Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-27T19:16:53Z No. of bitstreams: 1 Fabio David Couto Estudo da prevalencia... 2002.pdf: 44946029 bytes, checksum: 5521f6983cf2f27b55c924fff532ed06 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-27T19:16:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fabio David Couto Estudo da prevalencia... 2002.pdf: 44946029 bytes, checksum: 5521f6983cf2f27b55c924fff532ed06 (MD5) Previous issue date: 2002 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O metabolismo da fiomocisteina pode ser afetado por carência nutricional de vitaminas (Be, B12 e folatos) ou por alterações genéticas que afetam o funcionamento de enzimas envolvidas em sua via metabólica. A homozigose para a mutação C677T no gene da enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) tem sido relacionada com a hiperhomocisteinemia, descrita como fator de risco importante e Independente para a ocorrência de doenças cardiovasculares. As hemoglobinopatias estruturais, principalmente a hemoglobina S, também tem sido associada a estes eventos. No presente estudo foi determinada a prevalência da mutação C677T da MTHFR, por PCR e RFLP, em 843 recém-nascidos de Salvador-Bahia, correlacionando a presença desta mutação com o perfil de hemoglobinas determinado por HPLC. Os níveis séricos de homocisteína, vitamina Bi2 e folatos foram determinados em um subgrupo de 75 recém-nascidos, com os diferentes genótipos para o polimorfismo C677T da MTHFR: 25 selvagens (C/C), 25 heterozigotos (C/T) e 25 homozigotos (T/T) mutantes, todos portadores de hemoglobina AA. A freqüência do alelo T foi de 23,4%, com prevalências de 36,2% da heterozigose e 5,3% da homozigose para o polimorfismo C677T da MTHFR. O alelo T foi normalmente distribuído entre os gêneros (p = 0,206) e entre os diferentes genótipos de hemoglobinas p = 0,696. Diferenças estatísticas nâo foram encontradas para os níveis de homocisteína, folatos e vitamina B12 entre os diferentes genótipos do polimorfismo C677T da MTHFR. Contudo as análises estratificadas para os níveis de folatos e vitamina B12 demonstraram que os recém-nascidos com níveis destas vitaminas abaixo dos valores medianos e portadores dos genótipos C/T e T/T apresentaram maior freqüência entre os neonatos com níveis de homocisteína acima de 6,7 |amol/L. Também foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os pesos dos recém- nascidos e os níveis de folatos (p = 0,043). Nossa população apresenta freqüência elevada do alelo T do polimorfismo C677T da MTHFR associada as hemoglobinopatias estruturais, o que pode influenciar na incidência das doenças vasculares freqüentemente observadas entre os portadores de hemoglobinopatias estruturais. De acordo com os resultados, os folatos são poderosos preditores dos níveis de homocisteína assim como do peso dos recém-nascidos, independente da mutação C677T; contudo, este efeito é potencializado pela presença da homozigose do alelo T. / The homocysteine metabolism is affected by nutritional status of B12 and folate vitamins or can results from genetics mutations of genes responsable for proteins expression involved in re-methylation or trans-sulphuration metabolism pathway. A common mutation, C677T, in the methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR) reduces the MTHFR activity and increase the total homocysteine serum levels (tHcy). Hyperhomocysteinaemia has been identified as a risk factor for cardiovascular disease as established for variant hemoglobins. Here we investigated the C677T mutation prevalence in MTHFR gene by PCR and RFLP techniques, in 843 neonates from Salvador-Bahia-Brazil, and its coexistence with variant hemoglobins, which was determinated by HPLC. We estimated homocysteine, B12, and folate vitamins serum levels concentrations by chemiluminescence in a subgroup of 75 neonates with hemoglobin AA pattern, carriers different genotypes for MTHFR polimorphism: 25 wide type (C/C), 25 heterozygous (C/T), and 25 mutant homozygous (T/T). The mutant allele frequency was 0.23. Among heterozygous and mutant homozygous states the prevalence for polymorphism C677T of MTHFR gene were 36.2% and 5.3%, respectively. No gender (p = 0.206) or hemoglobin genotypes (p = 0,696) related differences were observed for T allele distribution, even for homocysteine, folate, and B12 vitamin levels among different MTHFR polymorphism. Stratified analysis for B12 vitamins or folate levels showed high frequency of newborns C/T and T/T with homocysteine levels above 6.7 |imol/L in the groups of B12 vitamin and folate levels below of it median values. Statistical differences was found in newborns with low folate serum levels and weight according to them with it serum levels above of it median value (p = 0.043). The 672 studied newborn population had high frequency of T allele associated with variant hemoglobins. It become important once may contribute for occlusive vascular disease development. Our results showed relationship among folate and homocysteine serum levels, that folate is an important homocysteine serum levels predictor as well newborns weight, and this effect can be enhanced by T allele homozygouse

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado principalmente pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase (CBS), resultando em acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos. As manifestações clínicas incluem retardo mental, ectopia lentis, episódios tromboembólicos e osteoporose. Estudos realizados em modelos animais demonstram um possível papel do estresse oxidativo na fisiopatologia da homocistinúria. Mais recentemente, foram demonstradas alterações em alguns parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos. Nesse trabalho, essas investigações foram ampliadas, no intuito de melhor entender os mecanismos fisiopatológicos e a terapêutica da homocistinúria por deficiência de CBS. Dessa forma, o objetivo principal desse trabalho foi avaliar os perfis lipídico, inflamatório e oxidativo, bem como a atividade das enzimas paraoxonase (PON1) e butirilcolinesterase (BuChE) em pacientes homocistinúricos tratados (dieta hipoproteica suplementada com vitamina B6, ácido fólico, betaína e vitamina B12) e não tratados, em comparação com indivíduos saudáveis, e adicionalmente avaliar a indução in vitro de mutagenicidade causada pela Hcy, através do teste de micronúcleos em leucócitos, e ainda avaliar o efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. No que se refere ao perfil sérico, foi verificada uma redução nos níveis de colesterol HDL, apolipoproteína A, bem como na atividade da enzima (PON1) em pacientes homocistinúricos tratados e não tratados. A atividade da enzima BuChE e os níveis de interleucina 6 (IL-6) estavam aumentados apenas nos pacientes não tratados. Correlações significativas positivas foram encontradas nos dois grupos de pacientes estudados entre a atividade da PON1 e o conteúdo de sulfidrilas; entre a atividade da PON1 e os níveis de vitamina B12; entre os níveis de HDL e apolipoproteína A1; entre os níveis de apolipoproteína A1 e vitamina B12; e entre os níveis de IL-6 e os níveis de carbonilas. Correlação significativa negativa foi encontrada entre os níveis de ácido fólico e de homocisteína total (tHcy). Em um segundo momento foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e níveis de nitritos na urina dos pacientes. Foram demonstrados níveis aumentados de 15-F2t-isoprostanos, di-tirosina e nitritos na urina de pacientes homocistinúricos tratados. Os níveis de 15-F2t-isoprostanos apresentaram uma correlação significativa positiva com os níveis de tHcy e os níveis de di-tirosina apresentaram correlação significativa negativa com os níveis de sulfidrilas. A atividade da enzima catalase encontrou-se aumentada no sangue de pacientes homocistinúricos tratados. Finalmente, demonstrou-se em estudo in vitro que a Hcy causa um aumento no dano cromossômico, avaliado pelo método de micronúcleos. Além disso, foi observado um efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo, acompanhado por alterações nos níveis urinários de nitritos, e por alterações nos perfis inflamatório e lipídico são fatores que possivelmente contribuam para o dano vascular encontrado na homocistinúria. Esses eventos parecem estar interconectados, e parecem ser decorrentes dos altos níveis de tHcy encontrados no sangue dos pacientes. Novas abordagens terapêuticas, além das atualmente utilizadas que incluem ácido fólico e vitamina B12, como o uso de antioxidantes, poderiam ser alternativas para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. / Homocystinuria is an inborn error of metabolism of amino acids primarily caused by deficiency in the activity of cystathionine-β-synthase (CBS), resulting in accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids. Clinical manifestations include mental retardation, ectopia lentis, thromboembolic events and osteoporosis. Studies in animal models show a possible role of oxidative stress in the pathophysiology of homocystinuria. More recently, changes in some parameters of oxidative stress have been demonstrated in homocistinuric patients. In this work, we expanded these investigations, in order to understand the mechanisms that lead to the development of clinical manifestations of disease and the therapeutic for homocystinuria due CBS deficiency. Thus, the main objective of this study was to evaluate the lipid, inflammatory and oxidative profiles as well as the activity of paraoxonase (PON1) and butyrylcholinesterase (BuChE) in treated homocistinuric patients (hypoproteic diet supplemented with vitamin B6, folic acid, betaine and vitamin B12) and untreated patients compared with healthy individuals, and to evaluate the in vitro induction of mutagenicity caused by Hcy, through the micronucleus test in leukocytes, and further, to evaluate the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. With regard to the serum profile, was observed a reduction in HDL cholesterol, apolipoprotein A, and in enzyme activity (PON1) in both group of CBS-deficient patients. The activity of butyrylcholinesterase and levels of interleukin 6 (IL-6) were increased only in untreated patients. Positive significant correlations were found in both patients groups between PON1 activity and the content of sulfhydryl; between PON1 activity and vitamin B12 levels; between the levels of HDL and apolipoprotein A1; between the levels of apolipoprotein A1 and B12; and between IL-6 levels and levels of carbonyls. Negative significant correlation was found between folic acid levels and total homocysteine (tHcy). In a second moment were evaluated parameters of oxidative stress and the nitrite levels in the urine of patients. Increased levels of 15-F2t-isoprostanes, di-tyrosine and nitrite were demonstrated in the urine of treated homocistinuric patients. The 15-F2t-isoprostanes levels showed a significant positive correlation with tHcy levels; and di-tyrosine levels showed a significant negative correlation with the sulfhydryl levels. The catalase activity was found increased in the blood of treated homocistinuric patients. Finally, it was shown the in vitro effect of Hcy on increase of chromosomal damage assessed by micronuclei method. Furthermore, it was observed the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine antioxidant in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. Evaluated together, our results indicate that oxidative stress accompanied by changes in urinary nitrite levels and changes in inflammatory and lipid profiles are factors possibly contributing to vascular damage found in homocystinuria. These events appear to be interconnected, and appear to be due to the high tHcy levels found in the blood of patients. New therapeutic approaches in addition to the currently used which include folic acid and vitamin B12, as the use of antioxidants, could be alternatives to achieve best results in the treatment of homocistinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of tHcy.

As hiperhomocisteinemias (HHcy), leve e moderada são consideradas um fator de risco para doenças cardiovasculares e cerebrais, entretanto os mecanismos e as complicações decorrentes dessa condição ainda não estão bem estabelecidos. Ela ocorre em 5-10% da população geral e em 40% dos pacientes com doenças vascular periférica e doenças cerebrovasculares. Estudos recentes têm demonstrado que a vitamina D (calcitriol) possui efeitos protetores em diversos modelos experimentais que enfatizam suas possíveis ações antioxidantes. O objetivo principal dessa tese de doutorado foi estabelecer um protocolo experimental com diferentes concentrações de homocisteína em fatias de cortex cerebral e coração e em cultura de astrócitos de ratos adultos. Seguindo esses modelos experimentais, investigamos alguns parâmetros bioquímicos em córtex cerebral e coração de ratos. Posteriormente foi analisado o efeito protetor do calcitriol. No primeiro capítulo da presente tese, observamos que a incubação de 30 μM de Hcy por 30 min e 60 min em fatias de coração, alterou a função e a permeabilidade mitocondrial, o estado redox e a atividade das enzimas da cadeia respiratória; o calcitriol foi capaz de prevenir a maioria dos efeitos da Hcy. No segundo capítulo, vimos que em fatias de córtex cerebral a Hcy prejudica o metabolismo energético, aumentando a morte neuronal e induzindo estresse oxidativo. Todavia, o calcitriol atenuou esses efeitos deletérios induzidos pela Hcy através da ativação do receptor de vitamina D. No último capítulo desta tese, realizamos um estudo em cultura primária de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos. Nossos resultados demonstram que a Hcy ativa a via do fator nuclear kappa B (NFκB), inibindo a expressão de heme oxigenase 1 (HO-1), promovendo alterações morfológicas, aumentando a resposta inflamatória e diminuindo as defesas antioxidantes e a atividade da Na+, K+ - ATPase. Em resumo, em todos modelos experimentais estudados nesta tese, a Hcy, mesmo em concentrações leves e moderadas causou alterações na homeostasia celular. A vitamina D preveniu parte destes efeitos, tornando-se um possível ferramenta terapêutica no intuito de atenuar os efeitos da Hcy. / Hyperhomocysteinemia (HHcy), mild and moderate are a risk factor for cardiovascular and cerebral diseases, but the mechanisms and complications of this condition are not yet well established. It occurs in 5-10% of the general population and 40% of patients with peripheral vascular and cerebrovascular disease. Recent studies have shown that vitamin D (calcitriol) has protective effects in various experimental models which emphasize their potential antioxidant actions. The main objective of this PhD thesis was to establish an experimental with different concentrations of homocysteine in slices of cerebral cortex and heart in adult rat astrocyte cultures. Following this experimental model, we investigated some biochemical parameters in the cerebral cortex and heart of rats. It was subsequently examined the protective effect of calcitriol. In the first chapter of this thesis, we found that incubation of 30 μM of Hcy for 30 min and 60 min in heart slices change the function and mitochondrial permeability, redox state and activity of the enzymes of the respiratory chain; calcitriol was able to prevent most of the effects of Hcy. In the second chapter, we demonstrated that Hcy in the cerebral cortex slices impairs energy metabolism, increasing neuronal death and inducing oxidative stress. However, calcitriol attenuated these Hcy-induced deleterious by activation of vitamin receptor D. In the last chapter of this thesis, we conducted a study in primary culture of cortical astrocytes. Our results demonstrate that the Hcy active the pathway of nuclear factor kappa B (NFκB) inhibiting heme oxygenase expression 1 (HO-1), promoting morphological changes, increasing the inflammatory response and decreased antioxidant defenses and activity of the Na +, K + - ATPase. In summary, in all experimental models studied in this PhD thesis, Hcy, even in mild and moderate concentrations caused deleterious actions in cellular homeostasis. Vitamin D warned of these effects, becoming a potential therapeutic target in order to attenuate the effects of Hcy.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318121.pdf: 4575817 bytes, checksum: 020cbc46c65eab385604a74862c369a2 (MD5) Previous issue date: 2013 / O desequilíbrio no metabolismo do ácido fólico (AF) e da homocisteína (Hcy) está relacionado à ocorrência de defeitos do tubo neural (DTN). Os aspectos morfológicos e os mecanismos celulares envolvidos na gênese dos DTN provocados pelos elevados níveis de Hcy, ainda não foram adequadamente elucidados. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da Hcy sobre os mecanismos celulares envolvidos na morfogênese do tubo neural, com ênfase no desenvolvimento da medula espinhal e do esqueleto axial, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo experimental. Os embriões foram incubados (38ºC), pré-tratados com 26 h e tratados com 48 h de incubação. Foram organizados quatro grupos experimentais: AF - pré-tratado com 50 µl de salina e tratado com 0,5 ?g de AF / 50 µl de salina; Hcy - pré-tratado com 50 ?l de salina e tratado com 20 ?mol D,L-Hcy / 50 ?l salina; AF+Hcy - pré-tratado com 0,5 ?g AF / 50 ?l salina e tratado com 20 ?mol D,L-Hcy/50 ?l salina; controle - pré-tratado e tratado com 50 ?l de salina. Os embriões foram analisados em duas idades - E4 e E6. Foram encontradas diferentes categorias de DTN, acompanhadas de alterações na morfologia da medula espinhal e do esqueleto axial. A Hcy gerou estresse celular e oxidativo, reconhecidos pelo aumento da expressão da proteína de estresse HSP 70 induzível e da proteína anti-apoptótica Bcl 2, respectivamente. Além disso, houve aumento da carbonilação de proteínas e diminuição dos níveis de tióis não-proteicos (NPSH), indicando aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e redução das defesas antioxidantes. Alterações nos mecanismos de proliferação e diferenciação celulares nos tecidos neurais e mesenquimais foram evidenciadas por técnicas de imuno-histoquímica e RT-qPCR. A Hcy reduziu o número de células em proliferação e gerou danos ao DNA nas células dos tecidos neural e mesenquimal. A diferenciação neural foi comprometida pela Hcy, efeito evidenciado pela diminuição da expressão das proteínas p53 e ?-tubulina III na medula espinhal. A Hcy levou à redução da expressão de Pax 1/9 e Sox 9 no mesênquima. Os resultados demonstraram importantes efeitos da Hcy sobre mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento da medula espinhal e do esqueleto axial e a provável relação destes efeitos com a gênese dos DTN na medula espinhal.<br>

A hiperplasia intimal é uma complicação comum após o implante de stent em artérias periféricas e a influência da homocisteína neste processo ainda é desconhecida. O objetivo deste estudo é comparar o espessamento intimal em aorta de suínos submetidos à hiper-homocisteinemia induzida com suínos normais, após implante de stents auto-expansíveis de nitinol. Foram utilizados 18 suínos da raça Macau, com peso médio de 30 kg. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: o primeiro, grupo C (controle), foi alimentado com dieta normal e o outro, grupo M (metionina), recebeu dieta rica em metionina para induzir hiper-homocisteinemia durante 30 dias. Os stents utilizados para o experimento foram os auto-expansíveis, de nitinol, com 25 milímetros de comprimento e diâmetro final de oito milímetros. Foram realizadas dosagens de colesterol, triglicerídeos, colesterol HDL e homocisteína plasmática em ambos os grupos. A adequação das medidas do stent em relação às dimensões da artéria aorta dos suínos e a sua perviedade, após o implante, foram confirmadas mediante realização de arteriografias seletivas. Trinta dias após o implante do stent, os animais foram submetidos à eutanásia e as peças enviadas para exame anatomopatológico. O exame histológico mostrou intensa hiperplasia intimal no grupo controle e placas formadas por macrófagos espumosos com pouca hiperplasia intimal no grupo metionina. A análise morfométrica digital revelou maior hiperplasia intimal no grupo C em relação ao grupo M. Não ocorreram mudanças significativas nas dosagens de colesterol, triglicerídeos e colesterol HDL, em ambos os grupos. Não ocorreram variações significativas nos níveis de homocisteína plasmática dos suínos do grupo controle e, nos animais do grupo metionina, os níveis plasmáticos de homocisteína aumentaram de 17,47 para 58,90 μmol/l após 30 dias de administração de dieta rica em metionina. Concluindo, em aorta abdominal de suínos, alimentados com dieta rica em metionina por 30 dias, ocorreu uma hiperplasia intimal menor após o implante de stent auto-expansível de nitinol em comparação ao grupo controle. / Intimal hyperplasia is a common complication after stent placement in peripheral arteries and the influence of homocysteine in this process is still unknown. The purpose of this study is to compare the intimal thickening in the aorta of normal and induced hyperhomocysteinemic pigs following placement of self-expanding nitinol stents. The animals used were 18 pigs from the Macau specimen. They were over eight weeks old and average weight of 30 kg. Nitinol stents were self-expandable, 25 mm lenght and expanded diameters of 8 mm. The pigs were divided in two groups, the first (group C) was fed with a normal diet and the second group was fed with methionine rich diet to induce hyperhomocysteinemia (group M) during 30 days. Blood samples were collected for analyses of total cholesterol, triglycerides, and HDL and homocysteine concentrations. Assessment was done by angiography. After 30 days of the procedure, the animals where sacrificed and the abdominal aorta segment was removed for histological and digital morphometry analysis. Microscopic examinations of the aortas of the control group had a significant thicker intima compared with methionin group. In the comparison among groups, intimal thickening of the vessel wall at digital morphometric analysis was higher in group C than group M. There was no significant change in total cholesterol, triglycerides, and HDL concentrations in either group. There was no change in plasma homocysteine levels in group C; and in group M plasma homocysteine levels ranged from 17,47 to 59,80 μmol/l after 30 days with a methionine-rich diet. In conclusion, insertion of self-expandable nitinol stent in pig’s abdominal aorta after 30 days with a methionine-rich diet results in less intimal hyperplasia as compared to normal pigs.

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.

Submitted by Hugo Tadashi Kano null (tada_tk@aluno.ibb.unesp.br) on 2018-03-15T12:00:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado - Hugo Tadashi Kano.pdf: 1976397 bytes, checksum: 22cf9f00e7caf878327b4634bb6d02ad (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-19T12:53:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kano_ht_me-bot.pdf: 1976397 bytes, checksum: 22cf9f00e7caf878327b4634bb6d02ad (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-19T12:53:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kano_ht_me-bot.pdf: 1976397 bytes, checksum: 22cf9f00e7caf878327b4634bb6d02ad (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A prevalência mundial de Síndrome Metabólica (SM) está aumentando drasticamente nos últimos anos. Esta desordem consiste de um conjunto de condições metabólicas, contemplando hiperadiposidade abdominal, resistência insulínica (RI), dislipidemia e hipertensão, e é fator de risco para o desenvolvimento de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e doenças cardiovasculares (DCVs). Muitos estudos indicam a participação do estresse oxidativo (EO) junto com o estado estresse inflamatório (EI) como parte do desenvolvimento e agravamento da SM e surgimento das doenças crônicas não-transmissíveis (DCNTs). O EO é caracterizado como estado de desequilíbrio entre os sistemas oxidativo e antioxidante, resultando no excesso de espécies reativas de oxigênio (EROs), menor capacidade antioxidante e efeitos deletérios a tecidos e células. A regulação das reações de oxidação e redução são importantes para o controle de funções fisiológicas e combate ao estresse. Diante disso, os aminotióis ou compostos tio-redox (homocisteína, cisteína e glutationa) exercem importante papel no equilíbrio do estado redox celular. Neste artigo de revisão, analisamos os aspectos fisiopatológicos de compostos tio-redox no curso da SM. / The worldwide prevalence of Metabolic Syndrome (MetS) has been increasing dramatically in recent years. MetS is a set of metabolic conditions, including abdominal hyperadiposity, insulin resistance, dyslipidemia and hypertension, and is a risk factor for the development of type 2 diabetes mellitus and cardiovascular diseases. Many studies indicate the participation of oxidative stress along with the pro-inflammatory state as part of the development and aggravation of MetS and emergence of chronic noncommunicable diseases. Oxidative stress is characterized as a state of imbalance between oxidative and antioxidant systems, resulting in excess of reactive oxygen species, lower antioxidant capacity and deleterious effects on tissues and cells. The regulation of the oxidation and reduction reactions are important for the control of physiological functions and the fight against stress. In view of this, the aminothiols or thiol-redox compounds (homocysteine, cysteine and glutathione) play an important role in the equilibrium of the cellular redox state. In this review article, we analyze the pathophysiological aspects of thiol-redox compounds in the course of MetS.

As hiperhomocisteinemias (HHcy), leve e moderada são consideradas um fator de risco para doenças cardiovasculares e cerebrais, entretanto os mecanismos e as complicações decorrentes dessa condição ainda não estão bem estabelecidos. Ela ocorre em 5-10% da população geral e em 40% dos pacientes com doenças vascular periférica e doenças cerebrovasculares. Estudos recentes têm demonstrado que a vitamina D (calcitriol) possui efeitos protetores em diversos modelos experimentais que enfatizam suas possíveis ações antioxidantes. O objetivo principal dessa tese de doutorado foi estabelecer um protocolo experimental com diferentes concentrações de homocisteína em fatias de cortex cerebral e coração e em cultura de astrócitos de ratos adultos. Seguindo esses modelos experimentais, investigamos alguns parâmetros bioquímicos em córtex cerebral e coração de ratos. Posteriormente foi analisado o efeito protetor do calcitriol. No primeiro capítulo da presente tese, observamos que a incubação de 30 μM de Hcy por 30 min e 60 min em fatias de coração, alterou a função e a permeabilidade mitocondrial, o estado redox e a atividade das enzimas da cadeia respiratória; o calcitriol foi capaz de prevenir a maioria dos efeitos da Hcy. No segundo capítulo, vimos que em fatias de córtex cerebral a Hcy prejudica o metabolismo energético, aumentando a morte neuronal e induzindo estresse oxidativo. Todavia, o calcitriol atenuou esses efeitos deletérios induzidos pela Hcy através da ativação do receptor de vitamina D. No último capítulo desta tese, realizamos um estudo em cultura primária de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos. Nossos resultados demonstram que a Hcy ativa a via do fator nuclear kappa B (NFκB), inibindo a expressão de heme oxigenase 1 (HO-1), promovendo alterações morfológicas, aumentando a resposta inflamatória e diminuindo as defesas antioxidantes e a atividade da Na+, K+ - ATPase. Em resumo, em todos modelos experimentais estudados nesta tese, a Hcy, mesmo em concentrações leves e moderadas causou alterações na homeostasia celular. A vitamina D preveniu parte destes efeitos, tornando-se um possível ferramenta terapêutica no intuito de atenuar os efeitos da Hcy. / Hyperhomocysteinemia (HHcy), mild and moderate are a risk factor for cardiovascular and cerebral diseases, but the mechanisms and complications of this condition are not yet well established. It occurs in 5-10% of the general population and 40% of patients with peripheral vascular and cerebrovascular disease. Recent studies have shown that vitamin D (calcitriol) has protective effects in various experimental models which emphasize their potential antioxidant actions. The main objective of this PhD thesis was to establish an experimental with different concentrations of homocysteine in slices of cerebral cortex and heart in adult rat astrocyte cultures. Following this experimental model, we investigated some biochemical parameters in the cerebral cortex and heart of rats. It was subsequently examined the protective effect of calcitriol. In the first chapter of this thesis, we found that incubation of 30 μM of Hcy for 30 min and 60 min in heart slices change the function and mitochondrial permeability, redox state and activity of the enzymes of the respiratory chain; calcitriol was able to prevent most of the effects of Hcy. In the second chapter, we demonstrated that Hcy in the cerebral cortex slices impairs energy metabolism, increasing neuronal death and inducing oxidative stress. However, calcitriol attenuated these Hcy-induced deleterious by activation of vitamin receptor D. In the last chapter of this thesis, we conducted a study in primary culture of cortical astrocytes. Our results demonstrate that the Hcy active the pathway of nuclear factor kappa B (NFκB) inhibiting heme oxygenase expression 1 (HO-1), promoting morphological changes, increasing the inflammatory response and decreased antioxidant defenses and activity of the Na +, K + - ATPase. In summary, in all experimental models studied in this PhD thesis, Hcy, even in mild and moderate concentrations caused deleterious actions in cellular homeostasis. Vitamin D warned of these effects, becoming a potential therapeutic target in order to attenuate the effects of Hcy.

Introdução: Dispepsia funcional é uma doença que possui critérios diagnósticos definidos por reuniões de consenso, conhecidos por critérios de Roma. Apresenta alta prevalência mundial, grande impacto social e redução na qualidade de vida do indivíduo. Helicobacter pylori está envolvida na patogênese da dispepsia funcional, sendo indicada sua detecção e erradicação no tratamento dos pacientes dispépticos funcionais. H. pylori também tem sido sugerida como um importante agente na etiologia de níveis baixos de Vitamina B12 no soro. A hiperhomocisteinemia secundária à deficiência de Vitamina B12 e folato podem constituir um risco para as doenças cardiovasculares. Objetivo: investigar a relação entre os níveis séricos de Vitamina B12, folato e homocisteína e infecção pelo H. pylori em pacientes dispépticos funcionais. Métodos: Foram incluídos pacientes dispépticos funcionais, pelos critérios de Roma III do estudo HEROES (Helicobacter Eradication Relief of Dyspeptic Symptoms) - ClinicalTrials.gov número NCT00404534. Os pacientes dispépticos que apresentaram positividade para H. pylori foram randomizados para erradicação da bactéria com antibiticoterapia oral ou placebo. Após doze meses realizaram o segundo exame endoscópico com mesma metodologia. Da amostra total, 77 continuaram positivos para a infecação por H. pylori e 77 tiveram como resultado a erradicação da bactéria H. pylori, ou seja, negativaram. O material biológico foi previamente coletado e armazenado, além dos respectivos dados demográficos e clínicos. As amostras foram armazenadas a -80◦C em ependorf e realizadas medidas em soro dos níveis de vitamina B12 e folato e homocisteína. Resultados: Da amostra total, 77 pacientes eram H. pylori positivo (15 homens e 62 mulheres) e 77 eram H.pylori erradicados (21 homens e 56 mulheres). A média de idade foi de 47,8±11,5, em relação à idade e gênero não houve diferença significativa entre os grupos (p > 0,05). Quanto aos resultados reunidos em categorias (níveis de vitamina B12, folato e homocisteína), conforme os pontos de corte usados na literatura, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos de pacientes (p > 0,6). Não houve correlação entre idade e níveis de vitamina B12 (p = 0,924). Houve diferença entre gêneros para homocisteína (p = 0,035), porém não houve significância para vitamina B12 (p = 0,584) e folato (p = 0,312). Não houve diferença entre níveis de homocisteína de pacientes H. pylori positivos e H. pylori erradicados para ambos os gêneros (p > 0,5). Conclusões: O presente estudo demonstrou que não houve relação significativa entre os níveis séricos de Vitamina B12, folato e homocisteína e infecção por H. pylori em relação aos H. pylori erradicados nos dispépticos funcionais. E quanto aos níveis de homocisteína comparados entre gêneros, os valores foram mais altos em homens. / Introduction: Functional dyspepsia a disease which has diagnosis criteria defined by consensus gatherings, known as the Rome criteria. It is highly prevalent worldwide, has great social impact, and reduces the quality of life of individuals. Helicobacter pylori is involved in the pathogenesis of functional dyspepsia, and its detection and eradication are indicated in the treatment of functional dyspepsia patients. H. pylori has also been suggested as an important agent in the etiology of low levels of vitamin B12 in serum. A hyperhomocysteinemia secondary to vitamin B12 and folate deficiencies could pose a risk for cardiovascular diseases. Objective: To investigate the relationship among the serum levels of Vitamin B12, folate and homocysteine, and the H. pylori infection in functional dyspeptic patients. Methodology: A group of patients with functional dyspepsia was included, following the Rome III criteria from the study HEROES (Helicobacter Eradication Relief of Dyspeptic Symptoms) – ClinicalTrials.gov number NCT00404534. The dyspeptic patients who were positive for H. pylori in tissue biopsy were randomized to eradication of the bacteria with oral antibiotic therapy or placebo. After twelve months, a second endoscopy was performed with the same methodology. Of the total sample, 77 patients remained positive for H. pylori and 77 patients had as a result the eradication of H. pylori bacteria, that is, they became negative. The biological material was previously collected and stored, besides its demographic and clinical data. The samples were stored at -80◦C in Eppendorf, they were measured in the serum of vitamin B12 folate and homocysteine levels. Results: Of the total sample, 77 patients were positive for H. pylori (15 men, 62 women) and 77 patients had the eradication of H. pylori (21 men, 56 women). The average age of the sample was about 47,8±11,5,regarding age and gender, it was not observed significant difference between the groups (p > 0,05). Concerning the results gathered into categories (the levels of vitamin B12, folate, and homocysteine), as the cut off points used in the literature, it was not observed statistically significant difference between the two groups of patients (p > 0,6). There was no correlation between age and vitamin B12 levels (p = 0,924). There was difference between genders for homocysteine (p = 0,035), but there was no significant difference for vitamin B12 (p = 0,584) and folate (p = 0,312). There was no difference between homocysteine levels of positive patients for H. pylori and H. pylori eradication in both genders (p > 0.5). Conclusions: The study showed no significant relationship between the serum levels of vitamin B12, folate, and homocysteine and the H. pylori infection in relation to H. pylori eradication in functional dyspeptic patients. Regarding homocysteine levels compared between genders, the values were higher in men.

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.