de scaffolds dos dois cromossomos presente neste organismo, através de montagem ab initio com os softwares Velvet e Edena; e posterior orientação das contigs com o software G4All. Com a conclusão da montagem, o cromossomo maior apresentou o tamanho de 3.071.053 pb, 40,58% de conteúdo GC, 36 tRNA, 4 rRNA e 2.908 fases de leitura abertas (ORF). Para o cromossomo menor o total de bases foi de 305.940 pb, conteúdo GC de 40,25%, 277 ORFs, nenhum tRNA e rRNA foram preditos. Foi observada uma redução do cromossomo maior da cepa 4E em ralação ao cromossomo maior da cepa L550, onde 99 genes da cepa L550 não estão presentes na cepa 4E e cerca de 394 kb de região não codificante também foi perdida. A principal hipótese para a redução é o efeito da presença de um grande número de elementos móveis, processo observado no genoma de outras cepas da espécie L. borgpetersenii. O método Applied Biosystems SOLiD 4 permitiu a determinação da sequência do genoma de L. borgpetersenii cepa 4E, com ampla cobertura e acurácia. Os metodos de montagem ab initio utilizados proporcionaram aproveitar ao máximo as sequencias geradas.

São poucos os avanços obtidos em intervenções cirúrgicas ou terapias para melhora na qualidade de vida e/ou prognósticos dos pacientes acometidos por gliomas, que são os tumores mais comuns e fatais que acometem o sistema nervoso central. O modelo celular ST1 de glioma de rato responde ao tratamento com hormônio glicocorticóide (GC) com uma reversão fenotípica tumoral-normal in vitro e in vivo e o modelo celular P7 é resistente a este tratamento. Ambas as linhagens são utilizadas, no laboratório, como modelos de estudo de genes associados à origem de neoplasias e controle de proliferação celular, com potenciais aplicações na doença humana. Este trabalho possui dois objetivos gerais: a) clonagem e caracterização funcional do gene NRP/B de rato, previamente descrito no laboratório como sendo induzido durante o tratamento das células ST1 com GC; b) identificação de genes humanos no locus 22q13, frequentemente deletado e associado à progressão tumoral de gliomas. A identificação, clonagem e determinação da seqüência completa de NRP/B de rato, até então desconhecida, foi realizada neste trabalho e depositada no GenBank (número de acesso AY669396). Sua expressão parece ser cérebro-específica, sendo modulada positivamente durante o tratamento com GC nas células ST1. A superexpressão de NRP/B em células ST1 foi realizada para avaliar o papel do gene na reversão fenotípica tumoral-normal induzida por GC. Os resultados obtidos sugerem que NRP/B provoca diminuição da capacidade de crescimento independente de ancoragem em meio semi-sólido e do potencial tumorigênico das células ST1 em ensaios de tumorigênese in vivo. Experimentos preliminares sugerem o envolvimento da expressão de NRP/B no processo de progressão celular e em tumores humanos cerebrais e de mama. Para a identificação de genes humanos no locus 22q13 associados ao desenvolvimento de gliomas, foram adotadas duas estratégias: utilização do Banco de Dados do Transcriptoma para identificação de mRNAs e ESTs alinhadas no locus associado ao câncer cerebral 22q13 e utilização dos dados de genes localizados no cromossomo 22 diferencialmente expressos em microarrays entre as linhagens ST1 e P7, ambas tratadas com GC. Como resultado da análise in silico, foram selecionados alguns genes para análise por Q-PCR em linhagens celulares e amostras clínicas de gliomas humanos, o que evidenciou a existência de algumas correlações positivas ao nível transcricional entre os genes. Três genes (KIAA1644, SULT4A1 e PARVG) apresentaram maior expressão em amostras clínicas de cérebro não-tumoral quando comparadas com amostras de gliomas, o que sugere um possível envolvimento destes na progressão de gliomas humanos. A caracterização dos alvos moleculares na ação dos genes analisados neste estudo é importante para melhor entendimento dos mecanismos moleculares que controlam a proliferação celular e, futuramente, para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para estes tumores cerebrais. / Gliomas are the most fatal central nervous system tumors and to date, satisfactory results from chemotherapies or surgical interventions are still not available. The ST1 rat glioma cell line is hyper-responsive to treatment with glucocorticoids (GC), undergoing a complete tumoral to normal phenotypic reversion, both in vitro and in vivo. The P7 glioma cell line is resistant to the action of GC. Both cell models are used in our lab to search for targets which are important to understand the origin of tumors and the control of cell proliferation. For the present study, we aimed at: a) cloning and functional characterization of the rat NRP/B gene, which had previously been identified as being induced during GC-treatment of the ST1 cells; b) identification of human genes located at the 22q13 locus, known to be involved in gliomagenesis. The previously unknown cDNA for rat NRP/B was identified, cloned, sequenced, and deposited in the GenBank (Acc. Nº AY669396). It displays brain-specific expression and positive modulation during GC treatment of ST1 cells. The role of NRP/B in the tumoral to normal phenotypic reversion induced by GC was analyzed by its overexpression in ST1 cells. The results suggest that induction of NRP/B partially impairs cell growth in semi-solid substrate and lowers its tumorigenic potential in vivo. Preliminary studies suggest that NRP/B expression is involved in cell cycle progression and in brain and human breast tumors. To identify additional human genes located in the glioma-related 22q13 locus, two strategies were used: a) analysis of the Ludwig - Fapesp Transcriptome Project database to identify mRNAs and ESTs that align to the referred locus and b) analysis of microarray data of differentially expressed genes in ST1 and P7 cells (both treated with GC) that also localize in chromosome 22. To validate the in silico analysis, Q-PCR was used to evaluate the expression of several genes in human brain tumor cell lines and clinical samples, being possible to find some positive correlations between genes at the transcriptional level. Three genes (KIAA1644, SULT4A1 e PARVG) displayed significantly higher expression levels in non-tumoral clinical samples, when compared to their tumor counterparts suggesting their involvement in human glioma progression. A better understanding of the molecular mechanisms by which these genes are involved may contribute with important information to understand the control of cell proliferation and may lead, in the future, to the development of new therapeutical strategies for brain cancer therapy and diagnosis.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-22T19:05:29Z No. of bitstreams: 1 Tese - Danival Vieira de Freitas.pdf: 6780270 bytes, checksum: 22a4c5f1a244b3bd230b52828359a0e3 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T14:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Danival Vieira de Freitas.pdf: 6780270 bytes, checksum: 22a4c5f1a244b3bd230b52828359a0e3 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T14:33:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Danival Vieira de Freitas.pdf: 6780270 bytes, checksum: 22a4c5f1a244b3bd230b52828359a0e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T14:33:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Danival Vieira de Freitas.pdf: 6780270 bytes, checksum: 22a4c5f1a244b3bd230b52828359a0e3 (MD5) Previous issue date: 2009-11-20 / Não informada / Paullinia cupana is originary from Amazon and is divided in two different varieties, P. cupana var. cupana (Venezuela and Colombia) and P. cupana var. sorbilis (Brazil), this last one is the true guarana plant. The few studies on this plant are concentrated, mainly, in its bothanical aspects and effects of its seed extract over some medical experimentation. The main objective of this work was to amplify knowledgment over those informations about the guarana plant, moreover by the means of genetic molecular. Aiming the following propositions: (1) to determine the guarana plant (P. cupana var sorbilis) caryotype and its genome size; (2) to characterize and validate sequences expressing in the guaraná berries, gathering especial information on those related with caffeine synthesis (N-methil-transferases); (3) to determine its (Nmethil- transferases) copy number in the plant genome; (4) to determine its (N-methiltransferases) expression patterns in different organs/tissues. The results showed an elevated number of chromosomes (210) and DNA content (2C = 22.5 pg DNA/cell). The caryogram analysis presented two sets of chromosomes, one tetraploid and other hexaploid. The transcripts sequencing yield a 15,387 ESTs databank, grouped in 2,628 contigs and 5,969 singletons. Among these are enzymes genes involved in caffeine synthesis, the so called caffeine sintases. The analysis of these guarana sequences (denominated GNMT) shows it is homologous to N-methyltransferases of other species such as coffee (Cofea arábica and C. canephora), cocoa (Theobroma cacao), and green tea (Camellia sinensis). Regarding to the number of genome copies, the guarana plant presented three times more than its native wild plants (the guaranaranas, Paullinia sp) correlates. Fruits posses the highest level of GNMT transcript expression when it reach 70 days of development age, increasing the rate as berries ripening process occurs. These results are especially interesting and can collaborate with the experimentations in progress course which are proving the healing properties attributed to this plant and its seed powder extract. / A espécie Paullinia cupana originária da Amazônia, é dividida em duas variedades, P. cupana var. cupana (Venezuela e Colômbia) e P. cupana var. sorbilis (Brasil). Os poucos estudos com o guaranazeiro concentraram, principalmente, nos seus aspectos botânicos, no seu melhoramento e em testes experimentais sobre o efeito de seu extrato para fins terapêuticos. O objetivo principal do presente trabalho foi ampliar o conhecimento sobre as informações básicas do ponto de vista genético e molecular do guaranazeiro. Deste modo foi proposto: (1) determinar o cariótipo e o tamanho do genoma da planta (P. cupana var sorbilis); (2) caracterizar e validar seqüências expressas em seus frutos, e em especial as das enzimas relacionadas com a síntese de cafeína (N-metiltransferases); (3) determinar o seu número de cópias; (4) determinar o padrão de expressão em diferentes órgãos/tecidos. A var. sorbilis apresentaou elevado número de cromossomos (2n = 210) e conteúdo de DNA (2C = 22,5 pg DNA/células). A análise do cariograma mostrou que os cromossomos estão agrupados em dois conjuntos, um tetraplóide e outro hexaplóide. O seqüenciamento de transcritos gerou um banco com 15.387 ESTs, distribuídas em 2.628 contigs e 5.969 singletons. Entre estas estão as enzimas que participam das vias de síntese da cafeína sintase, sendo o melhor hit com as sequências de N-metiltransferases, aqui denominadas GNMT. As análises indicam que a sequência GNMT é homóloga as N-metiltransferases da via biossintética da cafeína de outras espécies tais como café (Coffea arabica and C. canephora), cacau (Theobroma cação), e chá verde (Camellia sinensis). O número de cópias gênicas da N-metiltransferase da GNMT presentes no genoma do guaranazeiro foi cerca de três vezes mais cópias que os espécimes selvagens (guaranarana, Paullinia sp). O fruto do guaranazeiro com 70 dias de desenvolvimento tem o maior nível de transcritos da GNMT, sendo que o número de transcritos aumentou gradualmente com o processo de maturação do fruto do guaranazeiro. Os resultados aqui discutidos são especialmente interessantes e podem colaborar com a experimentação científica que estão, aos poucos, comprovando as propriedades medicinais atribuídas ao guaraná e seu extrato obtido do pó de suas sementes.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.

Johnsongrass mosaic virus (JGMV) é uma espécie do gênero Potyvirus. A sua distribuição geográfica, até o início da década de 1990, estava limitada à Austrália e aos Estados Unidos, onde causa doença em sorgo, milho e várias gramíneas. Em 2001, o JGMV foi detectado pela primeira vez no Brasil em amostras de híbridos e variedades de milho provenientes da região de Ribeirão Preto, SP mediante análise sorológica (DAS-ELISA), e em 2013 foi detectado mediante RT-PCR em amostras de Pennisetum purpureum provenientes do Estado da Bahia. Em Fevereiro de 2012 a Clínica Fitopatológica da ESALQ/USP recebeu amostras de Panicum maximum cv. Mombaça, com sintomas de mosaico, de São Luiz do Paraitinga, SP. Exames preliminares de contrastação negativa em microscópio eletrônico de transmissão indicaram a presença de partículas virais características de potyvirus. Diante disso, o principal objetivo deste trabalho foi caracterizar o agente etiológico associado às plantas doentes de capim Mombaça mediante testes biológicos, sorológicos e moleculares. Extratos foliares de plantas sintomáticas de capim Mombaça foram inoculados mecanicamente em 69 genótipos da família Poaceae. As avaliações foram feitas com base nos sintomas e por PTA-ELISA usando antissoro policlonal contra a proteína capsidial do potyvirus produzido nesse trabalho, após purificação do isolado viral. As espécies susceptíveis foram Brachiaria brizantha, B. decumbens, B. plantaginea, Cenchrus echinatus, Echinochloa colona, E. crus-galli, E. cruspavonis, Melinis minutiflora, Panicum maximum cv. Colonião, Pennisetum setosum, Rhynchelytrum repens, Rottboellia exaltata, Sorghum bicolor BRS 332, S. bicolor BRS 509, S. bicolor x S. sudanense BRS 802 e S. verticilliflorum. Espécies cultivadas como arroz, aveia, cana-de-açúcar, centeio, milho e trigo não foram infectadas com esse isolado. O peso molecular da proteína capsidial deste potyvirus foi estimado em cerca de 33 kDa por meio de Western blot. Sequência de nucleotídeos do genoma completo (9.885 nt) obtida neste estudo revelou identidade de 82,03% com a única sequência completa do genoma de um isolado do JGMV da Austrália, depositada no GenBank. A partir dessa sequência foram obtidos oligonucleotídeos iniciadores específicos para a detecção do isolado de SP do JGMV mediante RT-PCR. / Johnsongrass mosaic virus (JGMV) is a species of the genus Potyvirus. The geographical distribution, until the early 1990s, was limited to Australia and the United States, where it causes disease in sorghum, corn and various grasses. In 2001, JGMV was first detected in Brazil in samples of hybrids and varieties of corn from the region of Ribeirão Preto, São Paulo State by serological analysis (DASELISA), and in 2013 it was detected by RT-PCR in samples of Pennisetum purpureum from the State of Bahia. In February 2012, the Disease Diagnostic Clinic ESALQ/USP received samples of Panicum maximum cv. Mombaça, exhibiting mosaic symptoms, from the region of São Luiz do Paraitinga, SP. Preliminary examination of negatively stained sap in a transmission electron microscope indicated the presence of potyvirus-like particles. Therefore, the main objective of this study was to characterize the etiologic agent associated with P. maximum cv. Mombaça diseased plants by biological, serological and molecular tests. Leaf extract from Mombaça infected plants was mechanically inoculated in 69 genotypes of the Poaceae family. Evaluations were done based on symptoms expression and PTAELISA using polyclonal antiserum against the capsid protein of the potyvirus produced in the preset work virus purification. Susceptible species were Brachiaria brizantha, B. decumbens, B. plantaginea, Cenchrus echinatus, Echinochloa colona, E. crus-galli, E. crus-pavonis, Melinis minutiflora, Panicum maximum cv. Colonião, Pennisetum setosum, Rhynchelytrum repens, Rottboellia exaltata, Sorghum bicolor BRS 332, S. bicolor BRS 509, S. bicolor x S. sudanense BRS 802 and S. verticilliflorum. Cultivated species such as rice, oats, sugarcane, rye, corn and wheat were not infected with this isolate. The molecular weight of the coat protein of this potyvirus was estimated at about 33 kDa by Western blot. The nucleotide sequence of the complete genome (9885 nt) obtained in this study showed 82.03% identity with an unique sequence for the complete genome of an isolate of JGMV from Australia, deposited in GenBank. From this nucleotide sequence, specific pair of primers was designed for the detection of the São Paulo isolate of JGMV by RT-PCR.

O fungo endofítico Epicoccum nigrum atua no biocontrole de fitopatógenos e produz uma série de compostos com de interesse biotecnológico como antimicrobianos. Neste trabalho, foi utilizado um conjunto de sequências genômicas previamente montadas. As sequências foram anotadas para compreensão funcional utilizando a plataforma EGene2 incluindo alguns componentes específicos desenvolvido neste trabalho. Foram estimados 10.320 genes codificadores de proteínas, além de tRNAs, rRNAs e ncRNAs. As proteínas preditas foram comparadas aos proteomas de outros fungos e comparadas filogeneticamente. Além disso, foi desenvolvido Synteny Clusters, um programa que compara clusters de genes de metabólitos secundários aos de outros fungos. E. nigrum apresenta grande similaridade com outros fungos com estilo de vida distinto. Foram identificados três clusters de genes relacionados a doenças que estão presentes em fitopatógenos e ausentes em E. nigrum. Os resultados sugerem que as diferenças entre endófitos e fitopatógenos pode estar relacionada a um pequeno número de genes. / The endophytic fungus Epicoccum nigrum has been used for plant pathogen biocontrol in different host plants, since it produces a series of secondary metabolites of biotechnological interest, including antimicrobials. In this regard, we used assembled 454 sequencing dataset was used to perform a comprehensive functional annotation using the EGene2 platform, including some specific components developed in this work. We found 10,320 protein coding genes as well as tRNAs, rRNAs and ncRNAs. The predicted proteins were compared to proteomes of other fungi and used in phylogenetic analyses. In addition, we developed Synteny Clusters, a program that compares gene clusters with others fungi. E. nigrum presents a genome very similar to others fungi with distinct lifestyles. Finally, we identified three disease-related gene clusters that are absent in E. nigrum and present in most plant pathogenic fungi. This result suggests that the lifestyle differences observed between endophytic and pathogenic fungi may rely on a relatively low number of genes.

A mitocôndria é a organela citoplasmática responsável pelo maior sistema produtor de energia, a fosforilação oxidativa (OXPHOS). Foi proposto que em células tumorais a hiper-regulação da glicólise em condições normais de oxigênio (Efeito Warburg), está associada a defeitos na OXPHOS e pode regular o fenótipo tumoral, por exemplo, o potencial metastático da célula por meio da indução de vias pseudohipóxicas durante a normóxia. Estudos recentes mostraram que vários tipos de tumores possuem mutações somáticas em seu genoma mitocondrial, o que pode alterar as funções da OXPHOS levando a troca de metabolismo energético nas células tumorais e induzindo a tumorigênese. Diante disto, o presente trabalho avaliou a instabilidade do genoma mitocondrial em etapas bem definidas da progressão do câncer colorretal. O DNA genômico foi extraído de amostras de adenoma, adenocarcinoma, tecido adjacente e sangue periférico de nove pacientes diagnosticados com Câncer colorretal. O genoma mitocondrial foi amplificado e sequenciado para que fossem feitas as buscas por mutações nas amostras de sangue periférico, adenomas e adenocarcinoma. Foi também medido o número de cópias relativas do mtDNA. Foram encontradas um total de 233 mutações, das quais 162 foram em comum entre os três tecidos avaliados. As amostras de adenocarcinoma foram as que apresentaram uma maior média de mutações por amostra (44,6), seguidas dos adenoma (40,2) e do sangue periférico (34). As amostras de adenocarcinoma apresentaram uma maior instabilidade do mtDNA refletidas a partir de um maior número de mutações somáticas (tanto do tipo InDel como mutações de uma única base), mutações não sinônimas com maior patogenicidade, maior número de mutações em heteroplasmia e com taxa de heteroplasmia elevada. Já as amostras de adenoma apresentaram instabilidade dos seus mtDNA intermediários entre o tecido não tumoral e tumoral, refletindo bem a etapa de modificação celular no qual esses tecidos se encontram. Na análise do número de cópias relativas, as amostras de adenocarcinoma tiveram diminuição no número de cópias relativas quando comparadas com tecido adjacente (p= 0,01) e com adenomas (p= 0,04). Em síntese, o presente trabalho sugere que a instabilidade do genoma mitocondrial parece ter um papel importante no desenvolvimento de tumores colorretais. / The mitochondrion is a cytoplasmic organelle responsible for the major energy producing system, which is the oxidative phosphorylation enzyme pathway (OXPHOS). It was proposed that glycolysis up-regulation during normal oxygen conditions (Warburg effect) may induce defects in the mitochondrial respiration and regulate tumoral phenotypes, for example, metastatic potential through the induction of pseudohipoxic pathways during normoxia. Recent studies have shown that many kinds of tumors have mtDNA somatic mutations, which could alter the OXPHOS functions, leading to changes in glucose metabolismo and improvind tumorigenesis. This study analyzed the mitochondrial genome instability of well defined stages of colorectal cancer. Genomic DNA was extracted from adenoma, adenocarcinoma, adjacente tissue and peripheral blood of patients diagnosed with Colorectal cancer. The mitochondrial genome was amplified and sequenced for mutations screening in adenoma, adenocarcinoma e blood samples. It was also analyzed the relative mtDNA copy number. It was find a total of 233 mutations, which 162 were in common among the three analyzed tissues. The adenocarcinoma samples presented a greater mutation mean per sample (44.6) followed by adenomas samples (40.2) and blood samples (34). The adenocarcinoma samples also shown a greater mitochondrial genome instability refleted by increased of somatic mutations (InDels and single nucleotide variation), non sinonimous mutations with higher patogenicity, increased number of heteroplasmatic mutations and higher heteroplasmatic levels. The adenoma samples showed intermadiate instability of its mtDNA, which well reflects the intermediate stage of cellular modifications of this tissue. The mtDN copy number analysis shown that the adenocarcinoma samples presented decreased number of mtDNA content when compared with adjacente tissue (p= 0.01) and adenoma samples (p= 0.04). In summary the presente study suggests that the mitochondrial genomic instability seems to play an importante role in colorectal tumorigenesis.