A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (NEM1) é uma doença genética, de herança autossômica dominante, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores endócrinos acometendo, principalmente, hipófise, paratireoide e pâncreas/duodeno endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene supressor tumoral MEN1 (11q13). A tumorigênese segue o modelo de Knudson (1971). O diagnóstico genético de famílias com NEM1 reconhece os portadores assintomáticos de mutação MEN1, permite o diagnóstico e tratamento precoce de tumores, promove a redução da morbimortalidade relacionada à NEM1 e exclui familiares não portadores de mutação do rastreamento clínico periódico. O diagnóstico genético de NEM1 tem sido realizado por meio da técnica de sequenciamento Sanger. Entretanto, limitações desta técnica a tornam menos custo efetiva, devido a sua reduzida capacidade de geração de dados, que leva a necessidade de obtenção de produtos de PCR de até 700 pb para adequada leitura do sequenciamento. Além disto, condições específicas do gene MEN1, como a ausência de \"hot spots\" mutacionais, levam a necessidade de sequenciamento de toda sua extensão (7Kb) e contribuem para tornar esta técnica laboriosa e dispendiosa. A subdivisão do gene para sequenciamento Sanger pode ocultar informações, principalmente de regiões intrônicas, que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. Tais dificuldades impedem a incorporação do diagnóstico gênico de NEM1 na prática clínica. Desde 2005, estão disponíveis tecnologias denominadas NGS (Next- Generation Sequencing), que consistem em ferramentas para o sequenciamento genético com capacidade aumentada de geração de dados, tornando-as mais atrativas e de melhor custo-benefício. O NGS confere, ainda, maior velocidade ao processo de obtenção de dados e detém a capacidade de realizar a leitura completa do gene, incluindo regiões promotoras e intrônicas. Por isto, torna a leitura mais ampla e informativa, sem desconsiderar aspectos qualitativos. Dentre várias opções de NGS disponíveis, plataformas leves são consideradas mais adequadas para aplicação clínica, destacando-se as plataformas Ion PGM e Illumina MiSeq. Uma forte tendência tem sido mostrada de migração do sequenciamento Sanger para o NGS, incluindo a aplicação da mesma em diagnóstico genético de doenças complexas e de câncer hereditário. Entretanto, não há estudos prévios envolvendo NGS em NEM1. Diante disto, foi avaliado a qualidade desta técnica como método de diagnóstico genético em NEM1 em comparação ao sequenciamento Sanger. Objetivos: validação da técnica de NGS utilizando como parâmetro o sequenciamento Sanger; avaliação da sensibilidade, especificidade e relação custo-benefício do NGS. Para tal, foram analisados 76 casos-índices com diagnóstico clínico de NEM1 na plataforma Illumina MiSeq. As análises foram subdivididas em duas fases. O enriquecimento da região genômica do gene MEN1 foi realizado por meio de PCR longa. Com base nos dados obtidos foi possível aferir 96% de reprodutibilidade entre as diferentes fases do estudo e aproximadamente 99% de precisão para detecção de variantes. Exatidão, sensibilidade e especificidade resultaram em 100%. Não houve falsos-positivos ou negativos. A técnica de NGS também se mostrou mais custo-efetiva do que o sequenciamento Sanger. Este estudo permitiu validar e introduzir esta técnica como ferramenta de diagnóstico gênico de NEM1 para rastreamento genético de casos-índices / The multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) is a genetic, autossomic and dominant disease and is correlated with the development of endocrine tumors affecting pituitary gland, parathyroid, endocrine pancreas or duodenum. It is mainly caused by a germinative mutation in tumor suppressor gene MEN1 (11q13). The tumorigenesis follow the Knudson\'s model (1971). Genetic diagnosis of families with MEN1 is essential to recognizes asymptomatic mutation carriers, and allows an earlier detection and treatment of tumors leading to a reduction of mortality and morbidity associated to MEN1. Furthermore, it can exclude family members that do not carry mutations from the periodical screening. The genetic diagnosis for MEN1 is held using Sanger sequencing. However, limitations of this technique make it less cost-effective, mostly, the less capacity of data generation that leads to the need of PCR products up to 700 bp to obtain a suitable read. Moreover, specific conditions of the MEN1 gene contributes to make this process more laborious and expensive, like the need to read all gene sequence (7kb) to make a correct analysis due to the absence of \"hot spots\". This way, the need of \"fragmentation\" to allow the sequencing can hide important information to disease development, mostly in introns. These limitations preclude the clinical application of genetic diagnosis of MEN1. Since 2005, new technologies are available; they are called Next Generation Sequencing (NGS) and consist in a new tool that allow the same sequencing, but with a larger data generation capacity, making them more attractive and costeffective. The NGS also gives a higher speed to the process of data acquiring and allows the complete read of gene, including promoters and introns. Therefore, it makes the results more informative, not forgetting quality aspects. Among lot of options of NGS available, lighter platforms are recommended, for example, Ion PGM and Illumina MiSeq. A strong tendency has been shown in order to change the Sanger sequencing to NGS, including clinical application to genetic diagnosis of complex diseases and inherited cancer. However, there is not previous studies evaluating NGS to MEN1 genetic diagnosis. Thus, present study evaluated NGS as a genetic diagnosis method for MEN1, comparing with Sanger sequencing. This study aimed to validate the NGS method using as model the Sanger sequencing and evaluated sensibility, specificity and costeffectiveness of NGS. For this purpose, 76 index-cases with clinical MEN1 diagnosis were analyzed on Illumina MiSeq. Analyzes were divided in two phases. After analyzes, 96% of reproducibility and 99% of precision were calculated. Accuracy, sensibility and specificity were resulted in 100%. There were not falses negatives or positives. NGS showed more cost-effectiveness with lower costs. This study allowed validation of genetic screening of MEN1 indexcases applying NGS platform

Os compostos de origem microbiana tem readquirido interesse pela biodisponibilidade, especificidade de alvo e diversidade química, mas as vias biosintéticas permanecem crípticas em condições de cultura. Uma estratégia para expressa-las é a super-expressão de genes ativadores. O laboratório de Bio-Produtos no ICB na USP tem trabalhado com Streptomyces olindensis produtor da Cosmomicina D uma molécula com atividade antitumoral de interesse devido ao padrão de glicosilação. O genoma de S. olindensis foi sequenciado e submetido ao NCBI (JJOH00000000) e utilizando o software antiSMASH foram identificados 33 clusters envolvidos na produção de metabolitos secundários. Encontraram-se clusters gênicos para a produção de metabolitos como Melanina, Geosmina, entre outros. Além, foi realizada uma analise de genômica comparativa para caracterizar e anotar as 22 vias biossintéticas desconhecidas em S. olindensis. Finalmente, escolheram-se a via do aminociclitol e um Policetídeo Tipo I para a super-expressão de genes reguladores levando a detecção do composto sob condições de cultura. / Microbial metabolites regain interest due to its bioavailability, target specificity and chemical diversity, but the biosynthetic pathways remain silenced under culture conditions. A strategy to obtain them is the over expression of regulatory genes. Bio-products laboratory at USP has been working with Streptomyces olindensis, products of Cosmomycin D, an antitumoral molecule with a distinctive glycosylation pattern. S. olindensis genome was sequenced and submitted to NCBI (JJOH00000000) and employing antiSMASH server 33 secondary metabolite related clusters were identified. Known pathways were found such as genes for melanin production, Geosmin and others. Additionally, a comparative genomic approach was used to characterize the 22 biosynthetic unknown pathways described in S. olindensis. Subsequently, Aminocyclitol and Polyketide Type I were chosen to evaluated, over expressing the regulatory genes, leading to the compound detection in regular culture conditions.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram.negativa, fastidiosa, que vive limitada ao xilema de plantas causando várias doenças de importância econômica como a doença de Pierce em videiras nos Estados Unidos e a Clorose Variegada dos Citros (CVC) no Brasil. A CVC tem afetado severamente a citricultura do estado de São Paulo pondo em risco milhares de empregos e milhões de dólares em geração de divisas. O sequenciamento do genoma de X. fastidiosa revelou genes envolvidos em possíveis mecanismos de patogenicidade dessa bactéria, entre eles um operon possivelmente envolvido na produção de um exopolissacarídeo extracelular denominado goma fastidiana. Supõe.se que esse exopolissacarídeo seja o responsável pela manutenção dos biofilmes bacterianos que causam a oclusão dos vasos xilemáticos levando ao surgimento dos sintomas da CVC. Para estudar esse operon, denominado operon gum, foram construídos vetores para a inativação dos genes gumB, gumD e gumF por duas estratégias: mutagênese por inserção.deleção e mutagênese por troca alélica. A mutagênese por inserção.deleção envolve a integração via recombinação homóloga com uma permuta.de um plasmídeo contendo uma cópia truncada do gene alvo. A mutagênese por troca alélica, por sua vez, envolve duas permutas e se caracteriza pela troca do gene alvo selvagem por uma cópia interrompida por um marcador de seleção. Nenhum mutante gum foi obtido usando.se a estratégia de troca alélica, todavia, mutantes para os genes gumB e gumF foram obtidos com sucesso pela estratégia de mutagênese por inserção.deleção. Nenhum mutante para o gene gumD foi obtido, sugerindo que essa mutação possa ser letal para a célula. A análise de células e colônias desses mutantes crescidos em meio sólido ou em suspensão não mostrou diferenças morfológicas em relação a linhagem selvagem. A inativação dos genes gumB e gumF não influenciou a capacidade de X. fastidiosa se aderir a vidro. Com o uso do gene repórter CAT, que codifica para a enzima clorafenicol acetil transferase a qual confere à bactéria resistência ao antibiótico clorafenicol foi possível verificar que a glicose não influencia na expressão desse operon ao nível de transcrição. Com o uso desse gene reporter, também foi possível identificar uma região transcrita a partir de um promotor não caracterizado, localizada na fita antisenso do operon gum. A comparação do perfil cromatográfico de proteínas solúveis totais dos mutantes e da linhagem selvagem mostrou diferenças significativas nesses pefis, indicando um efeito pleiotrópico dessas mutações. O estudo da função dos genes gumB e gumF na patogenicidade de X. fastidiosa foi impossibilitado por se ter verificado recentemente que a linhagem usada na construção dos mutantes não coloniza a planta eficientemente para a indução de sintomas em citros e tabaco em condições experimentais após inoculação mecânica. / Xylella fastidiosa is a fastidious, xylem restricted, gram.negative bacteria, that causes several economically important diseases as Pierce's disease of grapevine in USA and the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in Brasil. CVC affects severely the São Paulo State citriculture jeopardizing thousands of jobs and millions of dollars of incomes. The genome sequence of X. fastidiosa has revealed several genes possibly involved in the pathogenicity mechanisms of this bacterium, among them, an operon containing nine genes possibly involved in the synthesis of an exopolisaccharide named fastidian gum. This gum is possibly involved in the bacterial biofilm maintenance that causes the xylem occlusion leading to CVC symptoms development. To study this operon, named gum operon, vectors were constructed to inactivate the gumB, gumD and gumF genes by two strategies, insertion.duplication mutagenesis and allelic exchange mutagenesis. The insertion.duplication mutagenesis involves the integration a whole plasmid containing a truncated copy of the target gene by homologous recombination with one crossing over. The allelic exchange mutagenesis involves homologous recombination with two crossing overs that substitutes the wild.type copy of the target gene by a truncated copy interrupted by a selectable marker gene. No gum mutant was obtained using the allelic exchange strategy; however gumB and gumF mutants were obtained by insertion-duplication mutagenesis strategy. GumD mutant was not obtained, suggesting that the mutation in this gene is lethal to the cell. Analysis of cells and colonies of these mutants growing in solid media and in suspension hasn't reveal any morphological difference to the wild.type strain. The disruption of the gumB and gumF genes does not influenced the adhesion capacity of X. fastidiosa to the glass, used as a substrate. Using the reporter gene CAT, wich codes for cloramphenicol acetil transferase enzime confering resistance to cloramphenicol, we verified that glucose has no influence in the expression of this operon at the transcription level. Using this reporter gene, we also identified a transcribed region directed by a non characterized promoter, localized in the antisense strand of the gum operon. A comparison between the soluble protein profile of the mutants and the wild.type strain, obtained by liquid chromatography, showed significative differences, indicating a pleiotropic effect of these mutations. The study of the function of the gumB and gumF genes in the pathogenicity of X. fastidiosa was not concluded because we verified recently that the strainm, used to generate the mutants, do not colonize the plants efficiently to induce symptoms in citrus and tobacco plants after mechanical inoculation.

Introdução: Enterococcus resistente à vancomicina (VRE do inglês Vancomycin Resistant Enterococcus) é uma importante causa de infecção relacionada a assistência à saúde com alta morbidade e mortalidade principalmente nos pacientes imunocomprometidos sendo a segunda causa mais comum de infecções hospitalares nessa população de pacientes em alguns centros. O uso prolongado da terapia antimicrobiana com vancomicina e outras drogas, são fatores de risco associados com a disseminação desse patógeno. Além disso, espécies de enterococos podem apresentar fatores de virulência tais como: substância de agregação (asa1), gelatinase (gelE), citolisina (cylA), proteína de superfície enterococo (esp) e hidrolase glicosil (hylefm). Entretanto, o papel da virulência na colonização e infecção por VRE é controverso. Objetivos: Avaliar o perfil clonal, virulência e resistência de 86 isolados de VRE (80 E. faecium e 06 E. faecalis) de infecção e colonização de 76 pacientes com doenças hematológicas e/ou submetidos a transplante de Medula Óssea (TMO) internados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) no período de 10 anos (2005-2014). Material e Métodos: Foram realizadas concentração inibitória mínima para: vancomicina, teicoplanina, linezolida, gentamicina e estreptomicina em alta concentração (HLAR); Avaliação da clonalidade por eletroforese em campo pulsado (PFGE); Detecção dos mecanismos de resistência (vanA e vanB) e de virulência (esp, asa1, gelE, cylA e hylefm) pela técnica de PCR e sequenciamento total do genoma de dezoito isolados selecionados de acordo com a clonalidade. Foi criado um banco de dados no programa Epiinfo (CDC) com variáveis clinicas e demográficas dos pacientes. A proporção de isolados de colonização portadores de genes de virulência foi comparada com os isolados de infecção assim como a proporção de isolados de infecção portadores de genes de virulência que evoluíram para óbito. O valor de p < 0,005 foi considerado significativo. Resultados: Trinta e quatro pacientes eram colonizados e 42 infectados por VRE (28 eram infecção de corrente sanguínea), 48 pacientes eram transplantados dos quais 32 eram alogênicos. A mortalidade em 14 dias foi de 21.0% e durante a hospitalização de 53.9%. Todos os isolados foram resistentes à vancomicina e 87,3% à teicoplanina. Resistência a gentamicina e estreptomicina em alta concentração (HLAR) foi observada em 08 e 59 isolados respectivamente. Um isolado apresentou resistência a linezolida identificado pela primeira vez na unidade. O gene vanA foi detectado em todos os isolados. Quanto aos genes de virulência, 96,5% de isolados foram positivos para o gene esp e 69,8% para os genes gelE e asa1. Isolados de infecção de E. faecium carrearam mais genes de virulência: esp (100%), gelE (80,0%) e asa1 (75,5%) e o gene gelE foi significativamente mais frequente entre isolados de infecção que de colonização (p=0,008). Infecções causadas por isolados de E. faecium positivos para o gene asa1 foram significantemente associadas com maior mortalidade (p < 0,05). Quinze diferentes Pulsed field type (PFT) foram observados entre os isolados de E. faecium e 06 entre os isolados de E. faecalis. Dezessete E. faecium foram sequenciados e diferentes sequencias tipo (ST) foram observadas (ST412, ST478, ST78 e ST896) já descritas em outros estudos no Brasil. O isolado resistente a linezolida apresentou mutação no domínio V do gene 23S rRNA com um perfil alélico diferente, caracterizando um novo ST (ST987) descrito pela primeira vez no Brasil. Todos os ST observados nos isolados de E. faecium pertencem ao complexo clonal 17, dos quais dois STs (ST963, ST792) foram descritos pela primeira vez no país. O isolado de E. faecalis sequenciado pertencia ao ST9 e ao complexo clonal 9 já descrito por outros autores. Conclusão: Nosso estudo observou que E. faecium foi predominante em nosso hospital e os ST circulantes pertenciam ao CC17. Os isolados de infecção foram mais virulentos que os isolados de colonização e o gene gelE foi significativamente mais frequente nos isolados de infecção. Infecções causadas por isolados de E. faecium positivos para o gene asa1 foram associadas com a alta mortalidade. Este achado pode ser útil para controlar a disseminação de E. faecium no ambiente hospitalar e em pacientes hematológicos / Introduction: Vancomycin Resistant Enterococcus (VRE) is a important cause of health care-associated infection with high morbidity and mortality, mainly in immunocompromised patients, being the second most common cause of hospital infections in this population of patients in some centers. Prolonged use of antimicrobial therapy with vancomycin and other drugs are risk factors associated with the spread of this pathogen. In addition, enterococcal species may present virulence factors such as: aggregation substance (asa1), gelatinase (gelE), cytolysin (cylA), enterococcal surface protein (esp) and glycosyl hydrolase (hylefm). However, the role of virulence on VRE colonization and infection is controversial. Objectives: To evaluate the clonal profile, virulence and resistance of 86 isolates of VRE (80 E. faecium and 06 E. faecalis) from infection and colonization of 76 patients with hematological diseases and / or submitted to bone marrow transplantation (BMT) at Hospital das Clinics of the Medical School of the University of São Paulo (HC-FMUSP) in the period of 10 years (2005-2014). Material and Methods: Minimum inhibitory concentration to vancomycin, teicoplanin, linezolid, gentamicin and streptomycin in high concentration (HLAR) was performed; Clonality of isolates by pulsed field electrophoresis (PFGE) was evaluated; Detection of resistance (vanA and vanB) and virulence (esp, asa1, gelE, cylA and hylefm) genes by PCR technique and whole genome sequencing of eighteen isolates selected based on clonality. Results: All isolates were resistant to vancomycin and 87.3% to teicoplanin. Resistance to gentamicin and streptomycin in high concentration (HLAR) was observed in 08 and 59 isolates respectively. One isolate presented resistance to linezolid observed for the first time in the unit. The vanA gene was detected in all isolates. Regarding virulence genes, 96.5% of isolates were positive for the esp gene and 69.8% for the gelE and asa1 genes. Isolates of E. faecium infection carried more virulence genes: esp (100%), gelE (80.0%) and asa1 (75.5%) and gelE gene was significantly more frequent among infection isolates than colonization (p = 0.008). Infections caused by E. faecium isolates carrying the asa1 gene were significantly associated with higher mortality (p < 0.05). Fifteen different Pulsed field type (PFT) were observed among the isolates of E. faecium and 06 among E. faecalis isolates. Seventeen E. faecium were sequenced and the following sequences type (ST) were observed (ST412, ST478, ST78 and ST896) all of them already described in Brazil. The linezolid-resistant isolate showed the 23S gene Vdomain mutation with a different allelic profile, characterizing a new ST (ST987) described for the first time in our study. All STs observed in E. faecium isolates belong to clonal complex 17. Two other STs (ST963, ST792) were identified for the first time in the country. The E. faecalis isolate belong to ST9 and clonal complex 9 already described by other authors in Brazil. Conclusion: Our study observed that E. faecium was predominant in our hospital and the circulating STs belonged to CC17 a virulent lineage. E. faecium infection isolates were more virulent than colonization isolates and harbored significantly more gelE gene. It appears that infections caused by E. faecium isolates carrying asa1 gene evolved more frequently to death. This finding may be useful to control the spread of E. faecium in the hospital environment and in haematological patients

Partindo da concepção de que a ciência é, por definição, uma atividade coletiva, organizada localmente e através de instituições, esta dissertação realiza um estudo empírico do Centro de Estudos do Genoma Humano (CEGH), situado na Universidade de São Paulo. A pergunta mais geral do trabalho diz respeito à maneira pela qual se dá a organização social da produção de conhecimento e da produção de produtores de conhecimento em uma área específica de pesquisa a genética em um país periférico. Para isso, parte-se do processo de institucionalização da pesquisa em genética no Brasil, enfatizando os arranjos entre pesquisadores, universidade e agência de fomento em três aspectos considerados essenciais à atividade científica: padrão de financiamento, padrão disciplinar e padrão de circulação internacional de ideias e pesquisadores. A preocupação central é compreender a dinâmica da disciplina, pensada como um conjunto de processos sociais de produção de conhecimentos (e não como uma lista de descobrimentos, acumuladas por homens singulares), e demonstrar como a institucionalização da pesquisa em genética foi conformando uma tradição local de pesquisa. Essa tradição servirá como pano de fundo para compreender a incorporação das mudanças na pesquisa em genética humana passagem da genética clássica à molecular nos laboratórios que atualmente compõem o CEGH e as transformações no padrão de financiamento da pesquisa. Ao olhar para o CEGH, a partir dessa tradição científica local da qual ele é tributário, é possível descrever quais são os atuais arranjos organizacionais, as práticas de pesquisa e a divisão do trabalho que remodelam e atualizam essa tradição. Este trabalho considera o CEGH como um microcosmo social, que faz parte de um espaço disciplinar mais amplo que, por sua vez, insere-se no universo hierarquizado das áreas de conhecimento e disciplinas científicas. / Starting from the understanding that science is, by definition, a collective activity, organized locally and through institutions, this dissertation carries out an empirical study on the Human Genome Research Center (HGRC), situated in the University of São Paulo (USP). The broader question of this study regards the way through which the social organizing of production of knowledge occurs, and the production of the producers of knowledge in a specific field of research genetics in a peripheral country. For this, we begin from the process of institutionalisation of the genetics research in Brazil, emphasizing the arrangement between researchers, university and funding agencies in three aspects considered essentials in scientific activities: funding pattern, disciplinary pattern and the pattern of international circulation of ideas and researchers. The main concern is to understand the dynamics of the discipline, conceived as an ensemble of social processes in the production of knowledge (and not as a list of discoveries accumulated by singular men), and demonstrate how the institutionalization of research in genetics conformed to a local research tradition. This tradition will serve as a background to comprehend the incorporation of changes in human genetics research the passage from classical genetics to molecular biology in laboratories which nowadays integrate the HGRC and the transformations in the patterns of research funding. By observing the HGRC from the perspective of this local scientific tradition, from which this research center is tributary, it is possible to describe what are the recent organizational arrangements, such as the practices of research and the division of labor which reshaped and updated this tradition. This dissertation considers the HGRC a social microcosm, which integrates a disciplinary space which, in turn, is inserted in the hierarchical universe of the fields of knowledge and scientific disciplines.

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Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-12-19T18:17:11Z No. of bitstreams: 1 LuisFelipeSchroederDissertacao2014.pdf: 2932891 bytes, checksum: 9867ac60d140318b946ef45528984bca (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-19T18:17:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuisFelipeSchroederDissertacao2014.pdf: 2932891 bytes, checksum: 9867ac60d140318b946ef45528984bca (MD5) Previous issue date: 2014-09-30 / There are different process being developed for cellulosic ethanol production, with possible different pretreatments with varying temperatures and pH, in addition to several biomasses can be used as the source of fermentable sugars. Among the important enzymes for deconstruction of plant biomass, stand out xylanases. These enzymes are responsible for deconstruction of the hemicellulose present in the structure of the plant cell walls. There are several ways to accomplish the identification of these enzymes: purification from an isolated microorganism is one. In this study, genomic and metagenomic approaches were used to carry out the prospection of the genes responsible for coding these enzymes. Clones from two libraries were used for detection and evaluation of activity on solid medium, supplemented with xylan and acid pretreated sugarcane bagasse. Nineteen clones of a goat rumen metagenomic library and five clones from an AB60 bacterium genomic library, with 15,000 clones constructed in this study, were selected initially. Fourteen clones from the metagenomic library were completely sequenced and their ORFs were analyzed. Four clones from the genomic library were partially sequenced and one clone had its sequence completely determined and 104 ORFs were obtained for all clones completely or partially sequenced ORFs were analyzed. Eleven ORFs showed some similarity to genes of importance for the degradation of complex polysaccharides. Among the most important ORFs and most likely to be related to the detected activity, are genes coding for ??-glucosidase, ??-xylosidase and ??-glucuronidase. Furthermore, also other ORFs with lower probability of relation with the activity or necessity to full sequencing of the clones for a few more conclusive analysis were identified. About 40% of the ORFs present in the rumen clones and 37.8% of the ORFs present in Acidobacteria clones showed similarity with hypothetical or uncharacterized proteins, which could be important in the activity detected. A ??-glucuronidase gene detected in a clone from the goat rumen metagenomic library was synthesized, its sequence was optimized for expression in Escherichia coli. However, in the present work, it was not possible to sub-cloning, made expression and purification of this enzyme. Some ORFs detected can be used for future studies of expression and characterization in order to improve knowledge about biotechnological potential present in the rumen and acidobacteria AB60, besides the ecological role of these microorganisms in their environment. / Existem diversos processos em desenvolvimento para a produ????o de etanol celul??sico, havendo diferentes poss??veis pr??-tratamentos, com temperaturas e pH variados, al??m das diversas biomassas que podem ser utilizadas como fonte de a????cares ferment??veis. Dentre as enzimas importantes para a desconstru????o de biomassa vegetal, destacam-se as xilanases. Estas enzimas s??o respons??veis pela desconstru????o da estrutura hemicelul??sica presente na parede celular das plantas. H?? diversas maneiras para alcan??ar a identifica????o destas enzimas: purifica????o a partir de micro-organismo isolado sendo uma delas. No presente trabalho, foram utilizadas abordagens gen??mica e metagen??mica a fim de realizar a prospec????o dos genes respons??veis pela codifica????o para estas enzimas. Foram utilizados clones oriundos de duas bibliotecas para a detec????o e avalia????o da atividade em meio s??lido suplementado com xilana e baga??o de cana-de-a????car pr??-tratado com ??cido. Dezenove clones de uma biblioteca metagen??mica de r??men de caprinos e cinco clones de uma biblioteca gen??mica da bact??ria AB60, com 15.000 clones constru??da no presente trabalho, foram selecionados inicialmente. Quatorze clones da biblioteca metagen??mica foram sequenciados completamente e tiveram as suas ORFs analisadas. Quatro clones da biblioteca gen??mica foram parcialmente sequenciados e um clone teve a sua sequ??ncia completa determinada e as ORFs analisadas. Das 104 ORFs obtidas de todos os clones completamente ou parcialmente sequenciados, onze ORFs apresentaram alguma similaridade com genes de import??ncia para a degrada????o de polissacar??deos complexos. Dentre as ORFs de maior import??ncia e com maior probabilidade de estarem relacionadas com a atividade detectada, est??o genes codificantes para ??-glicosidase, ??-xilosidase e ??-glicuronidase. Al??m disso, tamb??m foram identificadas outras ORFs com menor probabilidade de rela????o com a atividade ou necessidade de sequenciamento completo de alguns dos clones para uma an??lise mais conclusiva. Cerca de 40% das ORFs presentes nos clones selecionados de r??men e 37,8% das ORFs presentes nos clones selecionados de Acidobacteria apresentaram similaridade com prote??nas hipot??ticas ou prote??nas n??o caracterizadas que podem ter import??ncia na atividade detectada. Um gene de ??-glicuronidase detectado em um clone da biblioteca metagen??mica de r??men de caprino foi sintetizado, otimizando-se sua sequ??ncia para express??o em Escherichia coli . Entretanto, n??o foi poss??vel a sub-clonagem, express??o e purifica????o desta enzima no presente trabalho. Algumas ORFs detectadas podem ser utilizadas para estudos futuros de express??o e caracteriza????o a fim de aprimorar o conhecimento a respeito do potencial biotecnol??gico presente no r??men e na Acidobact??ria AB60, al??m do papel ecol??gico destes micro-organismos em seu ambiente.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-12-19T19:37:39Z No. of bitstreams: 1 FabiodeBarrosAmaralDissertacao2014.pdf: 2938215 bytes, checksum: 3d899bf568eeae36d21979ba7aafab3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-19T19:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FabiodeBarrosAmaralDissertacao2014.pdf: 2938215 bytes, checksum: 3d899bf568eeae36d21979ba7aafab3c (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / The equine chorionic gonadotropin (eCG) has been used as an important resource in the processes of reproduction in animals of economic interest, especially horses and cattle. The eCG molecule consists of a glycoprotein composed of two subunits called alpha and beta which together perform the function of both LH (luteinizing hormone) and FSH (follicle stimulating hormone) and due to this characteristic has great potential to induce ovulation in household species. Based on the aforementioned characteristics, the present work was was aimed at the study and characterization of the structure of eCG using molecular modeling techniques as well as testing its production in cells of the microorganism Pichia pastoris. Furthermore, chimeric models have been proposed linking the eCG and immunoglobulin G (IgG) molecule based on studies that reveal the great potential of it in raising the half-life of other molecules circulating in the organism. Four chimeric models were prepared so that the eCG alpha and beta chains are connected by a hinge, short and flexible regions, while the terminal region of the alpha chain was connected to the N-terminal portion of the CH2 domain of the IgG by another hinge region, thus resulting in a model in which two different molecules are linked. / A gonadotrofina cori??nica equina (eCG) tem sido um importante recurso usado nos processos de reprodu????o em animais de interesse econ??mico, principalmente equinos e bovinos. A mol??cula de eCG consiste em uma glicoprote??na composta de duas subunidades denominadas alfa e beta que juntas desempenham a fun????o tanto de LH (horm??nio luteinizante) como FSH (horm??nio fol??culo estimulante) e devido a essa caracter??stica possui um grande potencial para induzir a ovula????o em esp??cies dom??sticas. Baseando-se nas caracter??sticas citadas, o presente trabalho teve como objetivo estudar e caracterizar a estrutura do eCG utilizando-se t??cnicas de modelagem molecular assim como testar a sua produ????o em c??lulas do microrganismo Pichia pastoris. Al??m disso, foram propostos modelos quim??ricos ligando eCG ?? mol??cula de imunoglobulina G (IgG) tendo como base estudos que revelam o grande potencial da mesma em elevar a meia vida de outras mol??culas em circula????o no organismo. Quatro modelos quim??ricos foram apresentados de forma que as cadeias beta e alfa do eCG s??o conectadas por regi??es hinge que s??o sequ??ncias curtas e flex??veis da mol??cula enquanto que a regi??o terminal da cadeia alfa foi conectada por meio de outra regi??o hinge, ?? por????o N-terminal do dom??nio CH2 da IgG, portanto, resultando em um modelo em que est??o ligadas duas mol??culas diferentes.

Passiflora edulis, popularly known in Brazil as sour passion fruit is the most widely cultivated species of the genus Passiflora, and is of economic importance in Brazil for industrial production of juice and fresh fruit for consumption. Despite its economic importance, little research has been conducted on this species, even on the most basic aspects. To fill in this gap, our group conducted various genetic studies, including estimating levels of molecular polymorphism, studying quantitative loci that control fruit yield and quality, and mapping genes conferring resistance to bacterial spot disease caused by Xanthomonas axonopodis. In addition, to enhance our knowledge of the P. edulis genome, a genomic library inserted into bacterial artificial chromosomes (BAC) has been constructed (82,944 clones, with coverage of 6× the species\' haploid genome). The library is kept at the French Plant Genomic Resources Center (CNRGV/INRA) in Toulouse. Initially, some 10,000 BES (BAC-end sequences) were sequenced, generating approximately 6.2 Mb of genomic information and providing an initial overview of P. edulis genome in terms of gene content and repeat sequences. With the aim of obtaining more comprehensive information, it was decided to select around 100 BAC inserts for complete sequencing. The aim of this study was to carry out genomic analysis in order to elucidate the structural and functional annotation of the genes, and identify and characterize transposable elements. The data generated by fully sequencing 10.4 Mb of P. edulis provide a rich source of information which has been taken full advantage of in this doctoral thesis. / Passiflora edulis, popularmente conhecido como maracujá azedo, é a espécie do gênero Passiflora mais cultivada, tendo importância econômica no Brasil tanto para a produção de suco industrializado quanto para o consumo da fruta fresca. Apesar da relevância da espécie, faltam pesquisas, principalmente nas áreas básicas. Para superar isso, nosso grupo tem realizado diversos estudos genéticos que incluem a estimativa dos níveis de polimorfismos moleculares, o estudo de locos quantitativos envolvidos no controle da produção e qualidade dos frutos e o mapeamento de genes de resistência à mancha bacteriana causada por Xanthomonas axonopodis. Além disso, para conhecer o genoma de P. edulis, foi construída uma biblioteca genômica inserida em BACs (82.944 clones, com cobertura de 6× do genoma haploide da espécie) que é mantida no CNRGV/INRA em Toulouse, França. Inicialmente, cerca de 10.000 BES (BAC-end sequences) foram sequenciadas, gerando aproximadamente 6,2 Mb de informação genômica, fornecendo a primeira visão do genoma de P. edulis sobre o conteúdo de genes e da porção repetitiva. Com o objetivo de obter informações mais completas, decidiu-se selecionar cerca de 100 insertos de BACs para o sequenciamento completo. A análise genômica realizada, especialmente a anotação estrutural e funcional dos genes e a identificação e caracterização dos elementos de transposição, constituíram os objetivos deste estudo. Os dados gerados pelo sequenciamento completo de 10.4 Mb de P. edulis representam uma fonte rica de informações que foram exploradas nesta tese de doutorado.

Partindo da concepção de que a ciência é, por definição, uma atividade coletiva, organizada localmente e através de instituições, esta dissertação realiza um estudo empírico do Centro de Estudos do Genoma Humano (CEGH), situado na Universidade de São Paulo. A pergunta mais geral do trabalho diz respeito à maneira pela qual se dá a organização social da produção de conhecimento e da produção de produtores de conhecimento em uma área específica de pesquisa a genética em um país periférico. Para isso, parte-se do processo de institucionalização da pesquisa em genética no Brasil, enfatizando os arranjos entre pesquisadores, universidade e agência de fomento em três aspectos considerados essenciais à atividade científica: padrão de financiamento, padrão disciplinar e padrão de circulação internacional de ideias e pesquisadores. A preocupação central é compreender a dinâmica da disciplina, pensada como um conjunto de processos sociais de produção de conhecimentos (e não como uma lista de descobrimentos, acumuladas por homens singulares), e demonstrar como a institucionalização da pesquisa em genética foi conformando uma tradição local de pesquisa. Essa tradição servirá como pano de fundo para compreender a incorporação das mudanças na pesquisa em genética humana passagem da genética clássica à molecular nos laboratórios que atualmente compõem o CEGH e as transformações no padrão de financiamento da pesquisa. Ao olhar para o CEGH, a partir dessa tradição científica local da qual ele é tributário, é possível descrever quais são os atuais arranjos organizacionais, as práticas de pesquisa e a divisão do trabalho que remodelam e atualizam essa tradição. Este trabalho considera o CEGH como um microcosmo social, que faz parte de um espaço disciplinar mais amplo que, por sua vez, insere-se no universo hierarquizado das áreas de conhecimento e disciplinas científicas. / Starting from the understanding that science is, by definition, a collective activity, organized locally and through institutions, this dissertation carries out an empirical study on the Human Genome Research Center (HGRC), situated in the University of São Paulo (USP). The broader question of this study regards the way through which the social organizing of production of knowledge occurs, and the production of the producers of knowledge in a specific field of research genetics in a peripheral country. For this, we begin from the process of institutionalisation of the genetics research in Brazil, emphasizing the arrangement between researchers, university and funding agencies in three aspects considered essentials in scientific activities: funding pattern, disciplinary pattern and the pattern of international circulation of ideas and researchers. The main concern is to understand the dynamics of the discipline, conceived as an ensemble of social processes in the production of knowledge (and not as a list of discoveries accumulated by singular men), and demonstrate how the institutionalization of research in genetics conformed to a local research tradition. This tradition will serve as a background to comprehend the incorporation of changes in human genetics research the passage from classical genetics to molecular biology in laboratories which nowadays integrate the HGRC and the transformations in the patterns of research funding. By observing the HGRC from the perspective of this local scientific tradition, from which this research center is tributary, it is possible to describe what are the recent organizational arrangements, such as the practices of research and the division of labor which reshaped and updated this tradition. This dissertation considers the HGRC a social microcosm, which integrates a disciplinary space which, in turn, is inserted in the hierarchical universe of the fields of knowledge and scientific disciplines.