A perda auditiva é o defeito mais comum ao nascimento e cerca de 70 milhões de pessoas no mundo apresentam algum grau de perda auditiva. Além da alta incidência, as implicações da perda auditiva na linguagem, na cognição e no desenvolvimento emocional e social reforçam sua importância. No entanto, em grande parte dos pacientes, a causa da deficiência auditiva não é esclarecida. Nós usamos hibridação comparativa do genoma baseada em arrays (Array Comparative Genomic Hybridization aCGH) para investigar alterações no número de cópias de segmentos de DNA (Copy Number Variation CNV) em 31 indivíduos que apresentavam deficiência auditiva e sinais clínicos adicionais, mas que não puderam ser classificados em síndrome conhecida. A escolha de indivíduos sindrômicos se baseou no pressuposto de que, em média, apresentam alterações genômicas maiores e, portanto, mais provavelmente detectáveis com o uso de aCGH de 1 Mb, que era a plataforma disponível no início do projeto. CNVs não descrita em bancos de dados de indivíduos normais foram identificadas em oito pacientes, quatro delas ocorreram de novo enquanto as outras quatro foram herdadas de um genitor fenotipicamente normal. As alterações de novo definem segmentos cromossômicos que provavelmente contém genes relacionados à deficiência auditiva e sensíveis a dose, especificamente: 1q23.3-q25.2, 2q22q23, 6p25.3 e 11q13.2-q13.4. As alterações raras identificadas tanto nos pacientes quanto em um genitor normal poderiam ser um evento ao acaso, sem papel na deficiência auditiva; no entanto, a possibilidade de que essas alterações possam funcionar como fatores de predisposição não podem ser descartadas. Se considerarmos apenas as CNVs de novo como causativas dos fenótipos investigados, detectamos quatro pacientes portadores entre os 31 investigados (13%). Se considerarmos também as CNVs herdadas como possivelmente causativas, a taxa de desequilíbrios cromossômicos associados à surdez será de 26%. Esses resultados são provavelmente uma substimativa e esses números seriam possivelmente maiores com o uso de uma das plataformas de alta resolução disponíveis atualmente. Esses resultados, embora limitados, indicam que investigação por aCGH em pacientes com surdez sindrômica idiopática está entre os testes mais eficientes para detectar etiologia dos fenótipos, devendo ser incorporado à rotina no diagnóstico e aconselhamento genético. / Hearing loss is the most common congenital deficiency and about 70 million people worldwide present some degree of hearing impairment. In addition to its high incidence, hearing loss impacts language, cognition and social and emotional development. However, in a large proportion of patients, the cause of the hearing deficiency cannot be elucidated. We screened copy number changes by 1 Mb-array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) in 31 individuals with syndromic hearing impairment whose clinical features were untypical for known disorders. The choice of evaluating syndromic rather than non-syndromic individuals was based on the assumption that they are more likely to carry larger genomic alterations which could be more easily detected by the comparatively low resolution 1 Mb aCCG, which was the available platform when this project started. Copy number changes (CNV) not documented in the database of normal individuals were detected in eight patients, four de novo imbalances and four inherited from a normal parent. The de novo alterations define candidate chromosome segments likely to harbor dosage sensitive genes related to hearing impairment, namely 1q23.3-q25.2, 2q22q23, 6p25.3 and 11q13.2- q13.4. The rare imbalances also present in normal parents might be casually associated with hearing impairment, but also have a possible role as a predisposition factor. When only the de novo CNVs were considered causative for the disease phenotypes, our study revealed relevant copy number changes in 4 patients (13%). If we also count the rare CNVs that had been inherited as possibly causative, the frequency of chromosome imbalances associated with syndromic deafness in our sample becomes 26%. These figures are probably underestimates and will probably become larger when high resolution oligoarray platforms are applied. These results indicate that aCGH is an efficient tool for defining the etiology of syndromic deafness and its use in routine diagnosis of hearing impairment and for genetic counseling is highly recommended.

Introdução: Enterococcus resistente à vancomicina (VRE do inglês Vancomycin Resistant Enterococcus) é uma importante causa de infecção relacionada a assistência à saúde com alta morbidade e mortalidade principalmente nos pacientes imunocomprometidos sendo a segunda causa mais comum de infecções hospitalares nessa população de pacientes em alguns centros. O uso prolongado da terapia antimicrobiana com vancomicina e outras drogas, são fatores de risco associados com a disseminação desse patógeno. Além disso, espécies de enterococos podem apresentar fatores de virulência tais como: substância de agregação (asa1), gelatinase (gelE), citolisina (cylA), proteína de superfície enterococo (esp) e hidrolase glicosil (hylefm). Entretanto, o papel da virulência na colonização e infecção por VRE é controverso. Objetivos: Avaliar o perfil clonal, virulência e resistência de 86 isolados de VRE (80 E. faecium e 06 E. faecalis) de infecção e colonização de 76 pacientes com doenças hematológicas e/ou submetidos a transplante de Medula Óssea (TMO) internados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) no período de 10 anos (2005-2014). Material e Métodos: Foram realizadas concentração inibitória mínima para: vancomicina, teicoplanina, linezolida, gentamicina e estreptomicina em alta concentração (HLAR); Avaliação da clonalidade por eletroforese em campo pulsado (PFGE); Detecção dos mecanismos de resistência (vanA e vanB) e de virulência (esp, asa1, gelE, cylA e hylefm) pela técnica de PCR e sequenciamento total do genoma de dezoito isolados selecionados de acordo com a clonalidade. Foi criado um banco de dados no programa Epiinfo (CDC) com variáveis clinicas e demográficas dos pacientes. A proporção de isolados de colonização portadores de genes de virulência foi comparada com os isolados de infecção assim como a proporção de isolados de infecção portadores de genes de virulência que evoluíram para óbito. O valor de p < 0,005 foi considerado significativo. Resultados: Trinta e quatro pacientes eram colonizados e 42 infectados por VRE (28 eram infecção de corrente sanguínea), 48 pacientes eram transplantados dos quais 32 eram alogênicos. A mortalidade em 14 dias foi de 21.0% e durante a hospitalização de 53.9%. Todos os isolados foram resistentes à vancomicina e 87,3% à teicoplanina. Resistência a gentamicina e estreptomicina em alta concentração (HLAR) foi observada em 08 e 59 isolados respectivamente. Um isolado apresentou resistência a linezolida identificado pela primeira vez na unidade. O gene vanA foi detectado em todos os isolados. Quanto aos genes de virulência, 96,5% de isolados foram positivos para o gene esp e 69,8% para os genes gelE e asa1. Isolados de infecção de E. faecium carrearam mais genes de virulência: esp (100%), gelE (80,0%) e asa1 (75,5%) e o gene gelE foi significativamente mais frequente entre isolados de infecção que de colonização (p=0,008). Infecções causadas por isolados de E. faecium positivos para o gene asa1 foram significantemente associadas com maior mortalidade (p < 0,05). Quinze diferentes Pulsed field type (PFT) foram observados entre os isolados de E. faecium e 06 entre os isolados de E. faecalis. Dezessete E. faecium foram sequenciados e diferentes sequencias tipo (ST) foram observadas (ST412, ST478, ST78 e ST896) já descritas em outros estudos no Brasil. O isolado resistente a linezolida apresentou mutação no domínio V do gene 23S rRNA com um perfil alélico diferente, caracterizando um novo ST (ST987) descrito pela primeira vez no Brasil. Todos os ST observados nos isolados de E. faecium pertencem ao complexo clonal 17, dos quais dois STs (ST963, ST792) foram descritos pela primeira vez no país. O isolado de E. faecalis sequenciado pertencia ao ST9 e ao complexo clonal 9 já descrito por outros autores. Conclusão: Nosso estudo observou que E. faecium foi predominante em nosso hospital e os ST circulantes pertenciam ao CC17. Os isolados de infecção foram mais virulentos que os isolados de colonização e o gene gelE foi significativamente mais frequente nos isolados de infecção. Infecções causadas por isolados de E. faecium positivos para o gene asa1 foram associadas com a alta mortalidade. Este achado pode ser útil para controlar a disseminação de E. faecium no ambiente hospitalar e em pacientes hematológicos / Introduction: Vancomycin Resistant Enterococcus (VRE) is a important cause of health care-associated infection with high morbidity and mortality, mainly in immunocompromised patients, being the second most common cause of hospital infections in this population of patients in some centers. Prolonged use of antimicrobial therapy with vancomycin and other drugs are risk factors associated with the spread of this pathogen. In addition, enterococcal species may present virulence factors such as: aggregation substance (asa1), gelatinase (gelE), cytolysin (cylA), enterococcal surface protein (esp) and glycosyl hydrolase (hylefm). However, the role of virulence on VRE colonization and infection is controversial. Objectives: To evaluate the clonal profile, virulence and resistance of 86 isolates of VRE (80 E. faecium and 06 E. faecalis) from infection and colonization of 76 patients with hematological diseases and / or submitted to bone marrow transplantation (BMT) at Hospital das Clinics of the Medical School of the University of São Paulo (HC-FMUSP) in the period of 10 years (2005-2014). Material and Methods: Minimum inhibitory concentration to vancomycin, teicoplanin, linezolid, gentamicin and streptomycin in high concentration (HLAR) was performed; Clonality of isolates by pulsed field electrophoresis (PFGE) was evaluated; Detection of resistance (vanA and vanB) and virulence (esp, asa1, gelE, cylA and hylefm) genes by PCR technique and whole genome sequencing of eighteen isolates selected based on clonality. Results: All isolates were resistant to vancomycin and 87.3% to teicoplanin. Resistance to gentamicin and streptomycin in high concentration (HLAR) was observed in 08 and 59 isolates respectively. One isolate presented resistance to linezolid observed for the first time in the unit. The vanA gene was detected in all isolates. Regarding virulence genes, 96.5% of isolates were positive for the esp gene and 69.8% for the gelE and asa1 genes. Isolates of E. faecium infection carried more virulence genes: esp (100%), gelE (80.0%) and asa1 (75.5%) and gelE gene was significantly more frequent among infection isolates than colonization (p = 0.008). Infections caused by E. faecium isolates carrying the asa1 gene were significantly associated with higher mortality (p < 0.05). Fifteen different Pulsed field type (PFT) were observed among the isolates of E. faecium and 06 among E. faecalis isolates. Seventeen E. faecium were sequenced and the following sequences type (ST) were observed (ST412, ST478, ST78 and ST896) all of them already described in Brazil. The linezolid-resistant isolate showed the 23S gene Vdomain mutation with a different allelic profile, characterizing a new ST (ST987) described for the first time in our study. All STs observed in E. faecium isolates belong to clonal complex 17. Two other STs (ST963, ST792) were identified for the first time in the country. The E. faecalis isolate belong to ST9 and clonal complex 9 already described by other authors in Brazil. Conclusion: Our study observed that E. faecium was predominant in our hospital and the circulating STs belonged to CC17 a virulent lineage. E. faecium infection isolates were more virulent than colonization isolates and harbored significantly more gelE gene. It appears that infections caused by E. faecium isolates carrying asa1 gene evolved more frequently to death. This finding may be useful to control the spread of E. faecium in the hospital environment and in haematological patients

Os mosquitos (Culicidae) compreendem um grupo monofilético, mas algumas relações dentro da família ainda não estão totalmente resolvidas. O objetivo deste trabalho foi elaborar uma hipótese filogenética para os gêneros de Culicidae baseada nos caracteres de variabilidade genética e perfil proteico. Além disso, foi analisado como a forma da asa evoluiu dentro desse grupo. Utilizou-se 76 espécies diferentes abrangendo 20 gêneros. O formato alar mostrou-se um bom marcador taxonômico, já que as análises em cada tribo ou gênero revelaram grupos naturais. Análises com genes nucleares mostraram Anophelinae como grupo irmão de todos os outros Culicinae. A topologia construída com genomas mitocondriais revelou grupos bem suportados, com alguns discordantes da filogenia atual. Foram identificados 24 biomarcadores nas espécies analisadas usando espectrometria MALDI-TOF, que podem ter potencial na identificação taxonômica. A morfologia, a genética e os perfis proteicos não foram concordantes, e isso pode estar ocorrendo devido a taxas evolutivas distintas entre eles. / Mosquitoes (Culicidae) comprise a monophyletic group, but some relationships within the family are not fully resolved. The aim of this study was to elaborate a phylogenetic hypothesis for the genera Culicidae based on the characters of genetic variability and protein profile. In addition, it was analyzed how wing shape evolved within this group. It was used 76 different species covering 20 genera. The wing shape showed to be a good taxonomic marker, because the analyzes in each tribe or genus revealed natural groups. Analyzes with nuclear genes showed Anophelinae as sister group of all other Culicinae. The topology constructed with mitochondrial genomes revealed well supported groups, with some discordant of the current phylogeny. Twenty-four biomarkers were identified in the species analyzed using MALDI-TOF spectrometry, which may have potential in taxonomic identification. Morphology, genetics, and protein profiles were inconsistent, and this may be occurring due to distinct evolutionary rates between them.

Diferentes métodos de caracterização e inferências filogenéticas baseadas na seqüência de alguns genes nucleares indicam que Typanosoma cruzi pode ser dividido em dois grupos principais, denominados T. cruzi I e T. cruzi II. Outros subgrupos de isolados foram descritos, tais como grupo de rDNA 1/2 e zimodema 3 (Z3) cuja relação filogenética com os grupos T.cruzi I e T.cruzi II ainda não está clara. O cariótipo molecular é uma ferramenta que permite abordar diferentes aspectos do genoma de organismos. Neste trabalho, caracterizamos o cariótipo molecular de 22 isolados de T. cruzi a partir da separação de seus cromossomos por eletroforese de campo pulsado e hibridação com sondas que representam genes codificadores de proteína e de RNA. Verificamos extenso polimorfismo cromossômico entre os isolados e que isolados pertencentes aos grupos T. cruzi II, rDNA 1/2 e Z3 têm cromossomos de tamanho molecular maior (até 3,5 Mb) em relação a isolados de T. cruzi I (até 2,8 Mb). Os dados do cariótipo molecular também foram utilizados para averiguar o significado evolutivo do polimorfismo cromossômico. As análises fenéticas foram baseadas no índice de diferença absoluta de tamanho cromossômico (aCSDI) obtido a partir da hibridação dos cromossomos com um número variável de marcadores genéticos. Inicialmente analisamos nove isolados, classificados por diferentes abordagens moleculares nos gruposT. cruzi I, T. cruzi II e grupo de rDNA 1/2, este último considerado um grupo de isolados híbridos e incluído por alguns autores no grupo T. cruzi II. Dendrogramas de aCSDI obtidos a partir de 3 a 21 sondas definiram em todos os casos três grupos: dois correspondentes a T. cruzi I e T. cruzi II e um terceiro, ao grupo de rDNA 1/2. O isolado CL Brener - organismo de referência do Projeto Genoma deT. cruzi - ora agrupou com T. cruzi II ora com o grupo de rDNA 1/2, ilustrando seu caráter híbrido. Três grupos também foram observados no dendrograma construído com dados de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) hibridados com dezoito sondas. A topologia dos dendrogramas de dados de cariótipo molecular e de RFLP é similar, com um coeficiente de correlação significante (r = 0.86062; P < 0.0001), corroborando uma forte estruturação dos grupos. Subseqüentemente, avaliamos a posição de isolados de Z3 em relação aos três grupos acima mencionados, uma vez que alguns autores situam Z3 no grupo T. cruzi II. Analisamos o padrão de hibridação de 9 sondas com os cromossomos de 19 isolados (oito de Z3, três de T. cruzi I, três de T. cruzi II e cinco de rDNA 1/2). A topologia dos dendrogramas mostrou quatro grupos correspondentes, respectivamente, a T. cruzi I, T. cruzi II, grupo de rDNA 1/2 + CL Brener e Z3 (oito dos nove isolados). Este estudo também revelou que isolados híbridos têm uma maior proporção de cromossomos homólogos de tamanhos diferentes em comparação com isolados não híbridos. De um modo geral, nossos resultados mostram que cromossomos são caracteres valiosos para a identificação de táxons em T. cruzi. Uma vez que isolados do grupo de rDNA 1/2 apresentam cistrons ribossômicos de tipo 1 e de tipo 2, caracterizamos a distribuição dos cistrons nas bandas cromossômicas destes isolados. Verificamos que a fração majoritária dos genes de rDNA do tipo 2 está localizada na banda de 1,5 Mb e que os cistrons do tipo 1 estão localizados principalmente na banda de 1,1 Mb. Também estimamos o número de cromossomos e tamanho do genoma de quatro isolados de T. cruzi , com base na análise densitométrica da intensidade de fluorescência dos cromossomos corados com SYBR Green I. Para esta finalidade idealizamos um modelo matemático que permitiu estimar 52, 65, 72 e 44 cromossomos (na célula 2N), respectivamente, para CL Brener, Esmeraldo cl3, SO3 cl5 e Silvio X10 cl1. O tamanho do genoma dos isolados foi calculado, respectivamente em, 70 Mb, 78 Mb, 94,7 Mb e 47 Mb. Os novos aspectos do cariótipo molecular de T. cruzi aqui apresentados contribuirão para a compreensão da organização do genoma deste parasita e auxiliarão na atribuição de arcabouços de genes (scaffolds) aos cromossomos de CL Brener. / Different typing methods and phylogenetic inference based on the nucleotide sequence of few nuclear genes indicate that Trypanosoma cruzi can be divided into two major groups named as T. cruzi I and T. cruzi II. Additional subgroups of isolates have been described, such as group of rDNA 1/2 and zymodeme 3 (Z3), whose phylogenetic relationships with the T. cruzi I and T. cruzi II groups is not clear. The molecular karyotype is a tool that allows investigation of particular aspects of the genome of organisms. In this study, we have characterized the molecular karyotype of 22 isolates following the separation of chromosomes by pulsed-field gel electrophoresis and hybridization with probes that represent genes coding for proteins or RNA species. We observed an extensive chromosome polymorphism between the isolates and that isolates typed as T. cruzi II, rDNA 1/2 and Z3 have chromosome of larger molecular size (up to 3.5 Mb) in relation to T. cruzi I isolates (up to 2.8 Mb). Data from molecular karyotype have been also used to verify the evolutionary meaning of chromosome polymorphism. The phenetic analyses were based on the absolute chromosomal size difference index (aCSDI), calculated from the hybridization of a variable number of genetic markers. Initially, we analyzed nine isolates, classified by different molecular approaches into T. cruzi I,T. cruzi II and rDNA 1/2 groups. This latter group has been considered of hybrid genotypes and has been included by some authors in the T. cruzi II group. aCSDI-based dendrograms obtained from 3 to 21 probes defined in all the cases three clusters: two corresponding, respectively, to T. cruzi I and T. cruzi II groups; and a third one, to rDNA group 1/2. CL Brener - the reference organism of the T. cruzi Genome Project - was alternatively positioned in T. cruzi II or rDNA 1/2 group clusters, illustrating the hybrid nature of this isolate. Three clusters were also observed in the dendrogram constructed with restriction fragment length polymorphism (RFLP) data from 18 probes. The topology of the chromosome and RFLP dendrograms is similar, with a significant correlation coefficient (r = 0.86062; P < 0.0001), supporting a strong structuring of the clusters. Subsequently we evaluated the position of Z3 isolates in relation to the above-mentioned groups, because some authors clustered Z3 with T. cruzi II group. For this purpose we determined the hybridization pattern of 9 probes with the chromosomes of 19 isolates (eight of Z3; three of T. cruzi I; three of T. cruzi II and five of rDNA 1/2). The topology of the aCSDI-based dendrograms showed four clusters corresponding, respectively, to T. cruzi I, T. cruzi II, rDNA 1/2 + CL Brener and Zymodeme 3 (eight out of nine isolates). This study also revealed that hybrid stocks have a larger proportion of two different-sized homologous chromosomes, as compared with non-hybrid. Overall, our results show that chromosomes are valuable characters for identification of evolutionary groups in T. cruzi. Because rDNA 1/2 isolates have ribosomal cistrons of type 1 and type 2, we have characterized the distribution of both cistrons in the chromosomal bands of these isolates. We verified that the majority of type-2 rDNA genes are localized in a 1.5 Mb band, whereas type-1 cistrons are mostly concentrated in a 1.1 Mb band. We have also estimated the number of chromosomes and genome size of four T. cruzi isolates, based on the densitometric analysis of the fluorescence intensity of chromosomes stained with SYBR Green I. For this purpose, we devised a mathematical model that allowed estimating 52, 65, 72 and 44 chromosomes (2N cell), respectively, in CL Brener, Esmeraldo cl3, SO3 cl5 and Silvio X10 cl1. The genome size in these isolates has been calculated, respectively, as 70 Mb, 78 Mb, 94,7 Mb and 47 Mb. The novel aspects of T. cruzi karyotype here presented contribute to the comprehension of the genome organization of this parasite and will assist the assignment of scaffold to the CL Brener chromosomes.

O parasita protozoário Leishmania apresenta um genoma plástico e dinâmico onde a amplificação gênica e translocações cromossomais são fenômenos comuns. Tal plasticidade sugere a necessidade de mecanismos robustos de reparo do DNA e de manutenção do genoma. A célula eucariótica desenvolveu sistemas de controle checkpoint que reconhecem estruturas alteradas de DNA e bloqueiam a progressão do ciclo celular permitindo que o reparo do DNA aconteça. Nestas células, o complexo heterotrimérico formado pelas proteínas Hus1, Rad9, e Rad1 participa nas etapas iniciais de reconhecimento e sinalização do estresse replicativo. Neste trabalho mostramos que a proteína Hus1 homóloga de Leishmania major é uma proteína nuclear que melhora a capacidade do parasito em lidar com o estresse replicativo. A análise de northern e PCR em tempo real mostraram que, após a transfecção do gene, a linhagem selecionada apresenta níveis aumentados dos transcritos LmHUS1. A utilização de um anticorpo anti-LmHus1 demonstrou o aumento nos níveis da proteína nestas células. Ainda, a superexpressão de LmHus1 confere resistência às drogas genotóxicas hidroxiuréia (HU) e metil metanosulfonato (MMS), e a resistência à HU correlaciona-se com a redução de dano no DNA após a expressão da LmHus1. A ruptura de um dos alelos LmHUS1 diminui os níveis do seu produto, compromete o crescimento do parasito e proporciona discreta diminuição na resistência às drogas genotóxicas. Resultados preliminares associam a expressão da LmHus1 ao fenômeno de amplificação gênica em L. major. Além disso, a possível quinase Chk1, efetora da sinalização iniciada em Hus1, foi clonada e transfectada no parasito, o anticorpo anti-Chk1 também foi produzido. Finalmente, considerando que LmHus1 funcione na detecção do dano e controle de defeitos na replicação de DNA, formulamos a hipótese de que o produto deste gene atue na forquilha de replicação e participe no fenômeno de rearranjo do DNA e na formação de amplicons neste parasito. / The protozoan parasite Leishmania presents a dynamic and plastic genome in which gene amplification and chromosome translocations are common phenomena. Such plasticity hints at the necessity of dependable genome maintenance pathways. Eukaryotic cells have evolved checkpoint control systems that recognize altered DNA structures and halt cell cycle progression allowing DNA repair to take place. In these cells, the PCNA-related heterotrimeric complex formed by the proteins Hus1, Rad9, and Rad1 is known to participate in the early steps of replicative stress sensing and signaling. Here we show that the Hus1 homolog of Leishmania major is a nuclear protein that improves the cell capability to cope with replicative stress. Northern analysis and real-time PCR showed that after transfection of the gene, the selected lineage presents increase in the LmHUS1 transcripts levels and overexpression was confirmed using anti-LmHus1. Thus, overexpression of LmHus1 confers resistance to the genotoxic drugs hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) and resistance to HU correlates to reduced net DNA damage upon LmHus1 expression. Preliminary results associate the LmHus1 expression to the gene amplification phenomena in L. major. And a possible Chk1-like kinase was cloned and transfected into the parasite, the anti-Chk1 was also produced. Besides, LmHus1 mutant is presented, and the LmHUS1 gene disruption decreases its product levels, leads to serious effects on growth, and presenting an slight decrease in the resistance to genotoxic drugs. Finally, considering the hypothesis that LmHus1 participates in the damage sensing and in the control of the DNA replication threats, we hypothesized that the product of this gene acts in replication forks and is involved in DNA rearrangement s and in the amplicons generation in this parasite.

O zika é um arbovírus emergente. Há evidências para a relação entre o zika e a microcefalia congênita e também com a síndrome de Guillain-Barre. Várias características do vírus são importantes, como a persistência do vírus no sêmen por vários meses, transmissão sexual e evidência de transmissão pré-natal. As mães grávidas infectadas com zika podem dar à luz crianças aparentemente saudáveis que podem apresentar manifestações e complicações tardias. Existe uma clara necessidade de diagnosticar e sequenciar amostras clínicas do ZIKV que circulam na América do Sul, especificamente no Brasil. No entanto, as baixas cargas virais observadas que são observadas comumente em amostras humanas constituem um fator complicador para detecção, amplificação e sequenciamento. Neste projeto, propor projetar um fluxo de trabalho otimizado para o sequenciamento completo do genoma com base no pré-enriquecimento por PCR (reação em cadeia da polimerase) e pools de amplicons. / Zika is an emerging arbovirus. There is enough evidence for the relation between Zika and congenital microcephaly and also with the Guillain-Barre syndrome. Several characteristics of the virus are important, such as persistence of the virus in semen for several months, sexual transmission and evidence of prenatal transmission. Zika infected pregnant mothers may give birth to apparently healthy children that may show late manifestations and complications. There is a clear necessity of diagnosing and sequencing clinical samples of ZIKV circulating in South America, specifically in Brazil. Nevertheless, the observed low viral loads that are commonly in human samples constitute a complicating factor for detection, amplification and sequencing. In this project, we aim to design an optimized workflow for full genome sequencing based on pre-enrichment by PCR (polymerase chain reaction) and amplicon pools.

O ferro é um importante elemento em reações catalíticas no meio ambiente, pois possui a capacidade de ser reduzido ou oxidado. Duas espécies de ferro solúvel podem estar presentes em amostras ambientais, o Fe (II) e o Fe (III). Métodos analíticos capazes de diferenciar e quantificar estas duas espécies de ferro são muito importantes para a compreensão dos processos metabólicos dos diversos microrganismos, e também para entender a atuação destes microrganismos na remobilização do coagulante utilizado em estações de tratamento de esgotos (ETEs), nas quais é possível utilizar como coagulante o FeCl3. Porém não há trabalhos publicados que recuperam o ferro coagulado utilizando bactérias redutoras de ferro. Os objetivos deste trabalho são: 1) avaliar o método colorimétrico de fenantrolina para quantificação de Fe (II) e os principais interferentes nessas análises; e 2) avaliar o potencial do Fe (II) gerado via metabolismo das bactérias redutoras de ferro como coagulante de matéria orgânica e inorgânica de águas residuárias. Os resultados para o método colorimétrico de fenantrolina são confiáveis somente para leituras de amostras que contenham Fe (II), mas não diferencia e quantifica corretamente espécies de Fe (III) em todos os valores de pH. A separação das diferentes espécies de ferro foi feita utilizando membrana de acetato de celulose com porosidade de 0,2 m e ajustando o valor do pH para valores entre 4 e 5. Para obtenção das concentrações de Fe (II) e Fe (III), é necessário realizar a leitura em amostras filtradas e não filtradas, pois o Fe (II) passa pela membrana e o Fe (III) fica retido. Desta forma, é possível realizar a distinção das espécies de ferro, e em seguida realizar a quantificação com testes colorimétricos, seja em campo ou em laboratório. A diferenciação das espécies de ferro se mostrou importante para quantificar corretamente o Fe (III) e o Fe (II) durante o tratamento de águas residuárias utilizando Fe (III) como coagulante na forma de FeCl3. Na comparação com a recuperação ácida, a biológica se mostrou mais eficiente por não apresentar metais pesados remobilizados na fração líquida, recuperando 58% do ferro quando adicionado o glicerol como fonte de carbono. Durante a remobilização do ferro houve a produção do metano, gás de interesse econômico. A escolha do coagulante e da concentração foi determinada pela remoção da turbidez, sendo o melhor coagulante para água residuária do CRUSP o FeCl3 na concentração de 60 mg/ L de Fe, pois removeu 99% da turbidez, 98% do fosfato, 85% dos carboidratos e 100% de proteínas presentes na água residuária. Aplicando-se o coagulante remobilizado (400 mg/L), foi possível remover 85% da turbidez. O ferro recuperado servirá novamente como coagulante, favorecendo a redução dos custos com o tratamento de água residuária. / Iron is an important element in catalytical action in the environment as it has an ability to be filtered or oxidized. Soluble iron species may be present in environmental samples, Fe (II) and Fe (III). Analytical methods capable of differentiating and quantifying these two iron species are very important for the remobilization of coagulation in sewage treatment plants (ETEs), in which FeCl3 can be used as a coagulant. It is not a job that recovers coagulated iron with iron reducing units. The objectives of this work are: 1) to evaluate the colorimetric method of phenanthroline for quantification of Fe (II) and the main interferents in these analyzes; and 2) to evaluate the potential of Fe (II) through the metabolism of iron-reducing bacteria as a coagulant of organic and inorganic wastewater. The results for the colorimetric method of phenanthroline are only for the readings of samples containing Fe (II), but do not differentiate and quantify the Fe (III) species at all pH values. The separation of the fish fiber species was left to the cellulose acetate test with the porosity of 0.2 m and adjusting the pH value to values between 4 and 5. For the concentration of Fe (II) and Fe (III), it is necessary to read in filtered and unfiltered samples, as Fe (II) passes through the membrane and Fe (III) is retained. In this way, it is possible to perform an analysis of the iron species, and then perform quantification with colorimetric tests, either in the field or in the laboratory. Differentiation of iron species has become important in correctly quantifying Fe (III) and Fe (II) during wastewater treatment using Fe (III) as a coagulant in the form of FeCl3. In comparison with an acid replica, a biological recovery is done through large amounts of remobilized in the liquid fraction, recovering 58% of the iron when the glycerol as carbon source. During the remobilization of the iron there was a production of methane, gas of economic interest. The choice of the coagulant and the capacity was determined by the removal of the turbidity, being the best coagulant for the residual water of the CRUSP the FeCl3 in the concentration of 60 mg/L of Fe, since it removed 99% of the turbidity, 98% of the phosphate, 85% of carbohydrates and 100% of proteins present in the wastewater. Applying the remobilized coagulant (400 mg/L), it was 85% turbidity remover. The recovered iron will again serve as a coagulant, favoring the reduction of costs with the treatment of wastewater.

A partir do sequenciamento do genoma da bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), estudos sobre os mecanismos de patogenicidade expressos durante a doença foram iniciados em projetos de genômica funcional, com o objetivo de confirmar a função das sequências gênicas identificadas no projeto Genoma de X. fastidiosa. Dentre esses mecanismos destacam-se as enzimas envolvidas no processo de ataque da bactéria. O presente trabalho teve como alvo de estudo a seqüência gênica denominada Xf-0818, clonada em Escherichia coli através da inserção em plasmídeo pET 28b(+), que presumivelmente codifica uma celulase de cerca de 60 kDa, possivelmente envolvida na degradação de fibras de celulose presentes nas membranas dos vasos pontuados do xilema de plantas de citros. A degradação desta membrana permitiria a movimentação de células bacterianas entre os vasos do xilema, o que é determinante para o desenvolvimento dos sintomas da CVC. A proteína foi superexpressada em E. coli por meio de indução com lactose e purificada através de ultrafiltração associada à cromatografia de afinidade a metal. A enzima apresentou alta atividade sobre a celulose carboximetilada 1%, avaliada através da quantificação de açúcares redutores. A obtenção de anticorpos foi realizada mediante injeção da enzima purificada em camundongos, os quais foram avaliados através de ELISA. A atividade da enzima sobre celulose carboximetilada foi reduzida após prévia incubação com os anticorpos. Esses anticorpos representam uma poderosa ferramenta em pesquisas visando à identificação das condições que favoreçam a expressão desta enzima "in vivo". A presença de partículas de ouro coloidal em seções de tecido provenientes de plantas infectadas com X. fastidiosa indica a atuação da celulase durante a infecção, porém fazse necessária a confirmação do papel da proteína Xf-0818, através de novas análises com imunolocalização, além de estudos utilizando linhagens mutantes de X. fastidiosa para o gene que codifica esta celulase. / From the genome sequencing of the bacteria Xylella fastidiosa, the agent responsible for the citrus variegated chlorosis (CVC), studies on the pathogenicity mechanisms expressed during the occurrence of the disease were started in genomic function projects, aiming to confirm the function of the genic sequences identified in the project X. fastidiosa Genome. Among these mechanisms, the enzymes involved in the bacterium attaching process are highlighted. The present study had, as a goal, the orf denominated Xf-0818, cloned in Escherichia coli by means of the insertion into pET 28b(+) plasmid, which codifies a cellulase of a size nearly 60 kDa, possibly involved in the degradation of cellulose fibers present in the membranes of the xylem vessels of citrus plants. The degradation of this membrane would allow for the movement of bacterial cells among the xylem vessels, which would be important for the development of CVC symptoms. The enzyme was over expressed into E. coli by means of their induction using lactose and purified using ultra-filtration associated to metal affinity chromatography. The enzyme presented high activity over 1%-carboximethyl cellulose (CMC), which was evaluated through quantification of released reduced sugars. The antibodies were obtained by injection of the purified enzyme into mice, which were evaluated by using the ELISA. The enzyme activity over CMC was reduced after previous incubation with the antibodies. These antibodies represent a tool for the researches aiming the identification of conditions that favor the expression of this enzyme in vivo. The presence of gold particles on the citrus diseased tissue samples indicate the participation of this cellulase on the disease, but other studies using immunocytochemistry and mutants of X. fastidiosa are necessary to confirm this hypothesis.

Após o seqüenciamento completo do genoma humano, a busca e caracterização do conjunto completo de genes humanos constitui-se no principal desafio nesta área de investigação, sendo o passo limitante para o progresso na exploração dos dados contidos no seqüenciamento deste genoma. O projeto de transcriptoma denominado \"Transcript Finishing Initiative\" (TFI) surgiu neste contexto, com o objetivo principal de gerar fragmentos parciais de transcritos humanos, que não haviam sido descritos previamente e determinar sua seqüência, para iniciar a caracterização de novos genes humanos. A estratégia utilizada foi q alinhamento de todas as seqüências ORESTES e ESTs disponíveis com a seqüência pública do genoma humano e o agrupamento j c1usterização destas com base nas coordenadas deste genoma. Algumas das regiões que não eram cobertas por estas seqüências foram, então, completadas, por RT-PCR, utilizando-se primers ancorados nos clusters vizinhos. Cada par de clusters de ESTs selecionado para validação experimental foi designado como uma Unidade do \"Transcript Finishing\" (TFU), tendo sido validadas experimentalmente, pelo grupo TFI, Um total de 211 TFUs foram validadas, sendo que 197 seqüências consenso foram submetidas ao Genbank (CF272536-CF272733). Atualmente, apenas um pequeno número destas seqüências ainda são considerados genes novos, sem que haja um cDNA depositado em banco de dados; contudo para um número considerável destas TFUs não existe qualquer caracterização sobre sua função. Na tentativa de contribuir para melhor caracterização dos genes identificados no projeto TFI, e tendo, como base, a linha de pesquisa do laboratório, que busca genes diferencialmente expressos envolvidos em transformação maligna/tumorigênese, o presente trabalho propôs a utilização das seqüências TFUs para estudar sua possível associação com tumores de glia humanos e outros tipos de tumores (de próstata e de mama). Para tanto, as TFUs foram analisadas \"in silico\" para estabelecer seu grau de ineditismo como um novo gene ou um gene sem função conhecida, e, para análise de sua expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais de cérebro, próstata e mama. Para validar estas análises computacionais na bancada, foram gerados macro- e microarranjos de DNA utilizando-se as TFUs disponíveis como clones físicos ou amplicons, para o rastreamento com sondas das linhagens celulares A172 e T98G de glioblastomas. Os resultados das análises destes dados foram confirmados por PCR quantitativo tanto nas linhagens como em amostras clínicas de astrocitomas que apresentam diversos graus de malignidade. Como resultado, foi possível organizar um Banco de Clones Físicos de TFUs, além de identificar e selecionar uma TFU (168), cuja expressão correlaciona diretamente com o grau de malignidade dos tumores de glia. Esta seqüência corresponde a um novo gene, já que não existe a seqüência de cDNA completo nos bancos de dados. Em vista disto, a TFU168 foi selecionada para estudos funcionais posteriores, que já estão em andamento, através da obtenção de suaseqüência completa de cDNA para ensaios de superexpressão e do silenciamento gênico através de RNAi. / Upon complete sequencing of the human genome, identification and characterization of the complete set of human genes constitutes the major challenge in this research field, constituting the limiting step for progress in exploration of the informations contained in the genome sequencing data. The Transcript Finishing Initiative (TFI) transcriptome project arose in this context, aiming at the generation, sequencing and characterization of partial new human transcripts and genes. The strategy adopted was the alignment of the alI the available ORESTES and EST sequences data with the public human genome sequence and their clusterization based on the coordinates of this genome. Thus, some of the regions which were not cover by ESTs and ORESTES (gaps) were then completed by RT-PCR using primers anchored in the neighboring clusters. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was named Transcript Finishing Unit (TFU). A large number (211) of TFU s were validated and 197 -consensus sequences were submitted to the Genbank (CF272536-CF272733). At present, only a few of these sequences are considered as new genes without a full-Iength cDNA sequence deposited in the data bank, however, no functional characterization is yet available for a large number of these sequences. In an attempt to contribute to further characterization of these genes identified in the TFI project and keeping in mind the main interest of our laboratory, which is the identification of differentially expressed genes in tumor versus normal tissue, the present work aims at utilizing these TFUs to find differentially expressed genes associated with human glial tumors and with other kinds of tumors. To this end, these sequences were first subjected to in silico analysis in order to establish their degree of ineditism (new sequences and/or sequences with unknown function) and their expression profile between normal and tumoral tissues of brain, mammary gland and prostate. To validate this computational analysis, DNA macro- and microarrays were generated with the TFU sequences and screened with cDNA probes obtained from the A172 and T98G glioblastomas cell lines. The results of these screenings were confirmed by quantitative PCR both in cell lines and in tumor samples of different degrees of malignancy. The results obtained in this work allowed the organization of a TFUs Physical Clones Bank and the identification and selection of one sequence (TFU 168), whose expression is directly re1ated to the degree of tumor malignancy. This sequence constitutes a new gene, since no complete cDNA sequence is available in the data banks. Therefore, TFU168 was selected for further functional studies by obtaining its full-Iength cDNA sequence to be used for over expression by silencing this gene using RNAi.

Etiquetas de sequências expressas (ESTs) são fundamentais para a identificação de genes no genoma humano e para definir características de expressão gênica. Neste trabalho, descrevemos uma nova abordagem para a geração de bibliotecas de cDNA, utilizando iniciadores arbitrários para a produção, por PCR, de mini-bibliotecas a partir de mRNA derivado de câncer de mama. Clones destas bibliotecas foram sequenciadas para gerar 6029 ESTs. Utilizando esta abordagem, foi possível observar uma significante normalização das diferentes sub-populações de mRNA e amplificação preferencial de porções centrais dos genes. Análise bioinformática destas sequências mostra que 3.350 ESTs (56%) tem similaridade significante a sequências de DNA e/ou cDNA já conhecidas (sequências anotadas) descritas em diferentes organismos, e 1509 ESTs (25%) não possuem qualquer similaridade a diferentes bancos de dados. Dentre as sequências anotadas, identificamos algumas sequências com alta similaridade a genes conhecidos em diferentes organismos, indicando a descoberta de alguns genes homólogos possivelmente envolvidos com processos carcinogênicos. Como exemplo, isolamos e caracterizamos parcialmente (i) uma nova isoforma do gene NABC1 (novel amplified sequence in breast carcinoma 1), o qual é pouco expresso em tumores coloretais, (ii) um novo gene da família de semaforinas (moléculas de motilidade axonal) que apresenta uma baixa expressão em linhagens celulares de glioblastoma tratadas com ácido retinóico, um agente antitumoral e (iii) o gene ortólogo humano Notch 2, aparentemente superexpresso em tumores mamários com maior malignidade. / Expressed sequence tags (ESTs) are of fundamental importance for the identification of genes within the human genome and defining gene expression characteristics. In this work, we describe a new approach for generating cDNA libraries using essentially arbitrary primers to construct PCR-based minilibraries from breast tumor mRNA. Clones from these libraries were sequenced to generate 6,029 ESTs. Using this approach, we were able to observe a significant normalization of the different mRNA subpopulations and a preferential amplification of the central portions of the genes. Bioinformatic analysis of these sequences shows that 3,350 ESTs (56%) have significant similarity to known DNA and/or cDNA sequences (annotated sequences) from different organisms and 1,509 ESTs (25%) show no similarity to any sequences on different databases. From the annotated sequences, we have identified some sequences with high similarity to known genes from different organisms, indicating the discovery of some homologous genes possibly correlated with carcinogenic processes. For instance, we have isolated and partially characterized (i) a new NABC1 (novel amplified sequence in breast carcinoma 1) isoform which is downregulated in colorectal tumors, (ii) a novel semaphorin member of axon guidance molecules that is down-regulated in glioblastoma cell lines treated with all-trans-retinoic acid, an anti-tumor agent and (iii) the ortolog Notch 2 human gene, apparenty overexpressed in breast tumors with higher malignancy.