Les thiorédoxines (TRX) sont des protéines ubiquistes à activité d’oxydoréductase de ponts disulfure de protéines dites « cibles ». Le génome d’Arabidopsis thaliana code une vingtaine de TRX canoniques dont 10 (divisées en 5 types : f, m, x, y et z) sont localisées dans les plastes. Les TRX f sont connues depuis plus de trente ans pour être des régulateurs centraux du métabolisme photosynthétique, mais les approches expérimentales récentes (protéomique, génétique inverse.) indiquent que ces protéines interviennent dans des métabolismes non photosynthétiques variés, notamment le cycle oxydatif des pentoses phosphate (COPP). Ce travail a consisté à analyser in vitro la capacité des TRX plastidiales à réguler les déshydrogénases du COPP qui assurent la majorité de la production de pouvoir réducteur (sous forme de NADPH) dans des conditions non-photosynthétiques. Les résultats obtenus ont été validés dans un système ferrédoxine/TRX reconstitué et ont permis de proposer un modèle de régulation stricte par certaines TRX de la glucose-6-phosphate déshydrogénase chloroplastique G6PDH1 où la TRX f assure la coordination des cycles réductif (cycle de Calvin) et oxydatif des pentoses phosphate. Des approches biochimiques et biophysiques ont permis de mettre en évidence plusieurs modifications de propriétés catalytiques et structurales faisant suite à la régulation redox de G6PDH1 et d’aborder les déterminants des spécificités de régulations. Ce travail in vitro a été complété par une caractérisation in vivo (basée sur l’utilisation de mutants perte de fonction) de l’importance des TRX y dans le contrôle de l’activité G6PDH racinaire, et les processus de germination. Les résultats obtenus suggèrent que, dans les graines, ce type de TRX interviendrait dans les processus de levée de dormance et de vieillissement via son interconnexion avec les mécanismes de détoxication des formes actives de l’oxygène. / Thioredoxins are ubiquitous thiol-disulfide oxidoreductases on target proteins. In Arabidopsis, many TRX isoforms are found, especially in plastids where 10 isoforms are found and subdivided into five types (f, m, x, y and z type).The f-type TRX is known for decades as a regulator of photosynthetic metabolism, but proteomics and genetics indicate that these proteins might regulate many non photosynthetic metabolic pathways, such as the oxidative pentose phosphate pathway (OPPP).In this work, I have examined in vitro the redox regulation of OPPP dehydrogenases by plastidial TRX, the OPPP being a major source of reducing power (as NADPH) in non-photosynthesizing conditions. Biochemical studies were reproduced in a reconstituted ferredoxin / TRX system, allowing to propose a new function for f-type TRX isoforms co-ordinating both reductive (Calvin cycle) and oxidative pentose phosphate pathways. Biochemical and biophysical approaches revealed several modifications of catalytic and structural properties accompanying the redox regulation of G6PDH1, the first dehydrogenase of the OPPP.In vivo studies, using reverse genetics were developed, to analyse the possible role of y-type TRX in the control of root G6PDH activity and germination physiology. Seeds of y-type TRX mutants display an altered behaviour in dormancy and aging. The possible role of y-type TRX in the control of seed germination through their antioxidant function is discussed.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

37.3 million Americans (11.2% of the US population) currently have Type 2 diabetes mellitus (T2DM) with over 1.5 million new cases being diagnosed each year. The multifactorial etiology of the patient having neuropathy, overweight/obesity, foot deformities, ischemia, and infection leads to a condition called diabetic foot ulcer (DFU). One in six patients with a DFU will require amputation with infected DFUs have a 155-fold increased risk of amputation. Staphylococcus aureus is the most common bacteria isolated from severe DFU infections that require amputation. Interestingly, diabetics are more heavily colonized with S. aureus compared to non-diabetics suggesting a unique advantageous adaptation to diabetes. The specifics of the underlying molecular mechanisms and triggers by which S. aureus adapts and thrives in the T2DM patient that increase its pathogenicity and colonization compared to non-diabetics with skin ulcer infections are not fully elucidated. Thus, our studies aimed to identify the key virulence components in the pathogenesis of S. aureus infected DFUs and using that information to develop therapeutics aimed at disrupting these components to increase the success rate of conservative treatment and prevent non-traumatic lower extremity amputations in T2DM patients. Our studies found that several different elevated sugars in T2DM patients can trigger virulence factor production in S. aureus. We also found by comparing several different clinical DFU S. aureus isolates that there are clear differences in the ability of each isolate to cause necrotic infections. And lastly, we identified a possible therapeutic, the amino acid L-arginine, that can help prevent/treat S. aureus infections in the Tallyho diabetic mouse model. In conclusion, we have increased the understanding of the pathogenesis of S. aureus infected DFU and have proposed a possible therapeutic to add to the conservative treatment regimen.

Objetivos: A deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) está associada a um maior risco de encefalopatia bilirrubínica e de crise hemolítica aguda grave desencadeada por drogas como a primaquina e a dapsona. Conhecer a prevalência dessa deficiência enzimática em área onde a malária e a hanseníase ainda estão presentes e conhecer a prevalência das principais mutações traz subsídios para planejamento de estratégias com vistas à redução de riscos associados a esta deficiência enzimática. Métodos: Estudo descritivo transversal conduzido em uma região do centro-oeste do Brasil. Exame de triagem para deficiência de G6PD foi realizado em 3573 recémnascidos. Exame confirmatório foi necessário em 188 crianças triadas como possíveis portadores de deficiência. Nas crianças em que foi confirmada a deficiência de G6PD foi feita pesquisa das mutações G202A (G6PD A-) e C563T (G6PD Mediterrâneo) por PCR. Resultados: A deficiência de G6PD foi confirmada em 63 crianças, sendo 60 meninos (95,2%) e três meninas (4,8%). O percentual de exames falso-positivos na fase de triagem foi de 66,5%, estando o percentual de falso-positivos associado à temperatura e tempo de transporte das amostras. Entre as crianças que confirmaram deficiência de G6PD, foi mais frequente a história de anemia em familiares e de icterícia neonatal. Houve associação entre hematócrito baixo e deficiência enzimática, mas não com hemoglobina, contagem de reticulócitos ou neutrófilos. A prevalência da deficiência de G6PD (IC95%) foi de 1,76% (1,37; 2,24) entre os recém-nascidos triados e de 3,34% entre os meninos (2,58; 4,25). A mutação C563T não foi identificada em nenhuma criança, mas a mutação G202A estava presente em 58 crianças - 92,06% (IC95%: 83,29 - 97,03): 56/60 meninos e em 2/3 meninas homozigotas. Foi identificado um menino com Kernicterus portador da mutação G202A em hemizigose. Conclusão: O elevado percentual de falso-positivos na etapa de triagem, o tempo necessário entre coleta e confirmação da presença de deficiência enzimática, associado ao alto custo da triagem universal, não apoiam a inclusão da triagem de deficiência de G6PD no programa de triagem neonatal brasileiro. Na região avaliada, a prevalência observada em meninos indica que a triagem de deficiência de G6PD deva ser realizada antes do uso de drogas como a primaquina e a dapsona somente em meninos. Foi elevada a prevalência da mutação G202A, de classe III, sendo esta mutação associada a uma menor morbidade. A identificação de um menino com Kernicterus com deficiência de G6PD indica que há necessidade de se planejar estratégias para minimizar o risco dessa morbidade associada à deficiência enzimática / Objective: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is associated with an increased risk of bilirubin encephalopathy in neonates and acute hemolytic crisis triggered by drugs such as primaquine and dapsone. In an area where malaria and Hansen\'s disease are still present, knowing the prevalence of this enzyme defect and determining the prevalence of major mutations is important for planning strategies for reducing the risks associated with this enzyme deficiency. Methods: Sectional study was conducted in a Midwestern region of Brazil. Screening for G6PD deficiency was performed in 3,573 neonates. Confirmatory tests were necessary for 188 positively screened children. After confirmation, PCR investigation was utilized to identify the mutations. Results: G6PD deficiency was confirmed in 63 children: 60 boys (95.2%) and 3 girls (4.8%). The percentage of false-positive cases in the screening phase, 66.5% and was associated with the temperature and transportation time of the samples. Family history of anemia and jaundice was more frequent among the children with confirmed G6PD deficiency. An association between a low hematocrit and enzyme deficiency was observed. However, there was no association with hemoglobin reticulocyte or neutrophils counts. The prevalence of G6PD deficiency (CI95%) was 1.76% (1.37; 2.24) among all screened neonates and 3.34% (2.58; 4.25) among male children. The C563T mutation was not identified in any child. The G202A mutation was present in 58 children - 92.06% (CI95%: 83.29 - 97.03), 56/60 boys and 2/3 homozygous girls. One boy with a hemizygous G202A mutation was identified as having Kernicterus. Conclusion: The high percentage of false-positive results when first screening for G6PD deficiency; the long delay time between the test and result; along with the high cost of the this screening test, are all factors that do not support adding this test to the already established Brazilian neonatal screening programs. The prevalence observed among boys does indicate that screening for G6PD deficiency should be performed in this region before the use of drugs such as primaquine and dapsone only in boys. This study found a high prevalence of the G202A mutation, a Class III variant associated with lower morbidity. The identification of a G6PD deficient boy with Kernicterus reinforces the necessity for strategies to abolish the morbidity associated with this enzyme deficiency

A utilização de resíduos agrícolas visando à produção de insumos por via biotecnológica tem se mostrado importante uma vez que estes resíduos são fontes renováveis de carbono. A fração hemicelulósica destes resíduos apresenta como componente principal a xilose, que pode ser utilizada como substrato em processos de bioconversão para a obtenção de produtos com valor agregado. Um destes produtos é a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), primeira enzima da via das pentoses fosfato que pode ser utilizada como reagente analítico em análises quantitativas, sobretudo em estudos bioquímicos e médicos. O presente trabalho visou estudar o processo de purificação dessa enzima empregando a extração em sistemas de duas fases aquosas convencional (sem integração) e integrado ao rompimento celular, em duas escalas, reduzida e ampliada. A enzima foi produzida por Candida guilliermondii FTI 20037 cultivada em meio constituído de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz, sob condições pré-determinadas. Inicialmente, foram realizados ensaios para avaliar o efeito das variáveis volume de suspensão celular, velocidade de agitação do moinho de esferas de vidro e tempo sobre o rompimento das células. Os valores destas variáveis foram, então, estabelecidos em: 100 mL, 400 rpm e 25 minutos, respectivamente. Posteriormente, a influência da massa molar de PEG e comprimento de linha de amarração sobre a extração da G6PD foram investigados no sistema convencional (homogeneizado obtido a partir do rompimento celular, em presença ou ausência de fragmentos) e integrado (rompimento na presença dos componentes da extração), empregando-se a metodologia do planejamento experimental. Nos ensaios realizados em escala reduzida, sob condições otimizadas, alcançou-se um fator de purificação na fase rica em sal (FPf), ou fase fundo, de 2,8 e em maior escala, ou seja, em moinho de rompimento, de 1,3. Com isso, realizou-se o estudo cinético e termodinâmico empregando a enzima presente no homogeneizado antes da purificação e após purificada no processo integrado em escala reduzida, nas seguintes condições: TLL 40% e PEG 1500 mol/L. Os valores determinados para os parâmetros cinéticos foram Km, 0,07 e 0,05 mM, Vm, 34,8 e 19,1 U/L e dos parâmetros termodinâmicos ΔG, -13,71 e -13,64 KJ/mol; ΔH, -2,49 e -2,50 KJ/mol; ΔS, 37,02 e 36,77 J/mol.K; Ea, 24,18 e 15,02 KJ/mol, da enzima presente no homogeneizado celular antes e após purificação, respectivamente. / The employment of agricultural residues aiming the attainment of biotechnological products has been shown its importance since these residues are renewable and low cost sources of carbon. The hemicellulosic fraction of these residues presents xylose as main component, which can be utilized as substrate for different bioconversion processes for the acquisition of high value products. As an example, glucose-6-phosphate dehydrogenase, the first enzyme of pentose phosphate pathway which can be used as analytical reagent in several quantitative analysis, mainly in biochemical and medical studies. The present work contemplated the study of glucose-6-phosphate (G6PD) purification process by a conventional aqueous two phase systems extraction and integrated with cell disruption, in two scales, reduced and increased. The enzyme was obtained from cells of Candida guilliermondii FTI 20037 grown in hemicellulosic rice straw hydrolysate, using conditions established in previous work. Initially, assays in bead mill were performed to determine the effect of cell suspension volume, agitation speed and time on cell disruption. The determined conditions were: 100 mL, 400 rpm and 25 minutes, respectively. After this, the influence of molar mass of PEG and tie line lenght (TLL) on the G6PD recovery were investigated in the conventional system (with previous disrupted cells, with or without cell fragments) and integrated (disruption in the presence of extraction components), using the experimental design methodology. In the reduced scale assays, in optimized conditions, a purification factor in salt rich phase (FPf), or bottom phase, of 2,8 was reached while in the increased scale, this means in bead mill, a FPf of 1,3 was attained. In addition, kinetic and thermodynamic studies were performed, employing the enzyme present in the homogenate before and after purification in reduced scale, in the following conditions: TLL of 40% and PEG 1500 mol/L. The established values for the kinetics parameters were Km, 0,07 and 0,05 mM, Vm, 34,8 and 19,1 U/L and of thermodynamics ΔG, -13,71 and -13,64 KJ/mol; ΔH, -2,49 and -2,50 KJ/mol; ΔS, 37,02 and 36,77 J/mol.K; Ea, 24,18 and 15,02 KJ/mol, of the enzyme present in the homogenate before and after purification respectively.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

Objetivos: A deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) está associada a um maior risco de encefalopatia bilirrubínica e de crise hemolítica aguda grave desencadeada por drogas como a primaquina e a dapsona. Conhecer a prevalência dessa deficiência enzimática em área onde a malária e a hanseníase ainda estão presentes e conhecer a prevalência das principais mutações traz subsídios para planejamento de estratégias com vistas à redução de riscos associados a esta deficiência enzimática. Métodos: Estudo descritivo transversal conduzido em uma região do centro-oeste do Brasil. Exame de triagem para deficiência de G6PD foi realizado em 3573 recémnascidos. Exame confirmatório foi necessário em 188 crianças triadas como possíveis portadores de deficiência. Nas crianças em que foi confirmada a deficiência de G6PD foi feita pesquisa das mutações G202A (G6PD A-) e C563T (G6PD Mediterrâneo) por PCR. Resultados: A deficiência de G6PD foi confirmada em 63 crianças, sendo 60 meninos (95,2%) e três meninas (4,8%). O percentual de exames falso-positivos na fase de triagem foi de 66,5%, estando o percentual de falso-positivos associado à temperatura e tempo de transporte das amostras. Entre as crianças que confirmaram deficiência de G6PD, foi mais frequente a história de anemia em familiares e de icterícia neonatal. Houve associação entre hematócrito baixo e deficiência enzimática, mas não com hemoglobina, contagem de reticulócitos ou neutrófilos. A prevalência da deficiência de G6PD (IC95%) foi de 1,76% (1,37; 2,24) entre os recém-nascidos triados e de 3,34% entre os meninos (2,58; 4,25). A mutação C563T não foi identificada em nenhuma criança, mas a mutação G202A estava presente em 58 crianças - 92,06% (IC95%: 83,29 - 97,03): 56/60 meninos e em 2/3 meninas homozigotas. Foi identificado um menino com Kernicterus portador da mutação G202A em hemizigose. Conclusão: O elevado percentual de falso-positivos na etapa de triagem, o tempo necessário entre coleta e confirmação da presença de deficiência enzimática, associado ao alto custo da triagem universal, não apoiam a inclusão da triagem de deficiência de G6PD no programa de triagem neonatal brasileiro. Na região avaliada, a prevalência observada em meninos indica que a triagem de deficiência de G6PD deva ser realizada antes do uso de drogas como a primaquina e a dapsona somente em meninos. Foi elevada a prevalência da mutação G202A, de classe III, sendo esta mutação associada a uma menor morbidade. A identificação de um menino com Kernicterus com deficiência de G6PD indica que há necessidade de se planejar estratégias para minimizar o risco dessa morbidade associada à deficiência enzimática / Objective: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is associated with an increased risk of bilirubin encephalopathy in neonates and acute hemolytic crisis triggered by drugs such as primaquine and dapsone. In an area where malaria and Hansen\'s disease are still present, knowing the prevalence of this enzyme defect and determining the prevalence of major mutations is important for planning strategies for reducing the risks associated with this enzyme deficiency. Methods: Sectional study was conducted in a Midwestern region of Brazil. Screening for G6PD deficiency was performed in 3,573 neonates. Confirmatory tests were necessary for 188 positively screened children. After confirmation, PCR investigation was utilized to identify the mutations. Results: G6PD deficiency was confirmed in 63 children: 60 boys (95.2%) and 3 girls (4.8%). The percentage of false-positive cases in the screening phase, 66.5% and was associated with the temperature and transportation time of the samples. Family history of anemia and jaundice was more frequent among the children with confirmed G6PD deficiency. An association between a low hematocrit and enzyme deficiency was observed. However, there was no association with hemoglobin reticulocyte or neutrophils counts. The prevalence of G6PD deficiency (CI95%) was 1.76% (1.37; 2.24) among all screened neonates and 3.34% (2.58; 4.25) among male children. The C563T mutation was not identified in any child. The G202A mutation was present in 58 children - 92.06% (CI95%: 83.29 - 97.03), 56/60 boys and 2/3 homozygous girls. One boy with a hemizygous G202A mutation was identified as having Kernicterus. Conclusion: The high percentage of false-positive results when first screening for G6PD deficiency; the long delay time between the test and result; along with the high cost of the this screening test, are all factors that do not support adding this test to the already established Brazilian neonatal screening programs. The prevalence observed among boys does indicate that screening for G6PD deficiency should be performed in this region before the use of drugs such as primaquine and dapsone only in boys. This study found a high prevalence of the G202A mutation, a Class III variant associated with lower morbidity. The identification of a G6PD deficient boy with Kernicterus reinforces the necessity for strategies to abolish the morbidity associated with this enzyme deficiency

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

A utilização de resíduos agrícolas visando à produção de insumos por via biotecnológica tem se mostrado importante uma vez que estes resíduos são fontes renováveis de carbono. A fração hemicelulósica destes resíduos apresenta como componente principal a xilose, que pode ser utilizada como substrato em processos de bioconversão para a obtenção de produtos com valor agregado. Um destes produtos é a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), primeira enzima da via das pentoses fosfato que pode ser utilizada como reagente analítico em análises quantitativas, sobretudo em estudos bioquímicos e médicos. O presente trabalho visou estudar o processo de purificação dessa enzima empregando a extração em sistemas de duas fases aquosas convencional (sem integração) e integrado ao rompimento celular, em duas escalas, reduzida e ampliada. A enzima foi produzida por Candida guilliermondii FTI 20037 cultivada em meio constituído de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz, sob condições pré-determinadas. Inicialmente, foram realizados ensaios para avaliar o efeito das variáveis volume de suspensão celular, velocidade de agitação do moinho de esferas de vidro e tempo sobre o rompimento das células. Os valores destas variáveis foram, então, estabelecidos em: 100 mL, 400 rpm e 25 minutos, respectivamente. Posteriormente, a influência da massa molar de PEG e comprimento de linha de amarração sobre a extração da G6PD foram investigados no sistema convencional (homogeneizado obtido a partir do rompimento celular, em presença ou ausência de fragmentos) e integrado (rompimento na presença dos componentes da extração), empregando-se a metodologia do planejamento experimental. Nos ensaios realizados em escala reduzida, sob condições otimizadas, alcançou-se um fator de purificação na fase rica em sal (FPf), ou fase fundo, de 2,8 e em maior escala, ou seja, em moinho de rompimento, de 1,3. Com isso, realizou-se o estudo cinético e termodinâmico empregando a enzima presente no homogeneizado antes da purificação e após purificada no processo integrado em escala reduzida, nas seguintes condições: TLL 40% e PEG 1500 mol/L. Os valores determinados para os parâmetros cinéticos foram Km, 0,07 e 0,05 mM, Vm, 34,8 e 19,1 U/L e dos parâmetros termodinâmicos ΔG, -13,71 e -13,64 KJ/mol; ΔH, -2,49 e -2,50 KJ/mol; ΔS, 37,02 e 36,77 J/mol.K; Ea, 24,18 e 15,02 KJ/mol, da enzima presente no homogeneizado celular antes e após purificação, respectivamente. / The employment of agricultural residues aiming the attainment of biotechnological products has been shown its importance since these residues are renewable and low cost sources of carbon. The hemicellulosic fraction of these residues presents xylose as main component, which can be utilized as substrate for different bioconversion processes for the acquisition of high value products. As an example, glucose-6-phosphate dehydrogenase, the first enzyme of pentose phosphate pathway which can be used as analytical reagent in several quantitative analysis, mainly in biochemical and medical studies. The present work contemplated the study of glucose-6-phosphate (G6PD) purification process by a conventional aqueous two phase systems extraction and integrated with cell disruption, in two scales, reduced and increased. The enzyme was obtained from cells of Candida guilliermondii FTI 20037 grown in hemicellulosic rice straw hydrolysate, using conditions established in previous work. Initially, assays in bead mill were performed to determine the effect of cell suspension volume, agitation speed and time on cell disruption. The determined conditions were: 100 mL, 400 rpm and 25 minutes, respectively. After this, the influence of molar mass of PEG and tie line lenght (TLL) on the G6PD recovery were investigated in the conventional system (with previous disrupted cells, with or without cell fragments) and integrated (disruption in the presence of extraction components), using the experimental design methodology. In the reduced scale assays, in optimized conditions, a purification factor in salt rich phase (FPf), or bottom phase, of 2,8 was reached while in the increased scale, this means in bead mill, a FPf of 1,3 was attained. In addition, kinetic and thermodynamic studies were performed, employing the enzyme present in the homogenate before and after purification in reduced scale, in the following conditions: TLL of 40% and PEG 1500 mol/L. The established values for the kinetics parameters were Km, 0,07 and 0,05 mM, Vm, 34,8 and 19,1 U/L and of thermodynamics ΔG, -13,71 and -13,64 KJ/mol; ΔH, -2,49 and -2,50 KJ/mol; ΔS, 37,02 and 36,77 J/mol.K; Ea, 24,18 and 15,02 KJ/mol, of the enzyme present in the homogenate before and after purification respectively.

Biotic stress in the form of viral infection, as well as abiotic salt stress, cause leaves injuries, stomata closure and decreased rate of photosynthesis. These factors lead to the limitation of plant growth and to reduced amount of coenzyme NADPH. However NADPH is an important coenzyme for many metabolic pathways such as synthesis of fatty acids, amino acids and secondary metabolites involved in stress responses. NADPH is also a coenzyme for key enzymes of antioxidant system and for many regulatory enzymes. NADP-dependent enzymes are alternative source of NADPH in plants under stress conditions. In this work, activities of four NADP-dependent enzymes: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, EC 1.1.1.49), NADP-isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH, EC 1.1.1.42), NADP-malic enzyme (decarboxylating) (NADP-ME, EC 1.1.1.40) and Shikimate dehydrogenase (SDH, EC 1.1.1.25) were studied. Activities of all these enzymes but SDH increased in leaves of tobacco plants (Nicotiana tabacum L.) infected by PVYNTN , The most sensitive enzymes to viral infection were NADP-ICDH and NADP-ME, whose activity was increased in comparison with control plants 3-fold and 2,4-fold, respectively. Changes in activity of studied enzymes were also determined in plants exposed to viral infection in combination with heat-shock...