La transformation naturelle bactérienne permet aux micro-organismes d'échanger des informations génétiques pour promouvoir leurs réponses adaptatives pour faire face aux changements environnementaux. De l'ADN extracellulaire est incorporé et recombiné au génome de l'hôte. Ce processus augmente la plasticité des bactéries. Chez S. pneumoniae, un pathogène majeur chez l'Homme engendrant des infections pouvant être mortelles, la transformation bactérienne accentue la transmission de gènes de résistance aux antibiotiques. Chez les bactéries à Gram positif, l'opéron comF encode l'expression de deux protéines. L'une est démontrée comme étant essentielle à la transformation, est décrite pour être membranaire. La seconde n'a pas été étudiée. Cependant ces protéines n'ont pas été étudiées d'un point de vue structural ou fonctionnel. Des mutagenèse et le double hybride bactérien ont permis de mettre en évidence que ses protéines sont indispensables pour l'expression de la compétence et interagissent avec de nombreuses protéines du transformasome. De plus, l'expression des deux protéines de manière hétérologue prouve qu'elles sont solubles et forment des oligomères. L'analyse structurale de ComFA, atteste de la conformation atypique de cette helicase trimerique et hexamerique. En outre, l'activité ATPasique simple brin DNA-dépendant de cette protéine est démontrée. Finalement un complexe protéique a été révélé entre ComFA et ComFC dont l'étude microscopique à hautes résolutions prouve l'apparition d'un anneau via l'assemblage de deux hexamères. Ces résultats suggèrent que ComFA est le moteur tirant l'ADN dans la cellule. Quant à ComFC, elle semble aider à la stabilisation de ComFA. / Bacterial natural transformation allows microorganisms to exchange genetic information to promote their adaptive responses to cope with environmental changes. The extracellular DNA is incorporated and recombined with the genome of the host. This phenomenon increases the plasticity of Gram positive and negative bacteria. S. pneumoniae is a major pathogen for humans, which is causing infections that can be deadly. In this specie, bacterial transformation increases the transmission of antibiotic resistance.In Gram-positive bacteria, comF operon encodes the expression of two proteins. One of them, shown to be essential for natural transformation, is expected to be a membrane protein. The second is not described. However, up to now neither protein has been studied from a structural or functional point of view. Mutagenesis technique and double hybrid bacterial assay allowed to show that both proteins are essential for the expression of the competence and interact with many proteins of the transformasome. In addition, heterologous expresion of both proteins have shown their solubility and the formation of oligomers. Structural analysis of ComFA demonstrates the unique conformation of this hexameric and trimeric helicase. Furthermore, the ATPase single stranded DNA-dependent activity of this protein could be detected. Finally, a protein complex is formed between ComFA and ComF, and high-resolution microscopic study proves the occurrence of a ring via a two-hexamers. These results suggest that ComFA is the engine pulling the DNA in the cell. As for ComFC, this protein seems to help stabilizing of ComFA.

Le facteur bactérien Rho est une ARN hélicase toroïdale utilisant l’énergie issue de l’hydrolyse d’ATP pour transloquer le long de brins ARN et dissocier les obstacles moléculaires se trouvant sur son chemin. La fonction majeure de Rho est de provoquer la terminaison de la transcription. Les nombreuses études du facteur Rho d’E. coli (EcRho) ont montré que l’enzyme se fixe aux régions nues des transcrits naissants au niveau de sites Rut (Rho utilization) et utilise son activité de translocase ATPase-dépendante pour rattraper l’ARN polymérase et provoquer la dissociation du complexe d’élongation de la transcription. EcRho est impliquée dans 20 à 50 % des évènements de terminaison de la transcription chez E. coli et contribue à la régulation globale ainsi qu’à la protection du génome bactérien via divers mécanismes complexes. Le spectre d’activité restreint de la Bicyclomycine (BCM) – un antibiotique inhibant la fonction ATPase de Rho – suggère que Rho, bien qu’essentielle chez la plupart des espèces Gram- comme E. coli, est superflue chez la plupart des espèces Gram+. Pour vérifier cette hypothèse et mieux comprendre l’importance de Rho au sein de la diversité bactérienne, nous avons évalué la distribution et la conservation phylogénétique de Rho en utilisant les banques publiques de données génomiques et protéomiques. Nous avons observé que ~92% des espèces analysées (représentant la plupart des phyla bactérien) possèdent Rho (ou un gène rho) et que la présence de ce dernier semble être corrélée avec la complexité du génome, du programme de régulation et de l’écosystème de la bactérie. Cette complexité est illustrée par notre découverte que la protéine régulatrice CsrA contrôle la terminaison Rho-dépendante dans la partie 5’ UTR de l’opéron pgaABCD dont l’expression est critique pour la formation de biofilms par E. coli. En parallèle de ce travail, nous avons testé la proposition récente que le facteur Rho de Mycobacterium tuberculosis (MtbRho) opère par un mécanisme atypique indépendant de son activité ATPase, ce qui le rendrait insensible à la BCM. Nos résultats réfutent cette hypothèse et démontrent sans équivoque que MtbRho utilise un mécanisme similaire à celui de EcRho, pouvant être inhibé par la BCM (mais nécessitant des doses particulièrement élevées). L’ensemble de ces travaux apporte de nouvelles informations illuminant le rôle, le mécanisme et l’importance de Rho au sein de la biodiversité et conforte Rho comme cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques. / The bacterial Rho factor is a ring-shaped, hexameric RNA helicase which uses the energy derived from ATP hydrolysis to translocate along RNA strands, disrupting molecular roadblocks in its way. A major function of Rho is to induce termination of transcription. Extensive studies of the prototypical Rho factor from E. coli (EcRho) indicate that the enzyme binds naked regions of nascent RNA transcripts at the level of Rut (Rho utilization) sites and, then, uses its ATPase-dependent translocase activity to catch up with RNA polymerase and to trigger dissociation of the transcription elongation complex. EcRho is implicated in 20 to 50 % of all transcription termination events in E. coli and contributes to the global regulation and protection of the bacterial genome through various sophisticated mechanisms. The limited spectrum of activity of the antibiotic Bicyclomycin (BCM) – an inhibitor of Rho’s ATPase – suggests that Rho, while critical in many Gram- species such as E. coli, is dispensable in most Gram+ species. To verify this assumption and better understand the importance of Rho across the biodiversity, we assessed the phylogenetic distribution and conservation of Rho using public ‘omics’ databases. We found Rho (or a rho ORF) in ~92% of analyzed species (representing most bacterial phyla), its presence seemingly related to the complexity of the bacterial genome, regulatory program, and ecosystem. An illustration of this complexity is our discovery that regulatory protein CsrA mediates Rho-dependent termination in the 5’UTR of the pgaABCD operon whose expression is critical for biofilm formation by E. coli. In parallel, we tested the recent proposal that the Rho factor of Mycobacterium tuberculosis (MtbRho) operates by an atypical, ATPase-independent mechanism that would make it immune to BCM. Our results rule out this possibility and unambiguously show that MtbRho uses a mechanism similar to that of EcRho, one that can be inhibited by BCM (albeit at unusually high concentrations). Overall, this work provides key, new information to better understand the role, mechanism, and importance of Rho across the bacterial diversity and endorses Rho as a promising target for the development of new antibiotics.

Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau. / Human papillomaviruses (HPV) are small double-stranded DNA viruses that infect the differentiating epithelium of the skin and the mucosa. HPV rely on two viral proteins, E1 and E2, to replicate and maintain their genome in the nucleus of infected cells. During replication, the E1 helicase is recruited to the origin of replication by E2 and is assembled into a double-hexamer that unwinds DNA ahead of the replication fork. E1 is comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity, a central origin-binding domain and a N-terminal regulatory region that is required for viral DNA replication in vivo. The latter region of E1 contains a nuclear localization signal and a nuclear export signal that regulate its shuttling between the nucleus and cytoplasm. For bovine papillomavirus (BPV) E1, this shuttling was suggested to be controlled by the sumoylation of E1. In addition to the NES and NLS, the N-terminal region of E1 contains a conserved cyclin-binding motif that is required for the interaction of E1 with cyclin E/A-Cdk2. Cdk2 phosphorylation of E1 has been reported to control the nuclear export of E1 from BPV and HPV, albeit differently. In the first part of this study, we showed that although HPV E1 interacts with Ubc9, the conjugating enzyme of the sumoylation pathway, this pathway is not required for its accumulation in the nucleus. In the second part, we found that the nuclear accumulation of E1 is, instead, regulated by phosphorylation. Specifically, we found that Cdk2-dependent phosphorylation of conserved serines in the E1 N-terminal region inhibits the nuclear export of HPV E1. Furthermore, we reported that nuclear export is not essential to amplify the viral genome in differentiating keratinocytes but that it is required for its long-term maintenance in undifferentiated keratinocytes. Importantly, we found that the nuclear accumulation of E1 induces a S-phase arrest that is detrimental to cellular proliferation and that this anti-proliferative effect can be counteracted by the export of E1 from the nucleus to the cytoplasm. In the last part of this study, we showed that this arrest is dependent on the DNA- and ATP-binding activities of E1. Furthermore, we found that the cell cycle arrest induced by E1 is accompanied by the activation of a DNA damage response (DDR) dependent on the ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pathway. However, these two events seem to be distinct since complex formation with E2 reduces the ability of E1 to induce a DDR but does not prevent cell cycle arrest. Importantly, we demonstrated that transient viral DNA replication still occurs in S-phase arrested cells, independently of the induction of a DDR and of the ATM kinase. Collectively, these data indicate that nuclear export of E1 is regulated by phosphorylation and not by sumoylation. They also revealed that nuclear export of E1 is essential for maintenance of the viral episome in keratinocytes, at least in part to limit its nuclear accumulation and prevent its detrimental effect on cellular proliferation and induction of a DDR.

No description available.

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau. / Human papillomaviruses (HPV) are small double-stranded DNA viruses that infect the differentiating epithelium of the skin and the mucosa. HPV rely on two viral proteins, E1 and E2, to replicate and maintain their genome in the nucleus of infected cells. During replication, the E1 helicase is recruited to the origin of replication by E2 and is assembled into a double-hexamer that unwinds DNA ahead of the replication fork. E1 is comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity, a central origin-binding domain and a N-terminal regulatory region that is required for viral DNA replication in vivo. The latter region of E1 contains a nuclear localization signal and a nuclear export signal that regulate its shuttling between the nucleus and cytoplasm. For bovine papillomavirus (BPV) E1, this shuttling was suggested to be controlled by the sumoylation of E1. In addition to the NES and NLS, the N-terminal region of E1 contains a conserved cyclin-binding motif that is required for the interaction of E1 with cyclin E/A-Cdk2. Cdk2 phosphorylation of E1 has been reported to control the nuclear export of E1 from BPV and HPV, albeit differently. In the first part of this study, we showed that although HPV E1 interacts with Ubc9, the conjugating enzyme of the sumoylation pathway, this pathway is not required for its accumulation in the nucleus. In the second part, we found that the nuclear accumulation of E1 is, instead, regulated by phosphorylation. Specifically, we found that Cdk2-dependent phosphorylation of conserved serines in the E1 N-terminal region inhibits the nuclear export of HPV E1. Furthermore, we reported that nuclear export is not essential to amplify the viral genome in differentiating keratinocytes but that it is required for its long-term maintenance in undifferentiated keratinocytes. Importantly, we found that the nuclear accumulation of E1 induces a S-phase arrest that is detrimental to cellular proliferation and that this anti-proliferative effect can be counteracted by the export of E1 from the nucleus to the cytoplasm. In the last part of this study, we showed that this arrest is dependent on the DNA- and ATP-binding activities of E1. Furthermore, we found that the cell cycle arrest induced by E1 is accompanied by the activation of a DNA damage response (DDR) dependent on the ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pathway. However, these two events seem to be distinct since complex formation with E2 reduces the ability of E1 to induce a DDR but does not prevent cell cycle arrest. Importantly, we demonstrated that transient viral DNA replication still occurs in S-phase arrested cells, independently of the induction of a DDR and of the ATM kinase. Collectively, these data indicate that nuclear export of E1 is regulated by phosphorylation and not by sumoylation. They also revealed that nuclear export of E1 is essential for maintenance of the viral episome in keratinocytes, at least in part to limit its nuclear accumulation and prevent its detrimental effect on cellular proliferation and induction of a DDR.

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.

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The progression of replication forks can be slowed down or paused by various external and internal factors during DNA replication. This phenomenon is referred to as replication stress and substantially contributes to genomic instability that is a hallmark of cancer. Transcription complex belongs to the internal replication-interfering factors and represents a barrier for progression of the replication complex. The replication forks are slowed down or paused while passing through the transcriptionally active regions of the genome that can lead to subsequent collapse of stalled forks and formation of DNA double-strand breaks, especially under conditions of increased replication stress. DNA helicase RECQ5 is significantly involved in maintenance of genomic stability during replication stress, but the mechanisms of its action are not clear. In this diploma theses, we have shown that RECQ5 helicase, in collaboration with BRCA1 protein, participates in the resolution of collisions between replication and transcription complexes. BRCA1 protein is a key factor in the homologous recombination process, which is essential for the restart of stalled replication forks. Furthermore, we have shown that RECQ5 helicase is involved in ubiquitination of PCNA protein at stalled replication forks. Key words DNA...

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.