Introdução: A incidência do carcinoma epidermóide de orofaringe (CEO) aumentou em todo o mundo nos últimos 30 anos. Estudos identificaram o papiloma vírus humano (HPV) como um fator de risco para essa neoplasia. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi verificar a frequência do HPV em pacientes com CEO e em pacientes sem neoplasia maligna e avaliar a existência de uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os dois grupos. O objetivo secundário foi estudar a correlação entre a infecção pelo HPV e a localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral. Métodos: Foi realizado um estudo de caso-controle com 59 pacientes com CEO e 54 pacientes sem neoplasia, no qual foram analisados os blocos de parafina contendo material tumoral e tecido não neoplásico. Foram analisadas respectivamente a frequência do HPV e sua atividade viral utilizando a técnica de hibridização in situ cromogênica (CISH) para HPV de baixo risco (BR) e alto risco (AR) e a expressão imunoistoquímica da proteína P16. Resultados: A frequência do HPV foi maior no grupo caso em comparação ao grupo controle quando utilizamos a expressão imunoistoquímica da proteína P16 como método de detecção isolado (OR=10,3; P<0,001) e quando utilizamos a CISH e a expressão imunoistoquímica da proteína P16 em conjunto (OR=21,4; P<0,001). A CISH isoladamente não mostrou uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os grupos estudados (P=0,572). A localização tumoral na orofaringe e o estadiamento clínico não mostraram correlação com a infecção pelo HPV em nenhum dos métodos utilizados, assim como o grau de diferenciação tumoral (P>0,20). Conclusão: Utilizando-se a técnica de imunoistoquímica para P16 isolada ou combinada com a técnica de CISH, observou-se uma maior positividade para o HPV no grupo de pacientes com CEO. A localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral não tiveram correlação com a positividade para o HPV. / Introduction: The incidence of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OSCC) has increased worldwide over the last 30 years. Studies have identified human papillomavirus (HPV) infection as a risk factor for OSCC. Objectives: To compare the frequency of HPV infection in patients with OSCC and patients with benign oral or oropharyngeal disease and ascertain whether a statistically significant difference in HPV frequency exists between these two groups. As a secondary objective, to assess potential correlations between HPV positivity, anatomic site of OSCC, tumor staging, and degree of tumor differentiation. Methods: Case-control study. The sample comprised 59 patients with OSCC and 54 non-OSCC controls who underwent surgery for benign oral or oropharyngeal conditions. Paraffin-embedded specimens from cases and controls were tested for HPV positivity by chromogenic in situ hybridization (CISH) for low-risk (LR) and high-risk (HR) HPV, and HPV activity was assessed by P16 immunohistochemistry (IHC). Results: The frequency of HPV positivity was higher in the case group than in the control group when assessed by P16 IHC alone (OR=10.3, P<0.001) or by CISH and P16 IHC in combination (OR=21.4, P<0.001). CISH alone did not detect any significant between-group difference in HPV frequency (P=0.572). Tumor site, staging, and differentiation did not correlate with HPV positivity with any of the methods employed (P>0.20). Conclusion: Using a P16 IHC assay alone or combined with CISH, the authors showed a higher rate of HPV positivity among patients with OSCC, as compared with patients with benign disease. Tumor site within the oropharynx, tumor stage, and degree of differentiation did not correlate with HPV positivity.

O gene SHOX (short stature homeobox containing gene), expresso em altos níveis nas células osteogênicas, é fundamental para o desenvolvimento ósseo e para a determinação da altura. Haploinsuficiência do SHOX é responsável por vários fenótipos que envolvem a baixa estatura, como a síndrome de Turner, a discondrosteose de Léri-Weill e a baixa estatura idiopática. Cerca de dois terços das haploinsuficiências são causados por deleções. Neste trabalho, foi realizada uma comparação entre três técnicas para detecção de deleções do SHOX: a hibridação in situ com fluorescência (FISH), o estudo de microssatélites e o multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). Nos pacientes sem deleção do SHOX, foi realizado um rastreamento para identificação de mutações de ponto no gene que levassem à sua haploinsuficiência. Foram analisados seis pacientes com discondrosteose de Léri-Weill (DLW) e 20 com baixa estatura desproporcionada (BED). Na técnica de FISH, os cromossomos metafásicos obtidos a partir de cultura de linfócitos foram hibridados com o cosmídio LLNOYCO3M34F5. DNA genômico extraído a partir de leucócitos de sangue periférico foi submetido à análise de microssatélites e MLPA. Foram amplificados seis marcadores de microssatélites (repetições CA, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 e DXYS234) e o MLPA foi realizado de acordo com as instruções dos kits SALSA MLPA P018-C1 e P018-D1 SHOX. Estes kits contêm oito sondas específicas para o gene SHOX e 13 para a área do SHOX, localizada a jusante do gene. O seqüenciamento direto da região codificadora do gene foi realizado nos pacientes sem deleção. Todos os pacientes com DLW apresentaram deleções envolvendo todo o gene. Entre os pacientes com BED, apenas um (5,0%) apresentou uma deleção intragênica envolvendo os exons 4, 5 e 6a. Os resultados das três metodologias foram concordantes na maioria dos casos, exceto em dois casos. No primeiro caso, inicialmente o FISH não identificou uma deleção envolvendo todos os éxons em um paciente com DLW. No segundo, uma deleção envolvendo os exons 4, 5 e 6a, identificada em uma paciente com BED, foi detectada apenas pelo MLPA. Ainda entre os pacientes com BED, três (15%) apresentaram deleção da região do marcador DXYS10096, a 3 do gene. Outros três (15%) pacientes apresentaram mutações de ponto identificadas pelo seqüenciamento direto: a mutação p.Tyr35X, que resulta na substituição de uma tirosina por um códon de parada prematuro; a p.Arg147His localizada na região do homeodomínio e a NM_000451:c.1236 -10T>C que se encontra a 10 nucleotídeos antes do início do éxon 5. Em uma comparação das três metodologias, o FISH foi considerado a técnica mais trabalhosa e com menor sensibilidade, levando até oito dias para sua realização. A análise por microssatélites requer o estudo dos progenitores, além de um grande número de marcadores para a análise de regiões extensas. O MLPA detectou todas as deleções, sendo considerada a metodologia mais sensível. Ele apresentou também menor custo e tempo de execução, além de possibilitar a estimativa do tamanho da deleção. Desta forma, o MLPA foi considerado a melhor metodologia para investigação inicial dos pacientes com DLW e BED. / The SHOX gene (short stature homeobox containing gene), expressed at high levels in osteogenic cells, is essential for bone development and growth process. SHOX haploinsufficiency is responsible for several phenotypes involving short stature, such as Turner syndrome, Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and idiopathic short stature. Deletions are responsible for 2/3 of SHOX haploinsufficiency. In this study, a comparison among three techniques for detection of SHOX deletions: fluorescence in situ hybridization (FISH), microsatellites analysis and multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) was performed. A screening for point mutations that could lead to haploinsufficiency was performed in patients without SHOX deletion. Six patients with Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and 20 with disproportionate short stature (DSS) were analyzed. FISH analysis was performed using the cosmid LLNOYCO3\"M\"34F5 and metaphase spreads obtained from lymphocytes culture. Genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes was used to microsatellite and MLPA analysis. Six microsatellite markers (CA repeats, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 and DXYS234) were amplified by PCR and MLPA was performed according to the manufacturers instructions for SALSA MLPA P018 and P018-C1-D1 SHOX kits. These kits contain 8 specific probes for SHOX gene and 13 for \"SHOX area, which is located downstream of the gene. The direct sequencing of entire encoding region was performed in patients with no SHOX deletions. All patients with LWD presented deletions involving the entire gene. One (5.0%) patient with DSS, presented an intragenic deletion involving exons 4, 5 and 6a. The results of the three methods were concordant in most cases, except in two cases. In the first case, a patient with DLW, the FISH did not identify a deletion involving all SHOX exons. In the second case, a deletion of exons 4, 5 and 6a in a patient with BED was identified only by MLPA. Other 3 (15%) DSS patients had deletion in SHOX area, in the DXYS10096 marker. Other three (15%) patients presented a point mutation identified by direct sequencing: p.Tyr35X, which replaces a tyrosine for a premature stop codon, p.Arg147His located in the homeodomain region and NM_000451: c.1236-10T> C which is 10 nucleotides before the exon 5. In a comparison of three methods, the FISH technique was considered the more laborious and less sensitive, taking until eight days to obtain the results. The microsatellite analysis requires the parents DNA study. In addition, several markers are essential for the analysis of extensive regions. The MLPA was considered the most sensitive methodology since it detected all deletions. It also presented lower cost and execution time, and allowed the estimation of the size of the deletion. Thus, the MLPA was considered the best approach for initial investigation of LWD and DSS patients.

Introdução: A incidência do carcinoma epidermóide de orofaringe (CEO) aumentou em todo o mundo nos últimos 30 anos. Estudos identificaram o papiloma vírus humano (HPV) como um fator de risco para essa neoplasia. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi verificar a frequência do HPV em pacientes com CEO e em pacientes sem neoplasia maligna e avaliar a existência de uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os dois grupos. O objetivo secundário foi estudar a correlação entre a infecção pelo HPV e a localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral. Métodos: Foi realizado um estudo de caso-controle com 59 pacientes com CEO e 54 pacientes sem neoplasia, no qual foram analisados os blocos de parafina contendo material tumoral e tecido não neoplásico. Foram analisadas respectivamente a frequência do HPV e sua atividade viral utilizando a técnica de hibridização in situ cromogênica (CISH) para HPV de baixo risco (BR) e alto risco (AR) e a expressão imunoistoquímica da proteína P16. Resultados: A frequência do HPV foi maior no grupo caso em comparação ao grupo controle quando utilizamos a expressão imunoistoquímica da proteína P16 como método de detecção isolado (OR=10,3; P<0,001) e quando utilizamos a CISH e a expressão imunoistoquímica da proteína P16 em conjunto (OR=21,4; P<0,001). A CISH isoladamente não mostrou uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os grupos estudados (P=0,572). A localização tumoral na orofaringe e o estadiamento clínico não mostraram correlação com a infecção pelo HPV em nenhum dos métodos utilizados, assim como o grau de diferenciação tumoral (P>0,20). Conclusão: Utilizando-se a técnica de imunoistoquímica para P16 isolada ou combinada com a técnica de CISH, observou-se uma maior positividade para o HPV no grupo de pacientes com CEO. A localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral não tiveram correlação com a positividade para o HPV. / Introduction: The incidence of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OSCC) has increased worldwide over the last 30 years. Studies have identified human papillomavirus (HPV) infection as a risk factor for OSCC. Objectives: To compare the frequency of HPV infection in patients with OSCC and patients with benign oral or oropharyngeal disease and ascertain whether a statistically significant difference in HPV frequency exists between these two groups. As a secondary objective, to assess potential correlations between HPV positivity, anatomic site of OSCC, tumor staging, and degree of tumor differentiation. Methods: Case-control study. The sample comprised 59 patients with OSCC and 54 non-OSCC controls who underwent surgery for benign oral or oropharyngeal conditions. Paraffin-embedded specimens from cases and controls were tested for HPV positivity by chromogenic in situ hybridization (CISH) for low-risk (LR) and high-risk (HR) HPV, and HPV activity was assessed by P16 immunohistochemistry (IHC). Results: The frequency of HPV positivity was higher in the case group than in the control group when assessed by P16 IHC alone (OR=10.3, P<0.001) or by CISH and P16 IHC in combination (OR=21.4, P<0.001). CISH alone did not detect any significant between-group difference in HPV frequency (P=0.572). Tumor site, staging, and differentiation did not correlate with HPV positivity with any of the methods employed (P>0.20). Conclusion: Using a P16 IHC assay alone or combined with CISH, the authors showed a higher rate of HPV positivity among patients with OSCC, as compared with patients with benign disease. Tumor site within the oropharynx, tumor stage, and degree of differentiation did not correlate with HPV positivity.

Orientador: Iscia Lopes-Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T04:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Conte_FabioFrangiotti_D.pdf: 13814383 bytes, checksum: 9a4218c46168df9b7544dbd102ee9756 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A epilepsia é uma condição bastante freqüente que atinge aproximadamente 1,5% da população geral, sendo mundialmente considerada um problema de saúde pública. O termo epilepsia engloba um grupo de distúrbios neurológicos crônicos com diferentes etiologias, manifestações e prognósticos, mas que possuem como característica comum as crises convulsivas recorrentes. A Epilepsia Mioclônica Juvenil (EMJ) é caracterizada por abalos mioclônicos principalmente ao despertar. A EMJ tem sido uma das formas de epilepsia mais amplamente estudadas do ponto de vista molecular. Recentemente, um dos genes causadores da EMJ foi clonado. Este gene, chamado de EFHC1, codifica uma proteína que possui 640 aminoácidos e que possui três domínios estruturais DM10, de função desconhecida, e um motivo de ligação a cálcio, chamado de EF-hand. A proteína EFHC1 associa-se a microtúbulos e, dessa forma, participa ativamente do processo de divisão celular. Além disso, esta proteína induz apoptose em neurônios através da sua associação com um canal de cálcio voltagem-dependente (Cav2.3). Foram identificadas cinco mutações no gene EFHC1 que co-segregam com o quadro epiléptico em pacientes acometidos por EMJ. As proteínas mutadas codificadas por estas variantes têm a capacidade pró-apoptótica reduzida. Os genes ortólogos de camundongo e rato, chamados de Efhc1, também foram isolados. O gene murino codifica uma proteína de aproximadamente 75KDa, homóloga à proteína Rib72 de Chlamydomonas reinhardtii. A proteína Efhc1 é abundante em tecidos e órgãos que possuem flagelos ou cílios móveis, como, por exemplo, os testículos, os ovidutos e, no sistema nervoso central (SNC), as células ependimárias. No epêndima, a proteína Efhc1 é essencial para a manutenção da freqüência de batimento ciliar destas células. Os principais objetivos desta tese foram a determinação do perfil de expressão do gene Efhc1 e a avaliação da viabilidade de estudos funcionais pela modulação de sua expressão no cérebro de roedores em diferentes estágios de desenvolvimento. Os experimentos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real revelaram que não há diferença na expressão do transcrito do gene Efhc1 entre os hemisférios cerebrais nas duas espécies. Os ensaios de Western blot corroboraram este achado. Além disso, os maiores níveis do transcrito destes genes são observados nos estágios intra-uterinos nos camundongos e nos animais adultos em ratos. Em comum, há um decréscimo progressivo na expressão dos genes a partir de neonatos de 1 dia de vida (P1) até P14. Os estudos de hibridização in situ mostraram que o transcrito dos genes Efhc1 destas espécies é expresso nas células ependimárias, as quais revestem as paredes dos ventrículos cerebrais. Estes resultados sugerem que a expressão do gene Efhc1 é mais importante durante as fases iniciais do desenvolvimento do cérebro e que, neste estágio, a proteína Efhc1 pode estar envolvida no surgimento dos mecanismos epileptogênicos subjacentes a EMJ. A técnica de interferência por RNA (RNAi) promove o silenciamento gênico potente e específico e foi utilizada neste projeto com o intuito de estudar a função do gene Efhc1 em células de mamíferos em cultura e no cérebro de camundongos em desenvolvimento. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para esta finalidade. Tanto para os experimentos com cultura celular quanto para os experimentos in vivo, a confirmação do silenciamento gênico ocorreu via Real Time PCR e Western blot. Além disso, foram utilizados controles negativos (injeção apenas com tampão e siRNA irrelevantes). Inicialmente, foram desenhadas e sintetizadas duas moléculas de siRNA, as efetoras da RNAi, que promovem um silenciamento gênico temporário, e uma molécula de shRNA (short hairpin RNA), cujo efeito é duradouro. Nos experimentos com cultura de células, foram utilizados diferentes tipos celulares, desde cardiomiócitos de rato até células de camundongos derivadas de neuroblastoma (Neuro2A). Já para o silenciamento do gene no cérebro de camundongos em desenvolvimento, foram utilizadas diferentes metodologias de inoculação da molécula, como, por exemplo, cirurgia intra-uterina, transfecção hidrodinâmica, injeção na veia jugular e associação do siRNA com um peptídeo derivado de uma glicoproteína do vírus da raiva. Como resultado, obteve-se silenciamento duradouro e consistente do gene Efhc1 em cultura de células Neuro2A. A maior porcentagem de silenciamento gênico (60%) foi obtida após 48h de incubação do siRNA com as células e o gene permaneceu silenciado por até 6 dias. Além disso, o silenciamento do gene Efhc1 no Sistema Nervoso Central de roedores (redução da expressão em até 45%) foi alcançado pela complexação do siRNA com um peptídeo derivado do vírus da raiva, o RVG-9R. Espera-se que os resultados deste estudo sejam capazes de fortalecer a associação do gene EFHC1 e o fenótipo de EMJ, além de fornecer maiores subsídios para identificar os possíveis mecanismos biológicos envolvidos na fisiopatologia da EMJ, os quais permanecem ainda muito controversos. / Abstract: Epilepsy is a frequent condition that affects around 1.5% of general population and is considered worldwide as a public health problem. The term epilepsy refers to a group of chronic neurological disorders with different etiologies and prognostics. However, a common characteristic of all epilepsies is the recurrence of seizures. Juvenile myoclonic epilepsy (JME), one of the most common forms of epilepsy, is characterized by myoclonic seizures mainly at awakening. JME has been intensively studied at the molecular level. Recently, one of the putative causative genes for JME was cloned. This gene, called EFHC1, encodes a protein with 640 amino acids that has three DM10 domains, with unknown function, and a calcium binding motif, called Ef-Hand. EFHC1 protein associates with microtubules and, therefore, it actively participates in the cellular division process. In addition, it has been demonstrated that this protein induces apoptosis in cultured neurons through the association with an R-type voltage-dependent calcium channel (Cav2.3).To date, five different EFHC1 missense mutations identified in patients with JME were shown to decrease this proapoptotic function in cell models. The ortholog genes in mouse and rat, both named Efhc1, were also isolated. The murine gene encodes a protein with around 75KDa, homolog to Chlamydomonas reinhardtii Rib72 protein. Efhc1 protein presents its highest expression levels in tissues and organs that have mobile cilia and flagella, like testis, oviduct and, in the central nervous system, the ependymal cells. The aim of this study was to determine the distribution and expression profile of Efhc1 genes and evaluate the viability of functional studies by the modulation of the its expression during the development of the brain of mice and rats. Real time polymerase chain reaction (Real Time PCR) revealed that there is no difference in the expression of Efhc1 transcript between right and left hemispheres in both species. Western blot experiments corroborated this finding. In addition, the highest levels of Efhc1 mRNA were found at intra-uterine stages in mouse and in adulthood in rat. In common, there was a progressive decrease in Efhc1 expression from 1-day-old neonates to 14-days-old animals in both species. In situ hybridization studies showed that rat and mouse Efhc1 mRNAs are expressed in ependymal cells of ventricle walls. Our findings suggest that Efhc1 expression is more important during initial phases of brain development and that at this stage it could be involved in key developmental mechanisms underlying JME. The technique of RNA interference (RNAi) promotes a potent and specific gene silence and it was employed in this project to study the function of Efhc1 gene in cultured mammal cells and in the brain of mice in different developmental stages. This approach has been widely used to achieve this aim. Both for cultured cells assays as for in vivo experiments, the percentage of gene silence was evaluated with Real Time PCR and Western blot. In addition, negative controls (injection only with buffer and the use of an irrelevant siRNA) were used in the experiments. Initially, we used two siRNAs, the effectors of RNAi. The siRNA molecules promote a temporary gene silence, whereas the short hairpin RNA (shRNA), another type of molecule, promotes long-term gene silence. In the experiments with mammal cells in culture, we used different cellular types, from rat cardiomyocytes to mouse neuroblastoma cells. For the in vivo experiments, different methodologies were used, such as intra-uterine surgery, hydrodynamic transfection, and association of the siRNA with a peptide derived from a rabies virus glycoprotein. A long-term Efhc1 gene silencing was obtained in Neuro2A cells. The greatest silencing percentage (60%) was observed after 48h of incubation with the siRNA and the gene remained silenced for up to 6 days. Besides, Efhc1 gene silencing in rodent Central Nervous System (decrease in gene expression of 45%) was achieved by the inoculation of the siRNA-RVG-9R complex. We believe that our results point to an association between putative EFHC1 gene function during brain development and the physiopathology of JME. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Eliana Regina Forni Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:44:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferrari_Fernanda_M.pdf: 4024604 bytes, checksum: fadaeedca82d057b615fd5bfb85b4706 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A cana-de-açúcar assumiu grande importância no cenário econômico mundial, não só pela produção de açúcar, mas também de etanol. Variedades modernas de cana-de-açúcar são essencialmente derivadas de hibridações feitas no início do século XX entre duas spécies de Saccharum, S. officinarum (2n = 80) e S. spontaneum (2n = 40-128), seguidas de retrocruzamentos dos híbridos com S. officinarum. Devido à poliploidia natural do gênero e a aneuploidia das variedades híbridas o estudo citogenético em cana-de-açúcar é complexo. O advento da citogenética molecular, mediante a técnica de hibridização de DNA in situ (FISH e GISH), vem propiciando avanços no entendimento da organização genômica de Saccharum e de gêneros relacionados. O objetivo deste trabalho foi realizar análises cromossômicas, de número e sítios de rDNA, nas duas principais espécies do gênero, S. officinarum e S. spontaneum, e em mais três importantes variedades brasileiras, RB72454, RB835486 e RB867515. Foi possível confirmar as identidades das espécies S. officinarum (2n = 80) e S. spontaneum (2n = 64) mediante a contagem do número cromossômico. Foram caracterizados, pela primeira vez, os números cromossômicos das variedades RB72454 e RB835486 (2n = 112) e na RB867515 (2n = 110). Através de técnicas de hibridização in situ fluorescente foram quantificados os sítios de rDNA 45S e 5S. As espécies S. officinarum e S. spontaneum, conforme já descrito na literatura, apresentaram 8 sítios de cada locus. As variedades RB72454 e RB835486 apresentaram 12 sítios de cada locus e a variedade RB867515 apresentou 11 sítios do rDNA 45S e 9 sítios do rDNA 5S. Os loci de rDNA 45S e 5S encontram-se em grupos homó(eó)logos distintos e por isso, esses dois genes caracterizam-se dois marcadores cromossômicos em Saccharum spp. A localização do locus de rDNA 45S em posição distinta nos cromossomos de S. officinarum (terminais) e S. spontaneum (intersticiais), possibilitou a quantificação da contribuição dessas espécies, no respectivo grupo homeólogo, para as variedades RB72454 e RB867515 / Abstract: Sugarcane has assumed an eminent position in the world economical scenario, not only for sugar, but also for ethanol production. Current sugarcane varieties are hybrids from initial interspecific crosses involving mainly two species of Saccharum, S. officinarum (2n = 80) and S. spontaneum (2n = 40-128), followed by backcrossing with S. officinarum. Due to the polyploidy nature of the genus Saccharum and the aneuploidy occurring in the interspecific hybrids, the cytogenetic study of sugarcane is complex. Moreover, chromosomes are small and morphologically similar. The molecular cytogenetics, with technique of DNA in situ hybridization (GISH and FISH), has provided advances in the understanding of genomic organization of this crop. The goal of this study was to realize chromosomal analysis, including chromosome number and sites of rDNA of two species, S. officinarum and S. spontaneum, and of three Brazilian varieties, RB72454, RB835486 and RB867515. The identities of the species S. officinarum (2n = 80) and S. spontaneum (2n = 64) were confirmed counting their chromosome numbers. We also counted the chromosome numbers of the varieties RB72454 and RB835486 (2n = 112) and RB867515 (2n = 110). Using FISH techniques, we could quantify the rDNA 45S and 5S sites of all the accesses. S. officinarum and S. spontaneum, as described in the literature, had 8 sites at each locus. For the varieties RB72454 and RB835486, 12 sites at each locus were detected and for RB867515, 11 sites of rDNA 45S and 9 sites of rDNA 5S were detected. The loci rDNA 45S and 5S are in different homo(eo)logues groups being thus characterized as two chromosomal markers for Saccharum spp. Since the rDNA 45S is located in different positions in S. officinarum (terminals) and S. spontaneum (interstitial), this marker could be applied in the quantification, in this homeologue group, of the chromosome numbers inherited from S. officinarum and S. spontaneum by the varieties RB72454, RB867515 / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

O Papilomavírushumano (HPV) é um DNA vírus do grupo papovavírus, que é altamente transmissível sexualmente, sendo bastante encontrado na região anogenital e mucosa oral. A sua implantação oral pode ser por auto-inoculação ou pelo contato oro-sexual. As principais manifestações orais associadas ao HPV são: papiloma, condiloma acuminado, verruga vulgar e hiperplasia epitelial focal. O papiloma é uma lesão epitelial associada ao HPV e pode ocorrer em vários locais da mucosa oral. Histopatologicamente, o papiloma oral é caracterizado por coilocitose, disceratose, papilomatose, hiperceratose e acantose. A literatura ressalta a importância do estudo dessas lesões, uma vez que estudos demonstram que mesmo com os achados macroscópicos e histológicos serem compatíveis com a presença do vírus, somente técnicas de detecção podem comprovar a presença viral.O objetivo deste estudo foi verificar a presença do HPV, por meio das técnicas de hibridização in situ e PCR, em lesões diagnosticadas histopatologicamente como papilomas e comparar esses resultados com características clínicas e histológicas. Cinqüenta casos foram selecionados da Disciplina de Patologia Bucal e da Disciplina de Estomatologia Clínica da FOUSP. Esta seleção de 50 casos foi submetida à reação de hibridização in situ, e 10 casos dentre os mesmos por técnica da PCR e 100% casos foram negativos. Nenhuma das características histológicas previamente analisadas puderam formar estreita relação com a hibridização in situ e PCR. Conclui-se que a análise histopatológica ao HE não se correlaciona com os resultados das técnicas de hibridização in situ e PCR, porém importante ressaltar para detecção do HPV nas lesões estudadas é imprescindível o uso de técnicas de Biologia Molecular otimizadas como a hibridização in situ e PCR realizadas nesse estudo. / The Humanpapillomavirus (HPV) is a DNA virus from the group of papovavirus, which is highly sexually transmitted and it can be often found in the anogenital area and in the oral mucosal. The oral implantation can be by self-inoculation or by the oral sexual contact. The main oral appearances associated to HPV are: papilloma, condylomata acuminata, verruca vulgaris and focal epithelial hyperplasia. Papilloma is an epithelial lesion that is associated to HPV and can occurs in many places of the oral mucosal. Histopathologically, the oral papilloma is characterized by koylocitosis, dyskeratosis, papillomatosis, hyperkeratosis and acanthosis. The literature shows the importance of these lesions once studies show that macroscopic and histologic founds suggest the presence of the virus, only detection technics can prove the viral presence. The target of this study is to check the presence of HPV, by means of In situ hybridization and PCR, in lesions diagnosed histopathologically as papillomas and compare these results with clinic and histologic features. Fifty cases were selected from the Discipline of Oral Pathology and the Discipline of Oral Diagnose of FOUSP. This selection of 50 cases were submitted to the reaction of In situ hybridization, and 10 cases among the same by PCR and 100% of the cases were negative. None of the histologic features were previously analyzed could form a narrow relation with the In situ hybridization and PCR. Therefore it is concluded that the histopathologic analysis to HE do not correlate with the results of the In situ hybridization and PCR, however the detection of the HPV in the studied lesions it is absolutely necessary the use of Molecular Biology techniques as the In situ hybridization and PCR done in this study.

A diversidade bacteriana pode ser estudada, combinando técnicas convencionais e técnicas que empreguem tecnologias modernas para sua melhor compreensão. O objetivo do trabalho foi analisar a diversidade de bactérias cultiváveis e não cultiváveis em amostras de água do mar coletadas no Canal de São Sebastião no período de agosto/2005 a março/2007. As bactérias marinhas foram quantificadas em Agar marinho e identificadas por seqüenciamento do gene 16S rDNA. A concentração dos grupos a-, b-, g- e s-proteobacteria foi verificada através da técnica de FISH. A comunidade total foi analisada através da construção de três bibliotecas mensais (novembro/2006, fevereiro/2006, fevereiro/2007). O seqüenciamento identificou 87% das bactérias marinhas como Vibrio sp. A técnica de FISH detectou maior concentração de b-proteobacteria (10,2%), em relação ao número de células totais (DAPI) que variou de 7,0x106 a 2,3x107 céls/mL. As bibliotecas de clones foram compostas pelos filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Firmicutes, Fusobacteria, Verrucomicrobia e Chloroflexi. / Microbial diversity can be studied by a combination of techniques of both conventional and modern approaches for better understanding. The aim of this study was analyze marine bacteria culturable and nonculturable diversity from seawater samples collected at São Sebastião Channel during August 2005 to March 2007. Marine bacteria were quantified using Marine Agar and identified by 16S rRNA sequencing. Concentration of a-, b-, g- e s-proteobacteria group was verified through three clones library monthly (November 2006, February 2006, February 2007). The sequencing identified 87% of marine bacteria such as Vibrio sp. The FISH technique to detect higher concentration of b-proteobacteria (10.2%), compared to number total cells (DAPI) which range from 7.0 x 106 to 2.3 x 107 cells/mL. Clones library were composed of the phylum Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Firmicutes, Fusobacteria, Verrucomicrobia e Chloroflexi.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-03-29T13:42:08Z No. of bitstreams: 1 flaviaalmeidaribeiroscalioni.pdf: 2339144 bytes, checksum: fc488fda19373aa72588dc3ad1e242c3 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T02:47:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 flaviaalmeidaribeiroscalioni.pdf: 2339144 bytes, checksum: fc488fda19373aa72588dc3ad1e242c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T02:47:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 flaviaalmeidaribeiroscalioni.pdf: 2339144 bytes, checksum: fc488fda19373aa72588dc3ad1e242c3 (MD5) Previous issue date: 2013-04-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Crianças com síndrome de Down (SD) apresentam uma baixa prevalência de cárie dentária. Embora os Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus estejam associados com a cárie dentária em humanos, o seu papel na etiologia da doença em crianças com SD ainda não está completamente esclarecido. Desta forma, este estudo transversal teve como objetivo avaliar a experiência de cárie dentária e a contagem de S. mutans, S. sobrinus e estreptococos presentes na saliva de crianças com SD (grupo SD) em comparação com crianças não sindrômicas (grupo ND). A amostra incluiu trinta crianças com SD (com idade entre três e 12 anos) e trinta crianças (com idade entre quatro e 12 anos) sem a síndrome, pareadas por idade e sexo. O exame da condição dentária foi realizado para determinar o número de dentes decíduos cariados, com extração indicada e obturados (índice ceo-d) e o número de dentes permanentes cariados, perdidos e obturados (índice CPO-D), de acordo com os critérios de diagnóstico de cárie dentária da OMS. Amostras de saliva total não estimulada foram coletadas de todas as crianças. A técnica da hibridização in situ fluorescente (FISH) identificou a presença e o número de bactérias cariogênicas na saliva. O teste qui-quadrado foi usado para a análise das variáveis categóricas e o teste t de Student foi usado para a análise das variáveis contínuas. Adotou-se o nível de significância de 5% (p < 0,05). As crianças do grupo SD apresentaram significativamente uma experiência de cárie dentária mais baixa (p < 0,001) e mais baixa contagem de S. mutans na saliva (p < 0,001), em comparação com as crianças do grupo ND. Não se observou nenhuma diferença estatisticamente significativa na contagem de S. sobrinus e estreptococos presentes na saliva entre os dois grupos (p = 0,09 e p = 0,21, respectivamente). As contagens de S. mutans e S. sobrinus presentes na saliva, determinadas pela técnica de FISH, não se associaram a mais baixa experiência de cárie dentária observada entre as crianças com síndrome de Down. / Down syndrome (DS) children are known to present a low dental caries prevalence. Although Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus are associated with dental caries in humans, their role in the etiology of dental caries in DS children is not entirely clear. Therefore this cross-sectional study aimed to assess the dental caries experience as well as the salivary counts of S. mutans, S. sobrinus and streptococci in DS children (group SD) in comparison with non-Down syndrome children (group ND). The sample included 30 DS children (aged 3-12 years) and 30 age and sex-matched ND children (aged 4-12 years). Dental examinations were performed to determine the numbers of decayed, missing and filled teeth in primary (dmf-t index) and permanent (DMF-T index) dentition according to the WHO dental caries diagnostic criteria. Unstimulated whole saliva samples were collected from all children. The fluorescence in situ hybridization (FISH) technique identified the presence and numbers of the cariogenic bacteria in saliva. The chi-square test was used to analyze the categorical variables and the Student’s t-test was used for the continuous variables. The significance level was set at 5% (p < 0.05). Children of DS group showed significantly lower dental caries experience (p < 0.001) and salivary counts of S. mutans (p < 0.001) compared to children of ND group. No significant difference was found in the salivary counts of S. sobrinus and streptococci between the two groups (p = 0.09 and p = 0.21, respectively). The salivary counts of S. mutans and S. sobrinus determined by the FISH technique were not associated with the lower caries experience observed in Down syndrome children.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-02T15:12:15Z No. of bitstreams: 1 samirasalomaolemos.pdf: 1943593 bytes, checksum: 1564e6f7ffba63a822e146b8ccdafa02 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-03T12:59:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 samirasalomaolemos.pdf: 1943593 bytes, checksum: 1564e6f7ffba63a822e146b8ccdafa02 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-03T12:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 samirasalomaolemos.pdf: 1943593 bytes, checksum: 1564e6f7ffba63a822e146b8ccdafa02 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diferentes métodos de identificação têm mostrado que a comunidade microbiana em infecções endodônticas apresenta uma grande diversidade. No entanto, o conhecimento dos perfis microbianos de infecções endodônticas em dentes decíduos ainda é limitado. Portanto, este estudo teve como objetivos avaliar qualitativa e quantitativamente a presença de micro-organismos orais em amostras de canais radiculares dentes decíduos com necrose pulpar, e verificar a correlação entre eles e sua associação com sinais e sintomas clínicos e radiográficos. Um total de 31 crianças, de quatro a dez anos (idade média = 6,29 ± 1,27 anos), foi incluído neste estudo. A presença de 12 patógenos selecionados (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythia e Treponema denticola) em 31 canais radiculares de 31 dentes com necrose pulpar foi avaliada por meio da técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH), que identificou e quantificou os micro-organismos. Medidas descritivas foram usadas para descrever os dados relativos à densidade (cél/mL X 108) obtida para cada micro-organismo testado. O teste de correlação de Pearson avaliou a correlação entre os micro-organismos identificados e o teste t de Student verificou a associação entre os sinais e sintomas clínicos e radiográficos e os micro-organismos detectados. Adotou-se um nível de significância de 5% (p < 0,05). Todos os patógenos testados foram identificados em todas as amostras. O somatório das densidades médias totais de todas as espécies bacterianas testadas e do gênero Streptococcus representou 80,57% da comunidade microbiana total. Os resultados do teste t de Student demonstraram que houve uma diferença significante (p = 0,02) entre no número médio das densidades observadas na espécie T. denticola no grupo com presença de dor e o grupo com ausência de dor. Também foram observadas diferenças significantes no número médio das densidades da espécie P. nigrescens e presença de edema e P. nigrescens e ausência de edema; assim como para o gênero Streptococcus e presença de edema e Streptococcus e ausência de edema (p = 0,04; p = 0,04, respectivamente). A técnica de FISH confirmou a característica polimicrobiana da infecção endodôntica em dentes decíduos com a presença de bactérias anaeróbicas obrigatórias e anaeróbicas facultativas e do gênero estreptococos. / Different microbial identification methods have shown that the microbial community in endodontic infections presents a great diversity. However, the knowledge of the microbial profiles of endodontic infections in primary teeth is still limited. Therefore, the aim of this study was to evaluate, qualitative and quantitatively, the presence of oral microorganisms in samples from root canals primary teeth, to assess the correlations among them, and to determine their association with clinical and radiographic signs and symptoms. A total of 31 children, 4 to 10 years old (mean age = 6.29 ± 1.27 years old), was involved in this study. The presence of 12 selected pathogens (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythia, and Treponema denticola) in 31 infected root canals from 31 primary teeth with pulp necrosis was studied by using the fluorescent in situ hybridization (FISH) technique which identified and quantified the microorganisms. Descriptive measures were used to present the data related to the density (cel/mL X 108) for each microorganism tested. The Pearson correlation test assessed the correlation among the microorganisms identified and the Student t test assessed the association between the clinical and radiographic signs and symptoms and the pathogens detected. The significance level was set at 5% (p < 0.05). All the tested pathogens were detected in all samples. The total sum of the mean densities of all the bacteria species and Streptococcus genus represented 80.57% of the entire microbial community. The results of Student's t test showed that there was a significant difference (p = 0.02) between the average number of densities observed in the species T. denticola in the group with pain and the group with no pain. Significant differences were also observed in the average number densities of the species P. nigrescens and presence of edema and P. nigrescens and no edema; and for Streptococcus and genus Streptococcus and edema and no edema (p = 0.04, p = 0.04, respectively). The FISH technique confirmed the polymicrobial characteristic of the endodontic infection in primary teeth with the presence of obligate and facultative anaerobic bacteria and of Streptococcus genus.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-07-01T18:12:17Z No. of bitstreams: 1 fernandacamposmachado.pdf: 8104440 bytes, checksum: c6b4f12f1beb42cb6f9fe523172990b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-13T16:05:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandacamposmachado.pdf: 8104440 bytes, checksum: c6b4f12f1beb42cb6f9fe523172990b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T16:05:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandacamposmachado.pdf: 8104440 bytes, checksum: c6b4f12f1beb42cb6f9fe523172990b2 (MD5) Previous issue date: 2012-08-28 / Os níveis de estrógeno e progesterona, necessários à manutenção da gestação, podem contribuir para a maior suscetibilidade ao aparecimento de determinados micro-organismos periodontopatogênicos e consequente desenvolvimento da doença periodontal em gestantes. O objetivo desta investigação foi avaliar os parâmetros periodontais clínicos e microbiológicos de mulheres na gestação e no pós-parto. Os achados das gestantes foram comparados com os de um grupo controle de não gestantes. Este estudo longitudinal prospectivo, com desenho transversal paralelo, incluiu 31 mulheres no segundo trimestre da gestação, acompanhadas em dois momentos após o parto (48 horas e oito semanas) e 20 não gestantes na mesma faixa etária. O exame clínico determinou a condição periodontal das mulheres por meio dos seguintes indicadores: sangramento à sondagem (SS), presença de cálculo (PC), profundidade de sondagem (PS) e nível clínico de inserção (NCI). Amostras de biofilme subgengival e saliva foram coletadas e a identificação e quantificação de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia e Prevotella nigrescens foram realizadas pela técnica da hibridização in situ fluorescente (FISH). O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para a comparação clínica e microbiológica entre os grupos de gestantes e não gestantes. Para a comparação intragrupo, foi empregado o teste de Friedman, seguido pelo teste de Wicoxon. Os grupos de gestantes e não gestantes apresentaram condições periodontais semelhantes. Em relação à microbiota verificada no biofilme subgengival, não foi encontrada diferença significativa entre as mulheres no segundo trimestre de gestação e as não gestantes. Em relação à microbiota salivar, foi observada maior abundância de P. intermedia nas gestantes, em comparação com as não gestantes. Na comparação intragrupo dos parâmetros clínicos, o teste de Friedman demonstrou diferença estatisticamente significativa em relação à PS=4-5 mm, não confirmada pelo teste de Wilcoxon. Em relação aos parâmetros microbiológicos, no biofilme subgengival foi verificado que os números de P. nigrescens diminuíram ao longo dos três momentos avaliados,que números significativamente mais altos de C. rectus foram encontrados durante o segundo trimestre, em comparação com o exame de oito 8 semanas após o parto, e que níveis significativamente mais altos de P. intermedia foram observados 48 horas após o parto, em comparação com o exame de oito semanas após o parto. Na saliva, foi verificada uma redução significativa de P. intermedia e P. nigrescens ao longo do acompanhamento longitudinal, com os maiores valores encontrados no segundo trimestre da gestação. Em conclusão, os resultados confirmaram a hipótese de que existe uma alteração na microbiota durante a gestação, pelo menos para P. nigrescens, P. intermedia e C. rectus, embora pequena diferença tenha sido verificada em relação aos parâmetros clínicos. / The levels of estrogen and progesterone necessary for maintenance of pregnancy may contribute to increased susceptibility to the occurrence of certain periodontopathogenic bacteria and subsequent development of periodontal disease in pregnant women. The aim of this study was to evaluate clinical and microbiological parameters in women during pregnancy and post-partum. The findings of the pregnant women were compared with a control group of non-pregnant ones. This longitudinal study, with a cross-sectional parallel design, included 31 women at second trimester of their pregnancy, examined one time during pregnancy and twice during post-partum (48h and 8 weeks after the delivery), and 20 non-pregnant women within the same age range. Bleeding on probing (BOP), presence de calculus (PC), probing depth (PD) and clinical attachment level (CAL) were recorded. Bacterial samples from the subgingival biofilm and saliva were collected and the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique identified the presence and number of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens. The Mann-Whitney U-test was applied to compare clinical and microbiological data from pregnant and non-pregnant women. The Friedman and Wilcoxon tests were used for intra-group comparisons. Pregnant and non-pregnant women showed similar periodontal conditions. Regarding the subgingival microbiota, no significant difference was found among women in the second trimester of pregnancy and nonpregnant women. Regarding the salivary microbiota, it was observed higher abundance of P. intermedia in pregnant compared with non-pregnant women. In intra-group comparison, for clinical parameters, Friedman test showed significant difference concerning PD = 4-5 mm, not confirmed by the Wilcoxon test. Regarding the microbiological parameters, in the subgingival biofilm it was found that numbers of P. nigrescens decreased among the three periods analyzed, increased bacterial counts were found for C. rectus from the second trimester to 48h after the delivery, as well as for P. intermedia from 48h to 8 weeks post-partum. In saliva, there was a significant reduction of P. intermedia and P. nigrescens among the longitudinal follow-up, with the highest values found in the second trimester of pregnancy. In 10 conclusion, the results confirm the hypothesis that there is a change in the microbiota during pregnancy, at least for P. nigrescens, P. intermedia and C. rectus, although little difference was observed in relation to clinical parameters.