Made available in DSpace on 2014-10-09T12:36:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O presente trabalho tem como objetivo a padronização de 68Ga, um emissor de pósitrons de meia-vida curta, usado em PET (Tomografia por Emissão de Pósitrons). A padronização do 68Ga foi realizada em um sistema de coincidência 4πβ-γ, que consiste de um detector proporcional em geometria 4π a gás fluente acoplado a um detector de cristal semicondutor HPGe, para a detecção de raios gama. A aquisição de dados foi realizada por meio de um Sistema de Coincidência por Software (SCS), desenvolvido no Laboratório de Metrologia Nuclear (Laboratório de Metrologia Nuclear - LMN) no IPEN-CNEN / SP. Os resultados finais foram obtidos a partir de um ajuste de curva multiparamétrica aplicando-se uma metodologia que leva em consideração a matriz de covariância combinando os resultados experimentais com aqueles determinados pela simulação Monte Carlo. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by Marco Antonio Oliveira da Silva (maosilva@ipen.br) on 2016-08-26T12:45:07Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2016-08-26T12:45:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Medidas de espectroscopia gama de alta resolução têm diversas aplicações. Aplicações envolvendo medidas de radioisótopos de meia-vida curta podem apresentar problemas de baixa precisão nas contagens quando a fonte radioativa está distante do detector e de perda de acurácia por efeitos de tempo morto e empilhamento de pulsos em situação de altas taxas de contagens. Um modo de minimizar esses problemas é alterando a posição da fonte radioativa durante o processo de medição, aproximando-a do detector conforme sua atividade diminui e assim maximizando o número de contagens medidas. Neste trabalho, foi desenvolvido o Movimentador de Amostras Radioativas Automatizado (MARA), um aparato de baixo custo, feito com materiais de baixo número atômico e leve, projetado e construído para auxiliar nas medidas de espectroscopia gama, capaz de controlar a distância entre a fonte e o detector, permitindo inclusive que ocorra alteração dessa distância durante o processo de medição. Por ser automatizado ele otimiza o tempo do operador, que tem total liberdade para criar suas rotinas de medidas no dispositivo, além de evitar que o mesmo tome uma parcela da dose radioativa. Foi também feita uma interface que permite controle do MARA e a programação do sistema de aquisição de dados. Foram realizados testes para otimização da operação do sistema MARA e foi verificada a segurança de operação do MARA, não apresentando nenhuma falha durante seus testes. Foi aplicado o teste de repetitividade, por meio de medições com uma fonte calibrada de 60Co, e verificou-se que o sistema de movimentação de prateleiras automatizado reproduziu os resultados do sistema estático com confiabilidade de 95%. / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

L’étude précise des transitions ß de Fermi super-permises 0+ ? 0+ offre un outil précieux pour explorer les propriétés de l’interaction faible dans le cadre du Modèle Standard (SM). Collectivement, les forces (ft) mesurées pour ces transitions permettent de vérifier l’hypothèse CVC et contribuent au test le plus rigoureux de l’unitarité de la première ligne de la matrice de mélange des quarks CKM en fournissant l’évaluation la plus précise de l’élément dominant (Vud). Jusqu’à récemment, un apparent défaut d’unitarité a semé le doute sur la validité du SM minimal et a mobilisé un effort considérable afin d’élargir le champ d’étude à d’autres émetteurs de Fermi. Le 62Ga et 38Ca sont parmi des noyaux clés pour mener ces tests de précision au travers de la vérification de la fiabilité des corrections imposées aux valeurs ft expérimentales. La décroissance ß de 62Ga a été étudiée auprès du séparateur IGISOL à Jyväskylä, avec un dispositif composé de 3 Clovers EUROBALL pour la détection du rayonnement ?. La mise en évidence de raies ? de très faible intensité (<1‰), au travers de corrélations ß-? et ß-?-?, a permis de reconstruire partiellement le schéma de niveaux excités dans le 62Zn. Le rapport d’embranchement analogue déduit (B.R.A = 99.893(24) %) est utilisé pour extraire la valeur Ft(62Ga) universelle. Celle-ci s’avère en bon accord avec les 12 valeurs précises connues de la littérature. La compatibilité constatée entre la limite supérieure dressée ici sur le terme (d1IM) et la prédiction théorique confirme l’importance des corrections de brisure de symétrie d'isospin dans les émetteurs ß (A = 62). L’étude de la décroissance de 38Ca a été réalisée auprès de l’installation ISOLDE du CERN. L’utilisation de la fluoration des fragments de réaction, pour isoler chimiquement les isotopes d’intérêt, alliée au piégeage d’ions assisté par REXTRAP et l’analyse TOF, ont permis de s’affranchir totalement du contaminant contraignant 38mK. Pour la première fois, la durée de vie de 38Ca est mesurée avec un échantillon de haute pureté. Le résultat préliminaire établi T1/2(38Ca) = 445.8(10) ms améliore la précision par rapport à l’ancienne valeur d’un facteur proche de 10. / Precise measurements of Fermi superallowed 0+? 0+ ß decays provide a powerful tool to study the weak interaction properties in the framework of the Standard Model (SM). Collectively, the comparative half-lives (ƒt) of these transitions allow a sensitive probe of the CVC hypothesis and contribute to the most demanding test of the unitarity of the quarks-mixing CKM matrix top-row, by providing, so far, the most accurate determination of its dominant element (Vud). Until recently, an apparent departure from unity enhanced a doubt on the validity of the minimal SM and thus stimulated a considerable effort in order to extend the study to other Fermi emitters available. The 62Ga and 38Ca are among key nuclei to achieve these precision tests and verify the reliability of the corrections applied to the experimental ƒt-values. The 62Ga ß-decay was investigated at the IGISOL separator in Jyväskylä, with an experimental setup composed of 3 EUROBALL Clovers for ?-ray detection. Very weak intensity (<1‰) ?-rays were identified, via ß-? and ß-?-? correlations, and allowed a partial decay scheme reconstruction in 62Zn. The newly established analog branching-ratio (B.R.A = 99.893(24) %) was used to compute the universal Ft-value (62Ga). The latter turned out to be in good agreement with the 12 well-known cases. Compatibility between the upper limit set here on the term (d1IM) and the theoretical prediction suggests that the isospin-symmetry-breaking correction is indeed large for the heavy (A = 62) ß-emitters. The study of the 38a decay was performed at the CERN- ISOLDE facility. Injection of fluorine into the ion source, in order to chemically select the isotopes of interest, assisted by the REXTRAP Penning trap facility and a TOF analysis, enabled us to eliminate efficiently the troublesome 38mK. For the first time, the 38Ca half-life is measured with a highly purified radioactive sample. The preliminary result obtained, T1/2(38Ca) = 445.8(10) ms, improves the precision on the half-life as determined from previous measurements by a factor close to 10.

Magister Pharmaceuticae - MPharm / Many studies have investigated the pharmacokinetics of anti-tuberculosis drugs in patients infected with tuberculosis. However, little is known about the pharmacokinetics of the drugs that are used in the treatment of multi-drug resistant tuberculosis (MDRTB).Therefore, the objective of the present study was to investigate the steady state concentrations and the pharmacokinetics of ofloxacin, one of the drugs used in the treatment of MDR-TB in patients infected with MDR-TB and patients with MDR-TB co-infected with HIV Plasma samples were drawn at different times over 24 hours after ofloxacin oral administration. For the determination of ofloxacin plasma concentrations, the liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis method was used.The method was validated over a concentration range of 0.1-10 μg/ml. The lower limit of ofloxacin detection was 0.05μg/ml, while the lower limit of quantification was 0.1μg/ml. The response was linear over the range used with a mean recovery of 97.6%. Ofloxacin peak was well separated at a retention time of 9.6 minutes.The pharmacokinetic parameters obtained were presented as mean ± standard deviation(SD). The peak concentration of ofloxacin (Cmax) was 4.71± 2.27 μg/ml occurred at Tmax 3±1.29 hours after ofloxacin oral administration. The mean (±SD) for the area under the concentration-time curve (AUC0-24) and the area under the concentration-time curve(AUC0-∞) were 68.8±42.61 μg/ml.hr and 91.93±76.86 μg/ml.hr, respectively. Ofloxacin distributed widely with a mean (±SD) volume of distribution (Vd) 2.77±1.16 L/kg and it was eliminated with a mean (±SD) total clearance rate of 0.27±0.25 L/hr/kg. Ofloxacin mean (±SD) half-life was 9.55± 4.69 hours and mean (±SD) of the mean residence time (MRT) was 1512± 6.59 hours.In summary, compared with the previous findings in the literature, ofloxacin pharmacokinetic was altered in MDR-TB patients with or without HIV co-infection.The AUC and Cmax were reduced, while the half-life and the time to reach the peak concentration were prolonged. This suggests that, both the rate and the extent of ofloxacin absorption were decreased. Furthermore, ofloxacin was highly eliminated in patients, which may be related to the altered liver function in this group of patients.Further studies investigating the effect of HIV, liver and kidney dysfunctions on ofloxacin pharmacokinetics are recommended in large number of patients infected with MDR-TB.in addition to the therapeutic drug monitoring to maintain the desired concentration of ofloxacin in the patients.

Introduction : L'hémophilie B (HB) est une maladie hémorragique héréditaire due à un défaut en facteur IX (FIX) de la coagulation. Le traitement substitutif est efficace mais pose deux problèmes : la fréquence des injections intraveineuses de concentrés de FIX et leurs coûts. La production d'un FIX recombinant à activité améliorée et à demi-vie prolongée est un enjeu important du traitement. Matériel et méthodes : Afin d'améliorer l'activité du FIX, l'étude s'est portée sur un résidu impliqué dans l'interaction du FIX activé avec son cofacteur, le facteur VIII activé (FVIIIa). Quatre FIX mutés au niveau de l'acide aminé E410 ont été développés. Afin de prolonger la demi-vie, un ADN complémentaire de FIX chimérique a été généré de façon à produire la protéine correspondante par la lignée cellulaire humaine Huh-7. Résultats : L'activité coagulante in vitro des FIX-E410 était 3 à 5 fois plus élevée que celle du FIX wild-type (FIX-WT). De plus, le FIX-E410H induisait une génération de thrombine 5,2 fois plus élevée comparée à celle du FIX-WT. Chez la souris HB, l'activité coagulante et la capacité de génération de thrombine du FIX-E410H in vivo étaient significativement plus élevées que celles du FIX-WT. La protéine chimérique a présenté une activité molaire spécifique 10 fois augmentée in vitro et une demi-vie jusqu'à 2,8 fois plus allongée, par rapport à celles du FIX-WT. Conclusion : Nous avons développé et caractérisé quatre molécules de FIX ayant une activité améliorée in vitro et in vivo, ainsi qu'un FIX modifié à activité augmentée et à demi-vie prolongée in vivo. Ces nouvelles molécules pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques de traitement de l'HB / Introduction: Hemophilia B (HB) is an inherited X-linked recessive bleeding disorder, due to a defect in human factor IX (FIX). Replacement therapy, in severe HB is very effective but is limited by FIX concentrates injections frequency and cost issues. Production of a recombinant FIX with enhanced clotting activity and prolonged half-life is one of the current challenges for HB treatment. Materials and Methods: To improve activity, we focused on an important residue known to be involved in the interaction of activated FIX with its cofactor, activated factor VIII (FVIIIa), and four mutated FIX-E410 were developed. To prolong stability, a new chimeric FIX cDNA was constructed too. Recombinant FIX molecules were produced by the human hepatoma cell line Huh-7. Results: The in-vitro clotting activity of FIX-E410 was 3 to 5-fold higher than wild-type FIX (FIX-WT) and this improvement was confirmed using thrombin generation assay. FIX-E410H induced 5.2-fold higher thrombin generation than FIX-WT. In HB mice, we observed significantly higher in-vivo clotting activity and thrombin generating capacity with FIX-E410H compared to FIX-WT, mainly explained by 2.5-fold enhanced affinity of the mutant for FVIIIa. Chimeric FIX showed a 10-fold increase in the in-vitro molar specific activity and a significantly increased half-life in mice (up to 2.8-fold), compared to FIX-WT. Conclusion: We have engineered and characterized four improved FIX proteins with enhanced in- vitro and in-vivo activity, and a new chimeric FIX with in-vivo increased activity and prolonged half- life. These results suggest that these new molecules could optimize protein replacement therapy forHB treatment

Esta Tesis Doctoral tiene como objeto de estudio la significación de los videojuegos. Si la forma en la que, desde niños, construimos universos de valores y damos sentido a nuestras vidas está indisolublemente unida a los medios y las obras de la cultura de masas, el estudio de los modos de significación del videojuego requiere, hoy en día, un desarrollo en profundidad. En relación con ello, el principal resultado de esta investigación consiste en la fundamentación teórica y metodológica de tres modelos de análisis del videojuego como discurso: un modelo de estructuras lúdicas, un modelo del discurso como universo narrativo y un modelo de enunciación interactiva. Asimismo, se ofrece una sistematización de los códigos de significación que conforman el lenguaje del diseño de videojuegos. Estos modelos constituyen una aportación metodológica innovadora a la Teoría del Videojuego y al Análisis del Discurso. Las fuentes teóricas y metodológicas fundamentales del trabajo son la Semiótica, la Ludología y la Narratología. La aplicación empírica de los modelos de análisis propuestos se centra en ejemplos y estudios de caso de videojuegos figurativos/narrativos, pero los modelos han sido construidos pensando en su posible utilidad para el análisis de un amplio espectro de videojuegos y otro tipo de textualidades colindantes, como los mundos narrativos de la literatura y las series televisivas. Finalmente, se cierra la investigación con dos estudios de caso donde se prueba el sistema teórico en su conjunto, sobre los videojuegos Ico (2001) y Shadow of the Colossus (2005), ambos del diseñador Fumito Ueda. / The object of study in this Doctoral Dissertation is the signification of videogames. Since early childhood, the way we construct universes of values and make sense of our lifes is closely related to the media and works of mass culture. Therefore, the study of the modes of signification of videogames requires to be fully developed. According to that, this research provides the theoretical and methodological fundamentals of three models of analysis of videogame as discourse: a model of ludic structures, a model of discourse as narrative universe and a model of interactive "énonciation". Besides that, a systematization of the main signification codes which compose the language of videogame design is carried out. These models constitute an innovative methodological contribution to Videogame Theory and Discourse Analysis.The theoretical and methodological framework of the research is built upon Semiotics, Ludology and Narratology.The empirical application of the proposed analytical models is focused on examples and case studies of figurative/narrative videogames. Nevertheless, the models have been constructed bearing in mind their possible utility for the analysis of a broad spectrum of videogames and other kinds of close textualities, like the narrative worlds from literature or television series. At the end of the research, the theoretical system is tested as a whole in two case studies: Ico (2001) and Shadow of the Colossus (2005). Both videogames have been designed by Fumito Ueda.

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Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit. / The epithelial sodium channel (ENaC) expressed in alveolar epithelial cells plays a major role for lung liquid clearance at birth and lung edema resorption in adulthood. The expression and activity of ENaC are inhibited by many pathophysiological stress that could have an impact in the clinical outcome of acute respiratory distress syndrome (ARDS). Pulmonary inflammation is an important factor in this inhibition that may promote or sustain pulmonary edema. We have previously shown that pro-inflammatory cytokines and lipopolysaccharide (LPS) from Pseudomonas aeruginosa inhibit αENaC mRNA expression by transcriptional and post-transcriptional mechanisms, suggesting that a modulation of αENaC mRNA stability could play a role in this process. The main objective of the present work was to characterize how different pathophysiological stress affect αENaC mRNA expression in alveolar epithelial cells and determine whether this modulation could be explained in part by regulating the stability of the transcript. Our study shows that LPS and cycloheximide decrease the level of αENaC mRNA with a similar time course and via the activation of the MAPK ERK1/2 and p38 signaling pathways. Despite similarities, there were important differences in the mechanisms involved in the modulation of αENaC mRNA expression. While LPS repress αENaC mRNA transcription, cycloheximide triggers post-transcriptional mechanisms involving the 3' untranslated region (3'UTR) of αENaC mRNA. To further study the role of αENaC 3'UTR in this process, we developed a Tet-Off model that allows us to measure the half-life of αENaC mRNA regardless of the use of a transcription inhibitor such as actinomycin D (Act. D). Using this system, we showed a 100 min half-life for αENaC mRNA, a much shorter time then the one reported for this mRNA using Act. D. We showed that Act. D has an important stabilizing effect on αENaC mRNA and cannot be used to assess the stability of the transcript. Using deletion mutants of the αENaC 3'UTR region, we determined how different portions of 3'UTR were important in modulating stability of the transcript. We found that the 3'UTR has dual functions, with portions important to promote stabilization (proximal 3'UTR) and others that strongly destabilize (distal 3'UTR) the transcript. Our system also allowed us to confirm that the decreased expression of αENaC mRNA induced by TNF-α results in part by a decreased stability of the mRNA. Finally, we identified several RNA-binding proteins that interact specifically with αENaC 3'UTR and determined if these proteins had an impact on transcript stability. Surexpression of two of these proteins in alveolar epithelial cells, DHX36 and TIAL1 was able to decrease the level of αENaC mRNA via a downregulation of mRNA stability. The work presented here shows the complexity of the signal transduction pathways elicited by different pathological stress conditions in alveolar epithelial cells and is the first to show that αENaC mRNA stability elicited by sequences in 3’UTR plays an important role in modulating the level of the transcript. The Tet-Off model that we developed allows to accurately estimate the half-life of αENaC mRNA and shows that the 3’UTR portion of the mRNA plays a complex role in the modulation of transcript stability in basal and pro-inflammatory conditions. Finally, we identified two putative RNA-binding proteins able to specifically recognize αENaC 3’UTR and modulate the transcript stability.

L‘adaptation des bactéries à leur environnement résulte de régulations de l’expression génique pour optimiser leur physiologie aux conditions de culture. Le contrôle de la concentration des ARNm constitue l’une de ces régulations. Il dépend à la fois des variations de transcription et de dégradation des messagers. Si ces deux mécanismes sont bien étudiés à l’échelle moléculaire chez E. coli, leurs poids respectifs sur la régulation du niveau des transcrits à l’échelle du génome restent inconnus en raison de l’absence de données omiques relatives à la dégradation des ARNm lors de changements environnementaux. D’autre part, les paramètres déterminant la stabilité des messagers sont mal identifiés et n’ont jamais été hiérarchisés.Au cours de cette thèse, la stabilité de chacun des ARNm d’E. coli a été mesurée par la détermination du stabilome. Plus précisément, le temps de demi-vie de près de 70 % de tous les messagers a pu être déterminé de façon fiable pour quatre taux de croissance différents obtenus dans les mêmes conditions de culture à l’aide de chémostats. Pour la première fois, cette étude démontre qu’une croissance bactérienne plus rapide entraîne une augmentation globale de la dégradation des transcrits. L’intégration de ces données avec les données transcriptomiques montre que même si la transcription est le mécanisme principal de régulation du niveau des messagers, la dégradation exerce un effet inverse dans la plupart des cas. De plus, le rôle de la dégradation dans le contrôle de la concentration des ARNm s’accentue de façon significative avec l’augmentation du taux de croissance et affecte particulièrement les gènes impliqués dans le métabolisme carboné central. À partir des données de stabilité générées à différents taux de croissance, des approches de biologie intégrative ont permis d’identifier et de hiérarchiser les déterminants de la dégradation des ARNm. Ainsi, la concentration des messagers qui est le principal paramètre, mais aussi le biais de codon, la longueur de la séquence codante et la présence de certains motifs de séquence déterminent la stabilité d’un ARNm. Toutefois, si la hiérarchie des déterminants identifiés reste identique avec la variation du taux de croissance, la stabilité des ARNm de certaines catégories fonctionnelles en est dépendante. Cependant, d’autres déterminants du temps de demi-vie des messagers, en particulier à fort taux de croissance, restent encore à être identifiés. La protéine CsrA, appartenant au système Csr, est un exemple de régulateur post-transcriptionnel qui contrôle positivement ou négativement l’expression d’ARNm par divers mécanismes qui peuvent modifier leur stabilité. Toutefois, l’étendue de l’action de CsrA sur la stabilité des ARNm à l’échelle omique n’a jamais été étudiée. En comparant les stabilomes et transcriptomes d’une souche sauvage et d’une souche où l’activité de CsrA est diminuée, les effets indirects transcriptionnels de CsrA ont été mesurés et de nouveaux ARNm cibles de CsrA dont la stabilité est régulée par la protéine (en majorité stabilisés) ont été identifiés. De plus, la protéine CsrD, régulateur de la stabilité des ARN non codants CsrB/C, n’est pas impliquée dans la régulation de la stabilité des ARNm, mais agit sur la transcription de nombreux gènes indépendamment de son rôle au sein du système Csr. En conclusion, ces travaux ont permis de mieux appréhender les régulations de la stabilité des ARNm, en identifiant leurs déterminants et en caractérisant leur rôle et portée dans le contrôle de la concentration des messagers. Ils soulignent en particulier l’importance de ces régulations dans le processus d’adaptation bactérien / Bacterial adaptation to environment results from regulations of gene expression to optimize cell physiology to growth conditions. Control of mRNA concentration is one of those regulations. It depends on both variations of transcription and transcript degradation. Although these two mechanisms are well defined at the molecular level in E. coli, their respective impact on mRNA level regulation is still unknown at the genome scale because of a lack of omic data on mRNA stability during changing environment. Moreover, parameters determining messenger stability are not yet clearly identified and have never been ranked.During this PhD, the stability of each of the E. coli mRNAs was measured through stabilome determination. More precisely, the half-life of around 70 % of all messengers was reliably determined at four different growth rates obtained in the same growth conditions in chemostats. For the first time, this study demonstrated that increase of growth rate led to global increase of transcript degradation. Integration of these data with transcriptomic data showed that although transcription was the main mechanism which regulated mRNA level, messenger degradation exerted an opposite effect in most of the cases. The role of messenger degradation in the control of mRNA concentration was significantly accentuated with increasing growth rate and affected particularly genes involved in central carbon metabolism. Using mRNA stability data produced at different growth rates, integrative biology approaches allowed identification and ranking of the determinants of messenger stability. mRNA concentration which was the main parameter, but also codon bias, length of the coding sequence, sequence motifs contributed to transcript stability. However, although the hierarchy of determinants remained identical with variations of growth rate, the stability of mRNAs belonging to specific functional categories differed with the growth rate. Nevertheless, other determinants of messenger half-life, in particular at high growth rates still remain to be discovered. The CsrA protein, which belongs to the Csr system, is one example of a post-transcriptional regulator. CsrA positively or negatively controls expression of several mRNAs by mechanisms able to modify transcript stability. Nevertheless, the extent of CsrA effect on mRNA stability at the omic level has never been studied. By comparing stabilomes and transcriptomes of the wild type strain with a strain with reduced CsrA activity, the indirect transcriptional effects of CsrA were measured and new mRNAs whose stability was targeted by CsrA (mostly stabilized), were identified. Moreover, the CsrD protein, a regulator of CsrB/C small RNA stability, was not involved in mRNA stability regulation, but played a role in transcriptional regulation of many genes independently of its role in the Csr system. To conclude, this work provides a better understanding of the regulation of the mRNA stability. It identifies mRNA stability determinants and characterizes the role and extent of mRNA stability regulation in the control of messenger concentration. The study underlines the importance of this regulation in the process of bacterial adaptation

Das Proteasom spielt eine zentrale Rolle beim Proteinabbau und der Antigen-Generierung für die adaptive Immunantwort. Vertebraten exprimieren zwei Typen des proteolytischen 20S-Kernkomplexes: das konstitutive c20S (mit den aktiven Untereinheiten beta 1, 2, 5) und das Immunoproteasom i20S (mit den Immunountereinheiten LMP2, MECL-1, LMP7). Die i20S-Expression wird durch Interferon_gamma (IFNg) induziert, was die Antigen-Präsentation auf MHC Klasse I und die Immunantwort gegen infizierte bzw. maligne entartete Zellen durch cytotoxische T-Zellen steigert. Proteasomen werden über komplexe, bisher unvollständig verstandene Biogenese-Prozesse formiert. Die initialen Schritte der humanen 20S-Formation wurden in dieser Arbeit untersucht und eine Methode zur Isolation früher Assemblierungsintermediate (EPIs) etabliert. Die 20S-Biogenese bedarf der Assistenz von Hilfsfaktoren wie dem Proteasom-Maturierungsprotein POMP. Diese Komponente von Precursorkomplexen stellt das erste Substrat gereifter c20S dar. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass POMP ebenfalls die i20S-Formation vermittelt und sich die Biogenese von c20S und i20S hinsichtlich der Maturierungskinetik unterscheidet. POMP wird durch IFNg induziert und interagiert mit der Immunountereinheit LMP7. Dieses molekulare Zusammenspiel bewirkt eine schnellere Maturierung von i20S- im Vergleich zu c20S- Precursorkomplexen, wodurch POMP einem schnelleren Abbau unterliegt. Die forcierte i20S-Biogenese ist eine intrinsische Eigenschaft und unabhängig von weiteren, IFNg-induzierten Faktoren. Nur die LMP7_E2-Variante vermittelt die schnelle Degradation von POMP, während das nicht funktionelle LMP7_E1 mit einer anderen Prosequenz nicht in i20S-Vorläufer inkorporiert wird. Somit führt die alleinige LMP7_E1-Expression in IFNg-stimulierten Carcinom-Zellen zu einer i20S-Defizienz, was eine mögliche Immunevasions-Strategie darstellt. Weiterhin besitzen beide 20S-Typen unterschiedliche Halbwertszeiten: i20S sind, unabhängig von weiteren IFNg-induzierten Proteinen, signifikant instabiler als c20S. Somit werden i20S sowohl schneller formiert als auch zügiger wieder abgebaut als c20S, womit sie typische Eigenschaften cytokin-regulierter Proteine aufweisen. Die i20S-Formation ist also eine transiente Antwort und stellt ein effizientes Instrument zur schnellen Reaktion auf immunologische Herausforderungen wie z.B. eine Infektion dar. Nach einer wirksamen Immunantwort erlaubt die geringere i20S-Stabilität eine schnelle Rückkehr zur standardmäßigen c20S-Expression. / The proteasome plays a crucial role in protein degradation and antigen generation for the adaptive immune response. Vertebrates express two types of the proteolytic 20S core complex: the constitutive proteasome c20S (with the active subunits beta 1, 2 and 5) and the immunoproteasome i20S (with the immunosubunits LMP2, MECL-1 and LMP7). Interferon_gamma (IFNg) induces the i20S expression, that supports a more efficient MHC class I antigen presentation and an effective immune response against infected or malignant cells by cytotoxic T-cells. Proteasomes are formed by a complex and not well understood biogenesis program. The initial steps in the human 20S formation have been analyzed in this thesis and a method for the isolation of ´early proteasome assembly intermediates´ (EPIs) has been established. The 20S biogenesis requires the assistance of accessory factors like the proteasome maturation protein POMP. This component of precursor complexes becomes the first substrate of the matured c20S. The described experiments demonstrate for the first time that POMP mediates the i20S formation and that biogenesis of c20S and i20S differ in their maturation kinetics. POMP is induced by IFNg and interacts with the immunosubunit LMP7. This molecular interplay provokes a faster maturation of i20S compared to c20S precursor complexes, whereby POMP becomes subject to a faster degradation. The accelerated i20S biogenesis is an intrinsic characteristic and independent of additional IFNg-induced factors. Exclusively the LMP7_E2 variant causes the rapid degradation of POMP, whereas the non-functional LMP7_E1 bearing another prosequence is not incorporated into i20S precursor complexes. Thus, LMP7_E1 expression in IFNg-stimulated carcinoma cells leads to a i20S deficiency pointing out a possible immune evasion strategy. In addition, both 20S types display different half-life values: i20S are, independent of other IFNg-induced proteins, significantly less stable than c20S. Thus, i20S are not only faster assembled, but also more quickly decomposed compared to c20S, showing typical attributes of proteins regulated by cytokines. Consequently, i20S formation is a transient response and represents an efficient instrument for a rapid adjustment to varying immunological challenges like an infection. Once the immune response has been effective, the lower stability of i20S permits an expeditious return to the standard c20S expression.