Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. / Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Ein vielversprechender Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Influenzavirus ist die kompetitive Inhibition der Virusanhaftung an die Wirtszellen durch Behinderung der Bindung des viralen Hemagglutinin (HA) an sialylierte Glykanrezeptoren. Allerdings erschwert die hohe Variabilität des HA die Entwicklung von universellen Sialinsäure (SA)-basierten Virostatika. In dieser Arbeit wurde der antivirale Effekt von mit SA funktionalisierten Polyglycerolen (PGs) auf Influenza A Viren (IAV) evaluiert. SA-basierte PGs waren nur bei der Inhibition einer geringen Anzahl an IAV Stämmen effektiv. Um die molekulare Basis für diese Beschränkung zu ergründen, wurden mittels Serienpassagen IAV Mutanten selektiert, die gegen sialyliertes PG resistent waren. Es entwickelten sich drei unabhängige resistente Virusvarianten, die einen einfachen bzw. doppelten Aminosäuren-Austausch in der HA RBS aufwiesen. Durch Hemagglutinations-Elution, Einzel-Virus Kraft-Untersuchungen und Glykanarray Analysen konnte eine verringerte Rezeptorbindungsstabilität sowie ein verändertes Rezeptorbindeprofil für diese Virusvarianten gezeigt werden. Interessanterweise wurden drei unterschiedliche Fälle von Virusbindung und Inhibition beobachtet: 1) Virales HA wurde vom PG gebunden und die Virusreplikation inhibiert, 2) virales HA wurde vom PG gebunden ohne Inhibition der Virusreplikation und 3) Virales HA wurde nicht vom PG gebunden und es gab keine Inhibition. Diese Ergebnisse suggerieren, dass es eine Mindestanforderung an die Affinität oder Avidität für eine effektive kompetitive Inhibition von HA gibt. Durch modifizierte PGs, die Sialyllaktose statt SA und einen Amidlinker enthielten, konnte das Potential von PGs als breite IAV Inhibitoren demonstriert werden. Zusammenfassend bieten die Ergebnisse dieser Arbeit wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Resistenzen in IAV gegen Inhibitoren des HA-Attachment und in das strategische Design von sialylierten mutlivalenten Inhibitoren gegen IAV. / A promising approach to block influenza virus infections is competitive inhibition of virus attachment to host cells by interfering with binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to sialylated glycan receptors. However, the high structural and genetic variability of the viral HA has hampered the development of universal sialic acid (SA)-based antivirals. Here, the antiviral effect of biocompatible Polyglycerols (PGs) functionalized with SA on influenza A virus (IAV) was evaluated. PG compounds were only effective at inhibiting a narrow spectrum of IAV strains. To elucidate the molecular basis for this restriction, PG-resistant IAV mutants were selected using serial passaging. Three independent resistant variants developed with single or double amino acid changes mapping to the HA RBS. By employing hemagglutination elution, single-virus force measurements and glycan array analyses, a reduced receptor binding stability as well as an altered receptor binding profile of mutant viruses was shown. Intriguingly, three different cases of virus binding and inhibition were observed using Cy3-labeled compound: 1) viral HA was bound by the compound and resulted in inhibition of replication, 2) viral HA was bound by the compound but replication was not inhibited and 3) viral HA was not bound by the compound and no inhibition occurred. These results suggest that there is an affinity or avidity requirement for effective competitive inhibition of HA attachment. The suitability of PGs as IAV inhibitors with potential for broad activity was demonstrated by a modified PG incorporating sialyllactose instead of SA and an amide linkage covering an extended spectrum of inhibited IAV strains. Taken together, results described in this thesis provide valuable insights into the development of resistance against inhibitors of HA attachment in IAV and into the strategic design of sialylated, multivalent inhibitors aiming at broad activity against influenza viruses.

Der Eintritt von Influenza A Viren in Wirtszellen erfolgt anhand des Hämagglutinin (HA) Proteins. Neueste Entwicklungen zielen darauf ab, die fusionsinduzierende Konformations-änderung des HA und damit die Freisetzung des viralen Genoms in die Wirtszelle zu inhibieren. Der Fusionsprozess ist pH-abhängig da nur bei einem niedrigen pH-Wert (~5.0-6.0) die Protonierung bestimmter Reste innerhalb des HA eine Konformationsänderung, und somit die Membranfusion, auslöst. Die Identifizierung von konservierten, titrierbaren Resten und die Aufklärung der Strukturveränderungen im HA ermöglichen eine gezielte Entwicklung neuer antiviraler Medikamente. In dieser Arbeit wurden bestimmte Histidine im HA mittels umfassender experimenteller und theoretischer Methoden als potentielle pH-Sensoren untersucht. Dabei konnte das Histidin an Position 184 als wichtiger Schalter der pH-induzierten Konformationsänderung identifiziert werden. Außerdem bewirkte der Austausch des geladenen Rests an Position 216 in der Nähe des His184 eine Veränderung der pH-Abhängigkeit des H5 HA aufgrund der Beeinflussung des pKa-Werts des His184. Da die Mutation R216E im HA des hochpathogenen H5N1 Virus in allen Isolaten während der Vogelvirenseuche im Jahr 2003/04 detektiert wurde, deutet das Ergebnis daraufhin, dass diese Mutation zur Entstehung des hochvirulenten Vogelvirus und dessen Adaptierung an den Menschen beigetragen hat. In diesem Zusammenhang wurde auch der Einfluss der pH-Abhängigkeit des HA auf die Fusion und Infektiosität von Viren in lebenden Zellen getestet. Eine destabilisierende Mutation im HA eines rekombinanten WSN-H3 Virus reduzierte dessen Infektions- und Replikationseffizienz in MDCK-Zellen, was auf den endosomalen pH-Wert dieser Zellen zurückgeführt werden konnte. Die Messung der Virus-Endosom-Fusionskinetik in lebenden Zellen machte außerdem die Bedeutung der pH-Abhängigkeit des HA für den Zeitpunkt der Membranfusion und dessen Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion deutlich. / The entry of influenza A virus into host cells is established by the hemagglutinin (HA) protein. New antiviral strategies aim to inhibit the fusion inducing conformational change of HA and thereby liberation of the viral genome into the cell. This process is strictly pH dependent since the conformational change of HA initiating the fusion of membranes only occurs upon protonation of yet unknown residues within HA at low pH (~5.0-6.0). The identification of conserved titrable residues and better understanding of the sequential structural rearrangements within HA may facilitate the development of new broad-spectrum antivirals. In the present work His184 and His110 were characterized as potential pH sensors by a comprehensive mutational and computational analysis. The results suggest that His184, but not His110, is an important regulator of HA conformational change at low pH. Furthermore, an exchange of charge at position 216 in vicinity to His184 was shown to alter the pH dependence of conformational change and of fusion in correlation to the known pKa dependence of histidines on neighboring residues. The result advocates that the mutation R216E, which emerged in the highly pathogenic H5 HA in 2003-2004, contributed to an altered acid stability of H5 HA via its effect on His184 and thus to the adaptation of avian H5N1 viruses to the human host. Therefore, the role of an altered acid stability of HA for viral fusion and infectivity in living cells was assessed. Recombinant viruses containing a destabilizing mutation in the HA protein were found to have a reduced infectivity and replication efficiency in MDCK cells compared to the respective wild type. Studying virus-endosome fusion kinetics in these cells we could resolve a significant difference in the timing of fusion induction suggesting that the time-point of fusion is a critical determinant of viral infection efficiency which depends on the endosomal acidification as well as on the acid stability of HA.

Der Viruspartikelzusammenbau hängt von der Anreicherung viraler Untereinheiten in spezifischen Domänen der PM ab. Es wird vorgeschlagen, dass Membran-Rafts – geordnete, sphingomyelin- und cholesterinreiche Mikrodomänen in der PM – als lokale Rekrutierungsstellen dienen. Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Glykoprotein in der Hülle des Influenzavirus. Es dient der Bindung an die Wirtszelle und der Fusion mit dem Endosom. Es wird angenommen, dass HA bei der Abschnürung der Viruspartikel von der Zelle mitwirkt. Zwei Hauptbeobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich HA in Lipid-Mikrodomänen einlagert: HA wurde biochemisch in Detergens-resistenten Membranen nachgewiesen und die Virushülle ist mit raftbildenden Lipiden angereichert. Um die Rolle der HA-Transmembrandomäne für die Lipid-Raft-Inkorporation aufzuklären, wurde ein Konstrukt entwickelt, das den C-Terminus von HA mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP fusioniert, und die Transmembrandomäne, nicht aber die N-terminale Ektodomäne von HA enthält. In transfizierten Säugetierzellen wurde der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen diesem Konstrukt und einem GPI-verankerten cyan fluoreszierenden Protein CFP (Raft-Marker) durch Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich HA-Konstrukte in Cholesterin-abhängigen Lipiddomänen anreichern, was durch eine erhöhte FRET-Effizienz nachgewiesen wurde. Zudem führen ein Cholesterinentzug aus der PM und die Deletion hochkonservierter Palmitylierungsstellen zu einer signifikanten Verringerung selbiger; sehr gering war diese zwischen dem HA-Konstrukt und einem Nicht-Raft-Marker. Darüberhinaus konnte durch ortsspezifische Mutagenese gezeigt werden, dass die verwendeten Konstrukte disulfidbrückenverbundene Oligomere bilden, welche Voraussetzung für den Transport der Konstrukte an die PM sind. Zeitaufgelöste Anisotropiemessungen ergaben für diese ein starkes Homo-FRET-Signal, welches die Oligomerisierungshypothese bestätigt. / Numerous enveloped viruses bud from the host cell plasma membrane (PM). Assembly of the new viral particles depends on the accumulation of the viral subunits at specific sites of the cell membrane. Lipid domains or rafts enriched of sphingomyelin and cholesterol were suggested as sites for local recruitment of viral components. Hemagglutinin (HA), a homotrimeric glycoprotein embedded in the envelope of influenza virus, mediates binding of the virus to the host cell and fusion between the viral envelope and the endosomal membrane. HA might play an important role in budding of the viral particles from the host cell. Two observations led to the suggestion that HA entraps in lipid microdomains. First, HA was rescued in DRM fractions, second the viral envelope was found to be enriched in lipids generally forming rafts. To elucidate the role of the HA transmembrane domain in lipid raft localization we expressed constructs harboring the transmembrane domain and the cytoplasmic tail but lacking the N-terminal ectodomain of HA in the PM of mammalian cells. We studied energy transfer (FRET) between these constructs and a GPI anchored CFP as a raft marker by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Our results suggest that HA constructs are indeed sorted into cholesterol-dependent lipid domains since cholesterol depletion of the PM caused a significant decrease of FRET efficiency. Likewise, deletion of the three highly conserved palmitoylation sites of HA is also accompanied by a reduction of FRET efficiency. Site directed mutagenesis demonstrated that TMD-HA constructs form disulfide linked oligomers and that oligomerization is fundamental for the transport to the PM. This result was corroborated by time resolved anisotropy measurements that revealed strong homoFRET between TMD-HA-YFP molecules, thus indicating protein clustering. Accordingly, trimerization of full length HA is fundamental for stability and the subsequent delivery of the protein to the cell surface.

Das Hüllglykoprotein Hämagglutinin (HA) von Influenzavirus ist verantwortlich sowohl für die Bindung als auch für die nachfolgende Fusion der viralen Hülle mit der endosomalen Membran. Eine Analyse der 3D Struktur der HA-Ektodomaine zeigt, dass die Stabilität des Proteins sowohl durch kovalente als auch durch nicht-kovalente Wechselwirkungen bedingt ist. Die Konformationsänderung von HA bei saurem pH-Wert weißt auf eine mögliche Rolle von Protonierungseffekten auf ionisierbare Aminosäuren hin. Untersuchungen zur Bedeutung geladener Aminosäuren und Salzbrücken für die Struktur des HA wurden auf der Grundlage von ‚site directed mutagenesis’ durchgeführt. Der Einfluss der Mutationen auf die Konformationsänderung und die Fusionsaktivität von HA wurden durch einen Proteinase K-Assay bzw. Fluoreszenzmikroskopie erfasst. Die Ergebnisse beider Methoden wurden miteinander korreliert. Abgesehen von der Mutante R109E zeigten Wildtyp-HA und alle anderen Mutanten eine vergleichbare Oberflächenexpression. Die beobachteten Unterschiede in der pH-Abhängigkeit der Konformationumwandlung zwischen Wildtyp-HA und HA-Mutanten zeigen, daß eine Zerstörung von Salzbrücken und ggf. eine Erhöhung der elektrostatischen Abstoßung an den betrachteten Kontakstellen sehr wahrscheinlich eine Herabsetzung der energetischen Barriere der Konformationsumwandlung verursacht. Dieser Ergebnisse erklären die molekularen Grundlagen des erhöhten pH-Schwellwertes der HA-Konformationsumwandlung von Amantadin-resistenten Influenzaviren. Im Gegensatz wurde für Mutanten, die die Stabilität von HA erhöhten, keine Konformationsumwandlung bei einem pH-Wert beobachtet, der typisch für die Konformationumwandlung von Wildtyp-HA war. Aminosäuren, die denen dieser stabiliserenden Mutationen entsprachen, wurden in einer natürlichen Influenzavirusvariante – A/JPN/305/57 – gefunden. Die Bedeutung von Ladungen für die Stabilität der HA-Ektodomaine wird dadurch unterstrichen, dass eine Konservierung einer positiven Ladung und insbesondere eines Argininrestes in der Position 109 (Nummerierung auf der Basis von HA X31) für alle Influenzaviren A und B gefunden wurde. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass sehr wahrscheinlich eine komplexe Salzbrücke an der Kontaktfläche zwischen HA1 und HA2 für alle Influenzaviren A evolutionär konserviert ist. / Hemagglutinin (HA), a major envelope glycoprotein is responsible for fusing viral and endosomal membranes during influenza virus entry. The analysis of 3D crystal structure of the HA ectodomain shows that the stability of protein is maintained by both non-covalent and covalent interactions. The conformational change of HA at low pH indicates a role for protonation effects of the ionisable amino acids. Structural investigations were done using “site directed mutagenesis” in order to conceive the importance of charged amino acids and more emphatically the involvement of salt bridges. The effect of mutations on the conformational change and fusion activity was probed by proteinase K assay and fluorescence microscopy respectively. It was observed that HA-wt and all the mutants except R109E showed comparable surface expression. The difference in pH threshold between the HA-wt and the mutants showed that breakage of salt bridge and further incorporation of repulsion at the considered interfaces would lower the energy barrier requirements for the conformational change. The results explain the molecular basis of the higher pH threshold for naturally occurring amantadine resistant mutants. On the other hand, mutants designed to stabilise the HA were resistant to conformational changes at those pH values which typically trigger the conformational change of HA-wt. Coincidentally these mutations were found to be existing in the natural variant of H2 Japan subtype (A/JPN/305/57). Interestingly, the study shows that a positive charge and, more specifically, an Arg residue at position 109 (numbering based on X-31 strain) is conserved in all of the influenza A and B viruses underlining the relevance of electrostatic interactions for the HA stability. Aptly a complex salt bridge at the interface of HA1 and HA2 is probably conserved evolutionarily in all the members of influenza A virus.

Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus ist eine mögliche Zielstruktur für antivirale Therapeutika. Aus der Menge experimenteller HA-Inhibitoren stechen die kürzlich beschriebenen Q-beta-Sialoside aufgrund ihrer hohen Affinität und akkuraten, multivalenten Abbildung der Rezeptorbindungsstellengeometrie hervor. Anknüpfend an diese Eigenschaften beschreibt die vorliegende Arbeit die Erweiterung der Q-beta-Sialosidplattform durch neuartige Varianten und Anwendungsgebiete. Verschiedene Strategien für die Entfernung von Lipopolysacchariden aus Kapsidproben wurden untersucht, wobei sich das Verfahren der Cloud Point als am besten geeignet herausstellte. Das gereinigte Material war geeignet für in vivo Versuche. Teilsialylierte Kaspidvarianten wurden auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und im Vergleich der Ergebnisse mit statistischen Berechnungen Hinweise auf einen vorherrschend trivalenten Bindungsmodus zwischen Q-beta-Sialosiden und HA gefunden. Die Arbeit beinhaltet die ersten Beispiele heterobifunktionaler Q-beta-Sialoside, die verschiedene Sialinsäureliganden oder Kombinationen aus Zuckern und Fluoreszenzfarbstoffen aufweisen. Die fluoreszenzmarkierten Kapside wurden in Mukus-Mobilitätsstudien angewendet und ihre Undurchgängigkeit der äußeren Mukusbarriere visualisiert. Mehrere Sialinsäureester wurden als potenzielle ladungsmaskierte Liganden für erhöhte Mukusgängigkeit untersucht. Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit war die Entwicklung eines peptidbasierten HA-Inhibitors. Eine Gruppe von aus HA-bindenden Antikörpern und Lactoferrin abgeleiteten Peptiden wurde mit Hilfe der mikroskaligen Thermophorese auf ihre Affinität zu HA oder Influenza A/X31 (H3N2) getestet. Die vorläufigen Resultate weisen auf eine gute Bindung mehrerer Kandidaten hin. Multivalente Peptid-Polymer-Konjugate wurden auf Basis von linearem Polygylcerol niedrigen Molekulargewichts synthetisiert, jedoch zeigte keines eine Inhibierung der getesteten Influenzastämme. / The influenza virus hemagglutinin (HA) attracts much attention as a target widely unexploited by licensed therapeutics. From the numerous experimental HA inhibitors, the recently reported Q-beta sialosides stand out through their affinity and accurate, multivalent reflection of the receptor binding site geometry. Building upon these characteristics, this work expands the variety of the Q-beta sialoside platform with novel variants and explores new areas of application. Several strategies were compared to remove lipopolysaccharides from capsid preparations, determining cloud point extraction as the most suitable. The purified material shown to be suitable for in vivo experiments. The inhibitory activities of partially sialylated capsids were compared to statistical models to obtain evidence for the prevalence of trivalent interactions between Q-beta sialosides and HA. Moreover, this work contains the first examples of heterobifunctional Q sialosides, bearing multiple sialic acid (SA) ligands or combinations of sugars and fluorescent dyes. Fluorescently labeled Q-beta sialosides were applied in mucus mobility studies to visualize their entrapment in the outer mucus layer. Several SA esters were examined as potential masked-charge ligands to increase mucus permeation. A second focal point of the thesis was the design of a novel, peptide-based HA inhibitor. A library of peptides derived from HA-binding antibodies and lactoferrin was investigated using microscale thermophoresis for binding to recombinant HA or influenza A/X31 (H3N2) concentrate. Preliminary results indicated good affinity for some candidates. Multivalent polymer-peptide conjugates of several peptides were synthesized by immobilization on low molecular weight linear polyglycerol. However, none of the conjugates was able to inhibit influenza strains A/X31 (H3N2) or A/PR8 (H1N1) in a hemagglutination inhibition test.

Das Hämagglutinin (HA) der Influenzaviren wird während der Assemblierung in Cholesterin- und Sphingolipid-reiche Domänen (Rafts) der Plasmamembran rekrutiert. Vorangehende Studien konnten mittels Fluoreszenzresonanzenergietransfer eine Raft-Integration nachweisen, die von zwei Raft-Zielsignalen abhängig war; zum einen von drei S-acylierten Cysteinen in der zytoplasmatischen Domäne und zum anderen von hydrophoben Aminosäuren (VIL) am Beginn der Transmembrandomäne (TMD). Zudem zeigte sich ein möglicher Einfluss des VIL-Motives auf den intrazellulären Proteintransport. Um diese Annahme zu bestätigen, wurden HA Mutanten in Zellen exprimiert und ihre Ankunft im medialen und trans-Golgi verfolgt. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des VIL-Motives am Transport bestätigt werden, jedoch nicht der S-Acylierungen. Zudem wurde eine generelle Abhängigkeit des Transportes von der Sphingolipidsynthese beobachtet. Da sowohl die Cholesterinsynthese als auch die Sphingolipidsynthese für den Transport von HA benötigt werden, habe ich die Hypothese aufgestellt, dass das VIL-Motiv in der Lage sein könnte, mit Raft Lipiden zu interagieren. Ein Sequenzvergleich ergab, dass kein Sphingolipid-Bindemotiv vorhanden ist, jedoch ein potenzielles Cholesterin-Consensus-Motiv (CCM, W/Y-I/V/L-K/R). Dieses Motiv wurde nur in der Sequenz von Gruppe 1 jedoch nicht Gruppe 2 HAs gefunden und umfasst das Leucin des VIL Motives. Tatsächlich ist die Mutation des Leucins aber nicht des vorangehenden Isoleucins für den verzögerten Transport verantwortlich. Untersuchungen weiter Einzel- und Mehrfachmutanten konnten eine Abhängigkeit des intrazellulären Transportes von einer möglichen Cholesterinbindung verifizieren. Zudem konnte auch ein zunehmender Effekt auf die Kinetiken vom medialen Golgi zum TGN beobachtet werden, welcher auch die Oberflächenexpression negativ beeinflusste. FLIM-FRET Analysen zeigten zusätzlich eine reduzierte Raft Assoziation der CCMMutanten mit Rafts an der Plasmamembran. Daher kann man spekulieren, dass HA mit Cholesterin interagiert, wodurch sein intrazellulärer Transport durch den Golgi und die Assoziation mit Rafts gewährleistet wird. / During assembly the hemagglutinin (HA) of influenza viruses is recruited to cholesterol- and sphingolipid rich domains of the plasma membrane (lipid rafts). Preceding studies using fluorescence resonance energy transfer showed that lipid-raft integration is dependent on two raft-targeting signals, three S-acylated cysteines located in the cytoplasmic tail and hydrophobic amino acids (VIL) in the part of the transmembrane region (TMR). Furthermore, they gave rise to the assumption that at least the VIL motif might also be important for the intracellular transport of the protein along the exocytic pathway. To verify this assumption, HA mutants were transiently expressed in cells and their arrival in the medial and trans-Golgi compartment was quantified. The observation regarding the involvement of the VIL motif, but not the S-acylation, was verified and a general dependency of HA´s transport on sphingolipid synthesis was detected. Since both cholesterol and sphingolipid synthesis are needed for the transport of HA, I hypothesized that the VIL motif might be able to interact with raft lipids. Sequence alignment revealed no sphingolipid-binding motif, but a putative cholesterol consensus motif (CCM, W/Y-I/V/L-K/R). This CCM is found only in the sequence of group 1 but not group 2 HAs and includes the leucine of the VIL motif. Indeed, mutation of the leucine, but not of the preceding isoleucine is responsible for the delayed transport. Investigation of further single and multiple mutations in the CCM verified a dependency of HA´s intracellular transport on the putative cholesterol-binding motif. Additionally the effect on the kinetics increased from the medial Golgi to the TGN also negatively effecting surface expression. Analysis by FLIM-FRET furthermore displayed a reduced association of HA with mutations in the CCM with lipid rafts at the plasma membrane. Therefore, it is speculated that HA associates with cholesterol, an interaction that facilitates its intracellular transport through the Golgi and association with lipid rafts at the plasma membrane.

Das Prinzip der Multivalenz ist in der Natur allgegenwärtig, welches auch von Influenza-Viren genutzt wird, um über ihre Oberflächenproteine an epitheliale Wirtszellen zu binden. Diese Interaktion bietet einen interessanten Ansatzpunkt für multivalente Inhibitoren, wenn es gelingt, die Bedingungen für eine effiziente Wechselwirkung mit dem Virus zu entschlüsseln. Hierzu wurde in dieser Arbeit eine Charakterisierung des Hämagglutinin-Trimers (HA) auf viralen Partikeln mittels Kohlenhydrat-Nukleinsäuregerüsten und Kohlenhydrat-Polyethylenglykol (PEG)-Gerüsten vorgenommen. Distanz-Affinitäts-Beziehungen für die Interaktion des trimeren HA mit den bivalenten Präsentationen des Sialyl-LacNAc zeigten, dass bivalente PEG-Konjugate nicht in der Lage sind, eine bivalente Verstärkung der Wechselwirkungen mit der löslichen HA-Ektodomäne oder mit HA auf der viralen Oberfläche herbeizuführen, wobei die räumliche Rasterung mit PNA∙DNA-Gerüsten eine bimodale Distanz-Affinitäts-Beziehung ergab. Ein Affinitätsmaximum in einem Abstand von 52 - 59 Å wurde einer simultanen Bindung an zwei kanonische Bindungsstellen eines HA-Trimers zugeordnet, wobei ein zweites Affinitätsmaximum bei 26 Å auf die Existenz einer sekundären Bindungsstelle hindeutet. In dieser Arbeit wurde erstmals die multivalente Präsentation von Glykoliganden auf langen repetitiven DNA-Templaten demonstriert. Es wurden Nukleinsäure-Komplexe erhalten die eine vollständige Inhibierung der Virus-induzierten Hämagglutination bei einer Konzentration von 10^(-9) M des Templats erzielten, was einer 10^7-fachen Verstärkung bezogen auf den monovalenten Zucker entspricht. Neben einer hochpotenten Inhibition offenbarten distanzoptimierte bivalente und multivalente Binder auf Nukleinsäuregerüsten auch subtypspezifische Inhibition. / The principle of multivalency is omnipresent in nature, which is also used by influenza viruses to bind to epithelial host cells via their surface proteins. This interaction offers an interesting starting point for multivalent inhibitors if the conditions for an efficient interaction with the virus can be deciphered. For this purpose, the hemagglutinin trimer (HA) on viral particles was characterized using carbohydrate-nucleic acid scaffolds and carbohydrate-polyethylene glycol (PEG) scaffolds. Distance-affinity relationships for the interaction of the trimeric HA with the bivalent presentations of the sialyl-LacNAc showed that bivalent PEG conjugates are not capable of a bivalent enhancement of the interactions with the soluble HA ectodomain or with HA on the viral surface, whereby the spatial screening with PNA∙DNA scaffolds resulted in a bimodal distance-affinity relationship. An affinity maximum at a distance of 52 - 59 Å was assigned to simultaneous binding to two canonical binding sites of an HA trimer, with a second affinity maximum at 26 Å indicating the existence of a secondary binding site. In this work the multivalent presentation of carbohydrate ligands on long repetitive DNA templates was demonstrated for the first time. Nucleic acid complexes were obtained which achieved a full inhibition of the virus-induced hemagglutination at a concentration of 10^(-9) M of the template, which corresponds to a 10^7-fold increase in relation to the monovalent sugar. In addition to a highly potent inhibition, distance-optimized bivalent and multivalent binders on nucleic acid structures also revealed subtype-specific inhibition.

[ES] Antecedentes: El virus de la gripe es una de las principales causas de infecciones respiratorias a nivel mundial, provocando epidemias estacionales con un impacto significativo en la salud pública y en la economía. A pesar de más de mil millones de casos anuales en el mundo, algunas personas expuestas al virus permanecen asintomáticas. La causa de esta resistencia no se ha aclarado, pero comprenderla podría conducir a nuevas estrategias preventivas y terapéuticas. En un estudio previo de nuestro laboratorio se identificó un péptido antimicrobiano humano (AMP), la dermicidina, a partir de genotecas de individuos asintomáticos, sugiriendo un posible papel antiviral. Esta tesis analiza si las diferencias de susceptibilidad a la gripe están relacionadas con la producción de dermicidina. Objetivos: Este trabajo tiene como objetivo confirmar y caracterizar la actividad antiviral de la dermicidina contra el virus de la gripe, centrándose en los subtipos H1N1 y H3N2. Investiga también el mecanismo de acción del péptido, su papel en la susceptibilidad a padecer los síntomas de gripe y su producción en las vías respiratorias humanas. Además, evalúa el potencial terapéutico de la dermicidina, incluyendo su citotoxicidad, tolerabilidad y eficacia en un modelo animal. Métodos: Se evaluó la actividad antiviral de la dermicidina y sus derivados mediante ensayos de inhibición de hemaglutinación (HAI) y ensayo de placa contra siete cepas del virus de la gripe en cultivos celulares. Se estudió el mecanismo de acción mediante ensayos de afinidad, acoplamiento molecular y simulaciones dinámicas. Los niveles de dermicidina en muestras humanas se analizaron con ELISA, y se realizaron análisis genéticos comparativos de individuos sintomáticos y asintomáticos mediante secuenciación PacBio y VarScan. La citotoxicidad se evaluó con el ensayo MTT, y la eficacia terapéutica se probó en ratones Balb/c analizando peso, síntomas, carga viral y producción de citoquinas inflamatorias. Resultados y discusión: Esta tesis caracteriza la actividad antiviral de la dermicidina, identificando DCD-1L como el péptido más efectivo, con concentraciones inhibitorias de 81-254 µM contra los subtipos H1N1 y H3N2. La dermicidina se une a la zona del tallo de la hemaglutinina (HA), bloqueando la etapa inicial de la infección, un mecanismo conservado que podría ser eficaz contra otros virus con HA, como el coronavirus humano OC43 y el virus del sarampión. La dermicidina se produce en las rutas de entrada viral en humanos (lágrimas, saliva y secreciones nasofaríngeas), con mayores niveles en individuos asintomáticos, lo que podría explicar su resistencia. Este péptido también se sobreproduce en respuesta a infecciones respiratorias, lo que confirma su papel en la respuesta inmune innata. En el análisis genético no encontraron variantes asociadas con la resistencia a los síntomas, sugiriendo que la mayor producción de dermicidina es clave. Estudios en animales confirmaron que DCD-1L es seguro, bien tolerado y eficaz, comparable al zanamivir cuando se co-incuba con el virus. Conclusión: La susceptibilidad a los síntomas de la gripe está parcialmente asociada con la producción de dermicidina en las rutas de entrada de virus respiratorios. Los resultados destacan su potencial uso como agente terapéutico para tratar y prevenir la gripe y otras infecciones virales respiratorias. / [CA] Antecedents: El virus de la grip és una de les principals causes d'infeccions respiratòries, provocant epidèmies estacionals amb un impacte significatiu en la salut pública i en l'economia. Tot i més de mil milions de casos anuals en tot el món, algunes persones exposades al virus romanen asimptomàtiques. La causa d'aquesta resistència no s'ha aclarit, però comprendre-la podria portar a noves estratègies preventives i terapèutiques. Un estudi previ del nostre laboratori va identificar un pèptid antimicrobià humà (AMP), la dermicidina, en genoteques d'individus asimptomàtics, suggerint un possible paper antiviral. Aquesta tesi analitza si les diferències de susceptibilitat a la grip estan relacionades amb la producció de dermicidina. Objectius: Aquest treball té com a objectiu confirmar i caracteritzar l'activitat antiviral de la dermicidina contra el virus de la grip, centrant-se en els subtipus H1N1 i H3N2. Investiga també el mecanisme d'acció del pèptid, el seu paper en la susceptibilitat als símptomes i la seua producció en les vies respiratòries humanes. A més, avalua el potencial terapèutic de la dermicidina, incloent-hi la seua citotoxicitat, tolerabilitat i eficàcia en un model animal. Mètodes: Es van avaluar els efectes antivirals de la dermicidina i els seus derivats mitjançant assajos d'inhibició de l'hemaglutinació (HAI) i de plaques contra set soques del virus de la grip en cultius cel·lulars. Es va estudiar el mecanisme d'acció amb assajos d'afinitat, acoblament molecular i simulacions dinàmiques. Els nivells de dermicidina en mostres humanes es van analitzar amb ELISA, i es van fer anàlisis genètiques comparatives d'individus simptomàtics i asimptomàtics mitjançant seqüenciació PacBio i VarScan. La citotoxicitat es va avaluar amb l'assaig MTT, i l'eficàcia terapèutica es va provar en ratolins Balb/c analitzant pes, símptomes, càrrega viral i citoquines inflamatòries. Resultats i Discussió: La tesi caracteritza l'activitat antiviral de la dermicidina, identificant DCD-1L com el pèptid més efectiu, amb concentracions inhibidores de 81-254 µM contra els subtipus H1N1 i H3N2. La dermicidina s'uneix a la zona del tronc de l'hemaglutinina (HA), bloquejant l'etapa inicial de la infecció, un mecanisme conservat que podria ser eficaç contra altres virus amb HA, com el coronavirus humà OC43 i el virus del xarampió. La dermicidina es produeix en les vies d'entrada viral en humans (llàgrimes, saliva i secrecions nasofaringees), amb nivells més alts en individus asimptomàtics, cosa que podria explicar la seua resistència. Aquest pèptid també es sobreprodueix en resposta a infeccions respiratòries, confirmant el seu paper en la resposta immune innata. L'anàlisi genètica no va trobar variants associades amb la resistència als símptomes, suggerint que la major producció de dermicidina és clau. Els estudis en animals van confirmar que DCD-1L és segur, ben tolerat i eficaç, comparable al zanamivir quan es co-incuba amb el virus. Conclusió: La susceptibilitat a patir els símptomes de la grip està parcialment associada amb la producció de dermicidina en les vies d'entrada de virus respiratòries. Els resultats destaquen el seu potencial ús com a agent terapèutic per a tractar i prevenir la grip i altres infeccions virals respiratòries. / [EN] Background: Influenza virus is one of the major causes of respiratory infections, leading to seasonal epidemics with significant economic and public health impacts. Despite over a billion cases annually worldwide, some individuals exposed to the virus remain asymptomatic. The basis for this resistance is unclear, but understanding it could lead to new preventive and therapeutic strategies. A previous study from our lab identified a human antimicrobial peptide (AMP), dermcidin, from DNA libraries of asymptomatic individuals, suggesting a potential antiviral role. This thesis explores whether susceptibility differences to influenza are linked to dermcidin production. Objectives: This research aims to confirm and characterize the antiviral activity of dermcidin against influenza virus, focusing on two main subtypes (H1N1 and H3N2). It also investigates the peptide's mechanism of action, its role in susceptibility to symptoms, and its production in human respiratory pathways. Additionally, it evaluates dermcidin's potential as a therapeutic agent, including its cytotoxicity, tolerability, and efficacy in an animal model. Methods: The antiviral effects of dermcidin and derived peptides were tested using hemagglutination inhibition (HAI) and plaque inhibition assays against seven influenza virus strains in cell culture. Mechanisms of action were studied via affinity assays, molecular docking, and dynamic simulations. Dermcidin levels in human samples were assessed using ELISA, with comparative genetic analyses of symptomatic and asymptomatic individuals conducted using PacBio sequencing and VarScan. Cytotoxicity was tested by MTT assay, and therapeutic efficacy was evaluated in Balb/c mice by monitoring body weight, symptoms, viral load, and inflammatory cytokine levels. Results and Discussion: This thesis characterizes the antiviral activity of dermcidin, identifying DCD-1L as the most effective peptide, with inhibitory concentrations of 81-254 µM against H1N1 and H3N2 subtypes. Dermcidin binds to the hemagglutinin (HA) stalk zone, blocking the initial infection stage, a conserved mechanism potentially effective against other HA-expressing viruses, including human coronavirus OC43 and measles virus. Dermcidin is naturally produced in human viral entry routes such as tears, saliva, and nasopharyngeal secretions, with asymptomatic individuals secreting higher amounts in the nasopharynx, which may explain their resistance to symptoms. The peptide is overproduced in response to various respiratory viral infections, supporting its role in the innate immune response. Genetic analysis showed no specific variants associated with symptom resistance, suggesting that higher dermcidin production underlies this trait. Animal model studies confirmed DCD-1L's safety, tolerability, and efficacy, comparable to zanamivir when co-incubated with the virus. Conclusion: Susceptibility to influenza symptoms is partly associated with dermcidin production in respiratory viral entry pathways. The findings highlight dermcidin's potential as a novel therapeutic agent for influenza and other respiratory viral diseases, addressing the need for new strategies against these infections. / Corell Escuin, P. (2025). Characterization of the antiviral activity of dermcidin in vitro and in vivo, and its potential role against respiratory viral infections [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/214795

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