O câncer cervical é uma neoplasia muito prevalente na população feminina e está associado à infecção pelo papilomavírus humano (HPV). As oncoproteínas E6 e E7 de HPV de alto risco são as principais responsáveis pelas alterações celulares que levam ao desenvolvimento deste tipo tumoral. A dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26) é uma enzima que exerce importantes funções relacionadas à progressão tumoral. Diversos estudos demonstram alterações na expressão e atividade desta proteína em diferentes tipos de câncer. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, e que ainda não existem estudos relacionando esta proteína ao câncer cervical, neste estudo inicialmente investigamos a expressão e atividade da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de carcinoma cervical humano (SiHa, HeLa e C33A) e em queratinócitos imortalizados (HaCaT). Nossos resultados demonstram uma baixa expressão da DPPIV/CD26 nas linhagens celulares estudadas, sendo praticamente indetectável na linhagem HeLa. Foi verificada a atividade enzimática dipeptidilpeptidásica tanto ligada à membrana quanto solúvel em todas as linhagens. Na presença do inibidor de DPPIV/CD26 (fosfato de sitagliptina) observamos que a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração celular, e assim sugerimos que ao menos em parte a migração nesta linhagem é regulada pela atividade enzimática da DPPIV/CD26. A fim de investigar a relação da expressão da DPPIV/CD26 com as oncoproteínas E6 e E7 do HPV, avaliamos sua expressão em queratinócitos normais e transduzidos com estas oncoproteínas. Verificamos que queratinócitos expressando E6 de HPV de alto risco apresentam uma redução na expressão da DPPIV/CD26, e esta regulação parece ser dependente da degradação da p53. Considerando que as linhagens celulares estudadas apresentam baixa expressão e atividade da DPPIV/CD26, para melhor compreender a importância da expressão desta proteína, nós induzimos a superexpressão da DPPIV/CD26 em linhagem de câncer cervical (HeLa) para posterior avaliação dos efeitos em diferentes mecanismos tumorais. Os resultados demonstram uma redução no crescimento de células expressando DPPIV/CD26, sendo este efeito independente da atividade enzimática. Além disso, foi demonstrado que a indução da expressão de DPPIV/CD26 não afeta os mecanismos de migração e adesão celular na linhagem HeLa. Sendo assim, acreditamos que o esclarecimento do papel da DPPIV/CD26 no contexto do câncer cervical possibilita que novas abordagens diagnósticas e terapêuticas sejam implementadas no futuro. / Cervical cancer is a very prevalent neoplasm in female population and is associated with human papillomavirus (HPV) infection. The high risk HPV E6 and E7 oncoproteins are responsible for cellular alterations that lead to the development of this tumor type. The dipeptidyl peptidase IV (DPPIV/CD26) is an enzyme that exerts important functions related to tumor progression. Several studies have shown changes in the expression and activity of this protein in different types of cancer. Considering the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, and that there are still no studies relating this protein to cervical cancer, in the present study we first investigated the DPPIV/CD26 expression and activity in human cervical carcinoma cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and in immortalized keratinocytes (HaCaT). Our results demonstrate a low DPPIV/CD26 expression in the studied cell lines, being almost undetectable in HeLa cell line. The dipeptidylpeptidasic enzymatic activity was verified both membrane bound and in the soluble form in all cell lines. In the presence of the DPPIV/CD26 inhibitor (sitagliptin phosphate) we observed that SiHa cell line showed an increase in cell migration, thus we suggest that at least in part cell migration in this cell line is regulated by DPPIV/CD26 enzymatic activity. In order to investigate the relationship between DPPIV/CD26 expression and HPV E6 and E7 oncoproteins, we evaluated the expression of this protein in normal keratinocytes or transduced with these oncoproteins. We have found that keratinocytes expressing high-risk HPV E6 present a reduction in DPPIV/CD26 expression, and this regulation appears to be dependent on p53 degradation. Considering that the cell lines studied have low DPPIV/CD26 expression and activity, in order to better understand the importance of the expression of this protein, we induced the DPPIV/CD26 overexpression in a cervical cancer cell line (HeLa) for further evaluation of the effects on different tumor mechanisms. The results demonstrate a reduction in cell growth of DPPIV/CD26 expressing cells, being this effect independent of the enzymatic activity. In addition, it has been demonstrated that the induction of DPPIV/CD26 expression does not affect the cell migration and adhesion mechanisms in the HeLa cell line. Thus, we believe that the elucidation of the DPPIV/CD26 role in the context of cervical cancer enables new diagnostic and therapeutic approaches to be implemented in the future.

O carcinoma cervical invasivo é o terceiro tipo de câncer que mais acomete as mulheres no mundo, sendo responsável por 270 mil óbitos por ano. Estudos multicêntricos puderam identificar a presença do DNA do HPV em quase 100% dos carcinomas cervicais, estando já bem esclarecido que o papilomavírus humano (HPV) é causa para o câncer cervical, sendo fator necessário, mas não suficiente para o desenvolvimento da doença. A melhor forma de evitar o câncer de colo do útero é a prevenção. Considera-se como prevenção primária a vacina anti-HPV e, como prevenção secundária, o rastreio de lesões precursoras do câncer, seja pela citologia oncótica ou o rastreio molecular. Este último, por identificar a presença de DNA de HPV de alto risco oncogênico, tem se mostrado a maneira mais eficaz. Existem dúvidas sobre o melhor teste a ser usado para este tipo de rastreio, uma vez que existem ensaios distintos que identificam diferentes genes alvo, considerando-se que, durante o processo de integração do genoma do HPV ao genoma do hospedeiro, pode ocorrer a perda de qualquer um dos genes virais. Este pode ser um dos motivos de alguns tumores cervicais apresentarem resultados falsos negativos para HPV. Neste trabalho foram utilizadas 57 amostras de câncer cervical confirmadas no exame anatomopatológico, negativas para HPV na plataforma BD Onclarity HPV Assay(TM), cujo gene alvo é E6/E7 e positivas para beta-globina humana, provenientes de um estudo anterior. Usando o restante do DNA já extraído, essas amostras foram genotipadas no sistema INNO-LiPA HPV Genotyping Extra II(TM), que tem como alvo o gene L1. Como controle, foram testadas mais 27 amostras cujo resultado foi positivo para algum tipo de HPV de alto risco naquela plataforma. Para tanto, selecionamos a amostra seguinte a cada uma das amostras negativas, cujo resultado fosse positivo. Nosso principal achado foi a constatação de que a concordância entre os dois métodos testados é boa (Kappa 70). Das 84 amostras genotipadas nas duas plataformas, 64 (76,2%) tiveram os mesmos resultados, sendo 26 negativas, 15 inadequadas e 23 positivas. No entanto, 20 amostras (23,8%) tiveram resultados discordantes. Para tentar esclarecer estes casos, foi realizado o ensaio de PCR em tempo real para HPV 16 com alvo em E7 em 4 amostras positivas para HPV nos dois métodos e 2 amostras com resultado de HPV 16 apenas em um dos ensaios. Nenhum dos testes deste estudo pôde chegar a 100% de positividade nestes tumores cervicais, apesar da histologia realizada pelo setor de anatomia patológica do ICESP ter confirmado serem todos tumores primários do colo do útero. Assim sendo, sugerimos que esses resultados falsos negativos podem ser devidos a problemas na coleta do material, na preservação ou dificuldade dos métodos detectarem HPV em amostras fixadas em formol e embebidas em parafina, hipótese reforçada pela concordância obtida nos casos considerados inadequados para análise pelos dois métodos. / Invasive cervical carcinoma is the third most common form of cancer in the world, accounting for 270,000 deaths per year. Multicenter studies have identified the presence of HPV DNA in almost 100% of cervical carcinomas, and it is well established that human papillomavirus (HPV) is cause of cervical cancer, being necessary, but not sufficient to the development of the disease. The best way to avoid cervical cancer is prevention. Primary prevention is the anti-HPV vaccine, and secondary prevention the screening of cancer precursor lesions, by either oncotic cytology or molecular screening, to identify the presence of high-risk oncogenic HPV. There are questions as to which test should be used for this type of screening, since they use different target genes, knowing that during the integration of the HPV genome into the host genome, any of the viral genes can be deleted . This may be one reason some cervical tumors have false negative results for HPV. In this work, we evaluated 57 samples of cervical cancer, confirmed by anatomic pathological examination, negative for HPV on the BD Onclarity HPV Assay(TM) platform, whose target is the E6 / E7 gene and positive for beta-globin, from a previous study using the remaining extracted DNA. These samples were genotyped by the INNO-LiPA HPV Genotyping Extra system, with target in L1 gene. As controls, we tested another 27 samples that were positive for some type of high-risk HPV on that platform. To do so, we selected the following sample to each of the negative samples, whose result was positive. Our main finding was that the results of the two methods were in good concordance (Kappa 70). Of the 84 genotyped samples in both platforms, 64 (76.2%) had the same results, 26 were negative, 15 inadequate and 23 were positive. Twenty samples (23.8%), however, presented different results. In the attempt to clarify the discordant cases, we performed real-time PCR for HPV 16 with E7 target, in four HPV positive samples in both methods, and two positive in only one of the assays. None of the tests in this study could reach 100% positivity in these cervical tumors, although the histology performed by ICESP\'s pathology department has confirmed that they were all primary tumors of the cervix. Therefore, these false negative results may be due to problems in the sample collection, preservation or difficulty of the methods to detect HPV DNA in formalin-fixed and paraffin-embedded samples, a hypothesis reinforced by the agreement obtained in cases considered unsuitable for analysis by the two methods.

A infecção por papilomavirus é a principal causa de desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) e câncer do colo do útero (CCU). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a persistência do genoma viral encontra-se associado a variantes moleculares específicas de papilomavirus humano (HPV) de alto risco. As moléculas HLA de classe II têm um importante papel na resposta imune. Associações entre HLA e CCU ou infecção por HPV tem sido demonstrado em diferentes populações. O nosso objetivo foi verificar se a variabilidade de HLA-DRB1 e DQB1 estavam associada ao CCU e NIC III em mulheres de Belém, uma população formada pelos 3 principais grupos étnicos humanos e uma área de alto risco para o CCU no Norte do Brasil. Foi investigada a existência de diferenças na distribuição de alelos HLA entre mulheres com CCU e NIC III portadoras de diferentes variantes de HPV-16 e mulheres citologicamente normais. Os genes HLA DQB1 e DRB1 foram tipados pelo método de PCR-SSO em 95 casos e 287 controles de mulheres com citologia normal atendidas em um centro de prevenção do colo do útero na mesma cidade. As variantes de HPV-16 foram tipadas por sequenciamento de um fragmento da região controladora do genoma viral (LCR). O polimorfismo na posição 350 do gene E6 foi tipado baseado em um protocolo de hibridização em pontos, para identificar a alteração na posição 350T→G. A magnitude das associações foi estimada por odds ratio (OR) e os respectivos intervalos de confiança (IC), ajustados para potenciais fatores de confusão. Uma associação positiva foi observada entre CCU e os haplótipos DRB1* 150 l-DQB1*0602, DRB1*04-DQB1*0301 e DRB1*1602-DQB1*0301. Ao contrário, DRB1*01-DQB1*0501 mostrou um efeito protetor. Os alelos DRB1*0804, DQB1*0402 apresentaram efeito protetor contra positividade por HPV. O alelo DQB1*0502 e o grupo DRB1*15 foram positivamente associados. Os nossos resultados mostram que as associações positivas de DRB1*1501 e DRB1*1602 podem ser atribuídas a variantes asiático-americanas quando comparado a variantes européias. O risco conferido a DRB1*1501 foi encontrado associado tanto a variantes E6350G quanto a variantes E6350T, entretanto, o maior efeito foi devido às variantes E6250T. A associação positiva de DRB1*1602 foi significativa somente no grupo de mulheres positivas para E6350G. Estes resultados estão de acordo com a composição étnica da população estudada bem como um maior potencial oncogênico de certas variantes. Nossos dados sugerem que a contribuição dos alelos HLA na susceptibilidade genética ao CCU difere de acordo com a distribuição das variantes de HPV em uma dada região geográfica ou grupo étnico. / Papillomavirus infection is the major cause for the development of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and invasive cervical cancer (ICC) in humano Epidemiological studies have demonstrated that persistence of the viral genome and development of cervical cancer are associated with specific molecular variants of high-risk human Papillomavirus (HPV). Human leukocyte antigen (HLA) molecules play a role in immune response and associations between HLA and IeC or HPV infections have been reported in several populations. We aimed to verify if HLA-DRB1 and DQB1 variability is related to ICC and CIN III in women from Belem, a population formed by the three main human ethnic groups and a high-risk area for this disease in Northem Brazil. We also investigated if there are differences in the HLA class II alleles distribution between women with ICC and CIN III that harbor different HPV-16 variants and women without cancer. HLA DRB1 and DQB1 were typed by PCR-SSO based methods in 95 ICC cases and 287 controls consisting of normal cytology from women attending cervical cancer screening programs in the same city. HPV-16 variants were typed by sequencing a PCR-amplified fragment of long control region (LCR) of the viral genome. The E6350 polymorphism was typed on the basis of a dot blot protocol targeting a specific nucleotide alteration in the position 350T→G of the E6 gene. The magnitude of associations was estimated by odds ratio (OR) and the respective 95% confidence interval (CI), adjusted for potential confounder factors. A positive association was found between ICC cases and DRB1*150 l-DQB1*0602, DRB1*04-DQB1*0301 and DRB1*1602-DQB1*0301 haplotypes. Conversely, DRB1*01-DQB1*05 showed a protective effect. DRB1*0804, DQB1*0402 showed negative association against HPV infection. DQB1*0502 and DRB1*15 were positively associated with HPV infection. Our study showed that positive association of DRB1*1501 and DRB1*1602 alleles may be attributed to AsianAmerican then European variants. Furthermore, the DRB1*1501 was found associated with both women carrying E6350G or E350T, however, a higher effect was observed for E6350T variants carriers. The positive association of DRB1*1602 was significant for women harboring E6350G then E6350T variants. These data are in agreement with ethnical component of the studied population as well as a higher oncogenic potential of certain HPV variants. Our results also suggest that the contribution of HLA class II alieles to the genetic susceptibility to ICC differs depending on the HPV-16 variants distribution in a given geographic and ethnic group.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2823_1.pdf: 9037757 bytes, checksum: fa5b9563e9f3a0baec78ac68dd1bc1a2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As infecções causadas por papilomavírus humanos (HPV) destacam-se por sua elevada frequência, implicações clínicas e interpessoais, além de serem identificadas como fatores relacionados à oncogenese. A infeção pelo HPV é considerada uma doença sexualmente transmissível relatada entre 10% a 20% da população adulta mundial. O HPV DNA está prevalente em 2% a 68% dos adultos. O HPV é considerado o agente etiológico essencial no desenvolvimento de neoplasias de colo uterino, que é a segunda causa mais importante de mortes em mulheres. A infecção pelo HPV tem sido correlacionada também com o câncer de anus, em 85% dos casos (Palesfsky, 1998), 35% a 50% dos casos de cânceres de vulva, vagina e pênis e em 10% dos casos de neoplasias de laringe, trato respiratório e digestivo (zur Hausen, 2009). O câncer gástrico é uma das principais causas de óbitos em todo mundo. Sua heterogeneidade o transforma em modelo para estudos em carcinogênese. A identificação de papilomavírus humano em neoplasias gástricas e esofágicas sugere a possibilidade de seu envolvimento na oncogênese destas neoplasias. Normalmente, amostras oriundas de biópsias diagnósticas e exéreses cirúrgicas são inclusas em parafina para posterior estudo histopatológico. Estas amostras podem servir de fonte para identificação genômica, através de técnicas adequadas. A presente Tese buscou o desenvolvimento de uma nova técnica de identificação de genes a partir de materiais biológicos conservados em parafina. Foram utilizadas amostras provenientes de pacientes portadores de adenocarcinoma gástrico e carcinoma epipermóide perianal. Os fragmentos do gene da proteína viral L1 foram amplificados através de PCR com o primer GP5+/6+ e o primer MY09/11, identificados com o uso dos equipamentos Bioanalyzer e Papillocheck. A técnica desenvolvida demonstrou-se eficiente na identificação do gene da proteína viral L1, em amostras fixadas em parafina

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A infecÃÃo pelo Papilomavirus humano à a principal causa do carcinoma de colo uterino. No Cearà o cÃncer cervical à o segundo mais freqÃente entre as mulheres, quando se excetua o cÃncer de pele. à uma doenÃa de fÃcil prevenÃÃo, haja vista que quando se dispÃe de um serviÃo bem estruturado a mortalidade à reduzida em atà 80% dos casos. O problema à que muitas mulheres nÃo tÃm acesso a testes de varredura, cujos motivos estÃo relacionados a diversas barreiras culturais e geogrÃficas, bem como a baixa oferta e/ou inexistÃncia de serviÃos. O Cearà conta com cerca de 10.000 agentes comunitÃrios de saÃde, o que representa uma possibilidade de se levar um teste de autocoleta atà estas mulheres, considerando, todavia, que este teste tivesse uma sensibilidade e especificidade aceitÃvel e, assim, atendendo rapidamente um quantitativo significativo de mulheres que nunca fizeram o exame de prevenÃÃo ou estÃo em intervalo recomendado para repeti-lo. Em face ao exposto, este estudo tem por objetivo comparar a sensibilidade e especificidade da Captura HÃbrida de espÃcime cÃrvico-vaginal para HPV-DNA por autocoleta domiciliar em condiÃÃes reais, com a Captura HÃbrida para HPV-DNA coletado por mÃdico ginecologista em consultÃrio e nas condiÃÃes ideais. Os dados foram coletados no perÃodo de agosto a dezembro de 2002, junto a 878 mulheres de cinco cidades cearenses. Estas foram submetidas, na mesma semana, aos testes de Captura HÃbrida por autocoleta, citologia, Captura HÃbrida coletada pelo mÃdico ginecologista, colposcopia e histopatolÃgico, quando necessÃrio. Das 878 mulheres participantes 815 foram consideradas negativas pelo padrÃo ouro, 54 foram consideradas positivas - baixo grau e 9 foram consideradas alto grau - carcinoma. Nos resultados das amostras para Captura HÃbrida HPV-DNA da autocoleta e da coleta mÃdica, obtiveram-se que em 546 casos, ambos os testes concordaram como negativos, em 216 casos concordaram como positivos, em 35 casos houve discordÃncia com a coleta mÃdica positiva e em 81 casos houve discordÃncia com a autocoleta positiva. Os percentuais de sensibilidade encontrados da citologia, Captura HÃbrida por coleta mÃdica e Captura HÃbrida autocoleta foram, respectivamente, 18,3%, 63,3% e 66,7%. Os percentuais de especificidade verificados da citologia Captura HÃbrida coleta mÃdica e Captura HÃbrida autocoleta foram, respectivamente, 98,0%, 73,0% e 68,7%. Comparando-se a concordÃncia entre ambas as coletas de Captura HÃbrida, obteve-se o coeficiente de Kappa (K=0,693) com um erro padrÃo de 0,026 embora existe diferenÃa significativa da prevalÃncia detectada por ambos os testes, teste de McNemar (p<0,001). Avaliando-se as Ãreas da curva ROC para ambos os testes, mostrou-se coleta mÃdica Ãrea=0,738 com coeficiente de 95% de certeza - o intervalo de confianÃa IC=[0,673;0,802] e autocoleta Ãrea= 0,670 com 95% de certeza - o intervalo de confianÃa IC=[0,597;0,742] para detecÃÃo do Papilomavirus. Concluiu-se haver boa concordÃncia entre os resultados obtidos pela autocoleta de espÃcime para realizaÃÃo da Captura HÃbrida HPV-DNA com a coleta mÃdica. / Human Papillomavirus infection is the mean cause of the most of cervical cancers. In Cearà this type of cancer is the second in frequency among the women, when the skin cancers are excluded. Cervical cancer is one the most preventable. Where well structured programs exist the mortality has declined, and in some cases in about 80% .The mean problem is that cervical cancer screening is not fully utilized among groups of women, especially those without access or because there are no services offered or when services exist there are many other barriers, since cultural aspects to geographic barriers. In Cearà exist well structured Health communitarian agents program, which we estimate in about 10.000 agents that cover fully the necessities of population in their areas and the all Cearà territory. With this program we can carry on one screening program by self-sampling if this test were acceptable and had a good sensitivity and specificity. By these communitarian agents we could insert in screening program all women who never underwent to pap smear or other type of screening test. The mean objective of this work is to determine whether testing of self-collected vaginal specimen for Human Papillomavirus has the same accuracy of sampling collected by physicians . In order to evaluate this one Cross-sectional observational study was done between August and December of 2002, 878 women from five municipalities were enrolled and the tests were done in the same week, the women started by doing self-sampling at home and after that they were undergone in physicianâs clinics to the others examination in following sequence cytology, hybrid capture HPV-DNA, colposcopy and when were necessary biopsy. OF 878 women that participated in this study , 815 were considered negative by the gold standard ,54 were considered positive low grade and 9 were high grade/ carcinoma . Of 878 samples to HPV-DNA , there was negative concordance to both test in 546 samples, there was positive concordance in 216 samples, there was discordance in 35 samples where the physician collect were positive and finally there was discordance in 81 samples where the self-collect were positive. The results of sensitivity to cytology, Hybrid Capture by physicians, Hybrid Capture by self-sampling were, respectively 18%, 63,3% and 66,7%. The prevalence estimated by the gold standard were 7,2% in this sample. The results of specificity to cytology, hybrid capture by physicians, hybrid capture by self-sampling were, respectively 98%, 73% and 68,7%. There was significant difference between the results of HPV-DNA self-collected and collected by the physicians, McNemar test p<0,001. When we compare the concordance through the Kappa index we have obtained k=0,693 with stand error of 0,026. Compared the areas obtained by the ROC curve as follows area=0,738 that represent the achievement of physician collected with IC=[0,673;0,802] with 95% confidence interval to detect HPV in sample, area=0,670 that represent the achievement of self-collected sample to HPV with the 95% of confidence interval IC=[0,597;0,742].We concluded that Hybrid Capture by self-collected vaginal sample is as good as Hybrid Capture collected by the physicians, and there was good concordance between these tests.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-07T12:10:47Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa - 2006.pdf: 1500361 bytes, checksum: 3401843db66da8f77a90a41b7a08f826 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-07T12:14:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa - 2006.pdf: 1500361 bytes, checksum: 3401843db66da8f77a90a41b7a08f826 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:14:51Z (GMT). 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Surgery was the treatments that present fewer rates (34%) and chemotherapy was associated to the most survival rate (54%). Patients that use tobacco presented a survival rate of 43% while non-tabagists present a rate of 60% of surviving. Relative survival rate for patients diagnosed with hypo pharynx tumor was 38% and estimated censure for 5 years was just 5%. Survival rate was extremely decreased due to 45% of cases were diagnosed in advanced stages of disease. It is important to point out that preventive campaign is important to evade the increasing of these pathologies that are related to behavior of tabagism and etilism. Present study also evaluates cytogenetically individuals diagnosed with hypo pharynx cancer. Cytogenetic analysis of exfoliated cells is largely used to evaluate cytotoxic and genotoxic alterations on people exposed to potentially mutagens. A number of 36 individuals were analyzed, representing case group, and 36 healthy individuals composed control group. Data was collected and analysis was performed to estimate main nuclear alterations. Standard protocols were adopted to collect and counting cells. Micronuclei test was used to determinate the frequency of cytotoxic and genotoxic alterations. Besides than micronuclei others alterations like broken-eggs, binucleated cells and piknotic nuclei are good markers of cell alterations because they are resulted from cytotoxic events frequently related to occupational exposure. Behaviors like tabagism, etilism and exposition time were also investigated to correlate cells alterations. The correlation between micronuclei frequencies of case and control group test doesn’t show statistic difference. Broken egg and binucleated cells were the most observed anomalies on case group and showed up significant statistic difference (p=0.03). Results indicates a high grade of cytotoxic anomalies on individuals with hypo pharynx cancer, specially in tabagists and chronic etilists individuals, behaviors that are correlated to induct and promote tumors in susceptible people due their capabilities to affect cell cycle. Studies about relationship between Human Papillomavirus (HPV) and cancer development are performed since 80’s. Although the correlation of HPV and cervical cancer are well established, the possible role of HPV and head and neck cancer are still unclear. Among controversial factors of HPV and carcinogenesis of squamous epithelial cells, there is a viral incidence that oscillates from 0 to almost 100% on studies that includes a myriad of viral genome detect methods, such Blotting and PCR. Importance of HPV infection and epithelial carcinogenesis is related to capabilities of High risk HPV 16 and 18 to promote cell alterations, by tumor suppressor proteins inactivation, tumor suppressor genes blockage and insertions of HPV oncogenes. On present study, HPV detection and typing was performed on tumors derived from hypo pharynx of 24 patients diagnosed with cancer (CID-O: C12,0 to C13,9). All samples was submitted to PCR with generic primers MY09/11 and GP05/06, as specific primers to HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 and 58. Results shows that on 9 of 24 samples, HPV were detected by generic primers (a rate of 37,5%) and HPV types 16, 18 and 45 were identified, with a sample presenting coinfection of HPV 16 and 18. / A hipofaringe, região inferior da faringe, também chamada de laringofaringe ou faringolaríngea, serve aos sistemas respiratório e digestivo, funcionando como passagem para o ar e os alimentos. É composta de tecido epitelial escamoso estratificado não-queratinizado, com grande quantidade de glândulas seromucosas. As estatísticas mostram que entre 85 e 90% dos cânceres que acometem a hipofaringe são carcinomas espino-celulares. A lesão inicial no seio piriforme apresenta-se macroscopicamente sob o aspecto de um nódulo ou úlcera, tendo como característica principal, a rápida disseminação pela submucosa. Atualmente, com a associação de cirurgias radicais e radioterapia pós-peratória aumentou-se o controle locorregional destes tumores, contudo, a sobrevida global não sofreu alterações em decorrência das metástases à distância, o que não representa uma falha no tratamento realizado e sim uma evolução natural devido à característica invasiva desse tipo de neoplasia. Os tumores malignos de hipofaringe não são freqüentes, representando entre 5 a 10% das neoplasias das vias aerodigestivas superiores e apenas 0,5 % de todos os cânceres. Porém, do conjunto das neoplasias malignas da região da cabeça e pescoço, tumores de hipofaringe apresentam o pior prognóstico. A avaliação das tendências epidemiológicas apresentadas pelo câncer de hipofaringe em Goiânia no período de 1998 a 2003, analisando os dados disponíveis pelo Registro de Câncer de Base Populacional da Associação de Combate ao Câncer em Goiás, mostrou uma sobrevida relativa dos pacientes do sexo masculino diagnosticados com câncer de hipofaringe foi de 38% após 60 meses de segmento, enquanto que para o feminino apresentou-se uma sobrevida máxima de 100%, com todas as pacientes curadas. Dentre os tratamentos realizados, a cirurgia apresentou a menor taxa de sobrevida (34%) ao passo que para a quimioterapia foi associada uma sobrevida de 54%. A sobrevida dos pacientes tabagistas (43%) se mostrou muito inferior à dos indivíduos que não eram tabagistas (60%). Em fim, ao longo de cinco anos de segmento deste estudo, a taxa de sobrevida relativa para portadores de tumores malignos da hipofaringe foi de aproximadamente 38%, estimada para cinco anos com uma censura de apenas 5%. A taxa de sobrevida relativa é diminuída uma vez que cerca de 45% dos casos, o diagnóstico é feito tardiamente. O presente estudo também avaliou as alterações citogenéticas nucleares de pacientes portadores de câncer na região da hipofaringe. Foram analisados 36 indivíduos do grupo de casos, constituído de pacientes diagnosticados com tumores de hipofaringe, e 36 indivíduos saudáveis do grupo controle. Para obtenção dos dados foram considerados hábitos de consumo como tabagismo e etilismo e principalmente o tempo de exposição. Foram contadas 5000 células por indivíduo e as freqüências de micronúcleo, binucleadas, broken eggs e demais aberrações nucleares, foram calculadas para ambos os grupos. A freqüência de micronúcleo mostrada entre o grupo controle e o de casos não apresentaram diferença estatística. Porém, foi observado, por parte do grupo de casos, um grande número de células com broken eggs e binucleadas. Tais resultados demonstraram diferença estatística (p = 0,03). A binucleação e a formação de dois núcleos em forma de broken egg sugere que agentes como o tabaco e o alcoolismo crônico podem estar relacionados com a indução e progressão de tumores em pessoas susceptíveis, devido à capacidade desses mutágenos afetarem o ciclo celular. Dentre os fatores que geram controvérsias, podemos destacar o achado freqüente de variados tipos de HPV em mucosa oral normal, numa incidência que varia de 0% a quase 100% em diversos estudos, com numerosos métodos de identificação, incluindo entre eles um método altamente sensível, a PCR. A importância da infecção pelo HPV na carcinogênese de células epiteliais é suportada pela capacidade dos HPVs de alto risco, principalmente os tipos 16 e 18, de imortalizar os queratinócitos orais, quando em análise in vitro. O processo de imortalização pode envolver a desativação de proteínas supressoras de tumores pré-formadas pelas oncoproteínas virais, o bloqueio da transcrição de genes supressores de tumores como resultado da inserção do oncogene do HPV, ou a estimulação da transcrição do oncogene celular pela inserção de seqüências ativadoras de transcrição derivadas do próprio genoma do HPV. No presente estudo, o grupo amostral foi constituído de 24 pacientes diagnosticados com carcinoma de hipofaringe. Os casos foram obtidos do Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia/GO da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Todos os pacientes considerados foram diagnosticados como carcinomas de hipofaringe (CID-O: C12.0 a C13.9). Todas as amostras foram submetidas a uma PCR com os primers genéricos MY09/11 e GP05/06 para detecção em amplo espectro do genoma de HPV. Posteriormente, utilizou-se a mesma abordagem, com os primers tipo-específico para HPVs 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 e 58. Em 9 das 24 amostras utilizadas, foi observada amplificação com os primers genéricos, identificando-se o genoma de HPV em 37,5% (6/24) dos casos. Em 67% (6/9) das amostras, o genoma viral foi detectado por MY09/11 e em 33% (3/9) pelos primers GP05/06. As amostras positivas foram então submetidas a uma segunda PCR para a genotipagem dos HPVs, tendo sido observados os tipos 16, 18 e 45. Os tipos virais mais associados ao câncer da hipofaringe, no presente estudo, foram os HPV 16 e 18, presente em 6 amostras e o HPV45, encontrado em 1 amostra. Em um paciente foi observada a co-infecção de tipos virais de HPVs 16 e 18. Contudo, mesmo diante de tantas pesquisas realizadas, há muito para ser explorado, apesar de uma hipótese possível para a carcinogênese ser a interação sinérgica de carcinógenos químicos, virais, oncogenes e genes supressores de tumores.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) Previous issue date: 2014-04-08 / The human papillomavirus (HPV) is a major etiologic factor in the development of cervical cancer, DNA virus primarily infects the epithelium and may induce benign and malignant lesions of the mucous membranes and skin. Carcinogenesis is a multistep process that involves both changes genetic and epigenetic. The two changes epigenetic most studied are DNA methylation and histone acetylation. DNA methylation may be related development to cancer, and their presence or absence can affect the prognosis. The objective of this study was to evaluate the prognosis of patients with cervical cancer in stages I and II through the verification of HPV high and low risk, and the presence and absence of genes methylated and unmethylated RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT. We analyzed 129 records and samples of paraffin embedded biopsies of patients with cervical cancer in stages I and II. Detection of HPV - DNA was performed by PCR for HPV DNA of low and high oncogenic risk and MSP-PCR to detect the genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT. The calculation of survival used the Kaplan-Meier method and the log-hank test to compare means of survival between the prognostic factors for cervical cancer. The overall survival at 60 months of patients with the presence of RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT methylated or not were: 100%, 90.0%, 85.7%, 92.5%, respectively, and survival free of disease were 100%, 85.7%, 100%, 100%, respectively. The presence and absence of genes did not affect the overall and disease-free survival. The prevalence of HPV of low risk patients was 45% (58/129) and the high-risk HPV was 76% (98/129). Regarding the analysis to evaluate the existence of statistical relationships between the presence and absence of genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT with variables clinical and HPV, it was found that there were no significant differences in the presence and the absence of genes the methylated or not in relation to the distribution of variables. The study demonstrated that the absence and presence of genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT, did not influence the prognosis of patients suffering from cervical cancer in stages I and II. / O papilomavírus humano (HPV) é um importante fator etiológico no desenvolvimento do câncer cervical, o DNA viral infecta principalmente o epitélio e pode induzir lesões benignas e malignas das membranas de mucosa e pele. A carcinogênese é um processo de múltiplas etapas que envolvem tanto mudanças genéticas quanto epigenéticas. As duas mudanças epigenéticas mais estudadas são a metilação do DNA e acetilação das histonas. A metilação do DNA pode estar relacionada com o desenvolvimento do câncer, e a sua presença e ausência pode afetar no prognóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar o prognóstico das pacientes portadoras de câncer cervical nos estádios I e II por meio da verificação de HPV de baixo e alto risco e da presença e ausência dos genes metilados e não metilados RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT. Foram analisados 129 prontuários e amostras de biópsias parafinizadas das pacientes portadoras de câncer cervical nos estádios I e II. A detecção do DNA – HPV foi realizada por PCR para detectar o DNA do HPV de baixo e alto risco oncogênico e a MSP-PCR para detectar os genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT. O cálculo de sobrevida utilizou-se o método de Kaplan-Meier e o teste de log-hank para comparação das médias de sobrevida entre os fatores prognósticos para câncer cervical. As sobrevidas globais aos 60 meses das pacientes com a presença de RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT metilado ou não foram de: 100%, 90,0%, 85,7%, 92,5%, respectivamente, e as sobrevidas livre de doença foram de 100%, 85,7%, 100%, 100%, respectivamente. A presença e ausência dos genes não interferiram nas sobrevidas global e livre de doença. A prevalência de HPV de baixo risco das pacientes foi de 45 % (58/129) e o HPV de alto risco foi de 76 % (98/129). Em relação as análises para avaliar a existência de relações estatísticas entre a presença e a ausência dos genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT com as variáveis clínicas e do HPV, verificou-se que não houveram diferenças significativas com a presença e a ausência dos genes metilados ou não em relação com as distribuições das variáveis. O estudo demonstrou que a ausência e presença dos genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT, não influenciaram no prognóstico das pacientes portadoras do câncer cervical nos estádios I e II.

INTRODUÇÃO: Co-infecção HPV / HIV altera história natural das infecções por HPV, aumentando o risco de verrugas e neoplasias malignas do trato ano-genital. Há, no entanto, escassez de estudos de coorte envolvendo HPV no pênis dessa população. MÉTODOS: Estudo longitudinal, não probabilístico, com 144 homens de 18 e 70 anos de idade, sendo 72 HIV positivos e 72 HIV soronegativos, parceiros de mulheres com patologia associada a infecção pelo HPV. O estudo foi conduzido numa clínica pública de doenças de transmissão sexual em São Paulo (CRT-DST/AIDS), entre fevereiro de 2004 a março de 2005. Os participantes do estudo foram acompanhados por 180 dias para avaliar a persistência, a aquisição e a eliminação do DNA de HPV nos esfregaços penianos por meio da PCR. Este estudo também visou: Correlacionar os aspectos clínicos das lesões genitais com a histologia e a presença de DNA HPV; Comparar a aquisição, persistência, eliminação e ausência da infecção pelo HPV com a carga viral plasmática do HIV, contagem de células T CD4 e uso de terapia anti-retroviral (HAART). RESULTADOS: Não houve associação estatisticamente significativa nos dois grupos em relação a persistência, eliminação, aquisição ou mesmo ausência de HPV durante o seguimento. O grupo HIV positivo apresentou uma maior freqüência dos tipos oncogênicos de HPV em relação ao grupo HIV negativo (P = 0,041), além de uma maior freqüência de múltiplos tipos de HPV durante o seguimento de 180 dias (P = 0,049). As maiores taxas de aquisição e persistência de HPV foram observadas entre portadores de alta carga de HIV, baixo número de células T CD4, e não usuários de HAART. Aqueles em terapia anti-retroviral, com menos cópias de HIV e alto nível de T CD4 apresentaram maiores taxas de eliminação e ausência de HPV. CONCLUSÕES: Homens de ambos grupos podem ser considerados de alto risco, não tendo sido observada diferença na persistência, aquisição e a eliminação de DNA de HPV. Os homens HIV positivos apresentaram uma maior freqüência de infecção múltipla de HPV bem como os tipos mais freqüentes foram os oncogênicos em relação aos HIV negativos durante o seguimento. Os tipos de HPV 16, 6 e 84 foram os mais freqüentes nos homens soropositivos ao HIV, enquanto naqueles HIV negativos, predominaram os tipos de HPV 6, 51 e 84. As lesões clínicas e aceto-brancas observadas nos 2 grupos apresentaram as mesmas características histológicas, sendo coilocitose e papilomatose as mais significativas nas lesões clínicas quando comparada às lesões aceto-brancas. Nas lesões verrucosas, apenas um tipo de HPV foi observado, predominando o tipo 6 ou 11. Em torno de 23% das lesões aceto-brancas eram HPV negativas, sendo que nas positivas predominou o HPV 6. Homens soropositivos ao HIV que estavam usando HAART, com carga viral do HIV alta e contagem de células T CD4 baixa apresentaram maiores taxas de aquisição e persistência da infecção pelo HPV. Entretanto, os que não xvi estavam em terapia anti-retroviral, com carga baixa de HIV e contagem de células T CD4 alta apresentaram maiores taxas de eliminação e ausência de infecção pelo HPV. / BACKGROUND: Co-infection with HPV and HIV modifies its natural history and increases the risk of warts and neoplasia development in the anogenital tract. Cohort studies to address HPV infection in the penis are scarce, mainly in HIV infected individuals. METHODS: A longitudinal study, non-probabilistic, was conducted with 144 men of 18 to 70 years old including 72 HIV-positive and 72 HIV-negative, partners of women with HPV-associated disease. The study was conducted between February 2004 and March 2005 at a large sexually transmitted clinic in São Paulo (CRT-DST/Aids). Men were followed for 180 days to determine persistence, acquisition and clearance of HPV DNA in penile swabs using PCR. In addition, we aimed to correlate the clinical features of genital lesions with histology and the presence of HPV DNA, compare the acquisition, persistence, clearance and absence of HPV infection with plasma HIV viral load, CD4 T-cell count and use of HAART. RESULTS: Both groups showed no significant differences regarding persistence, clearance, acquisition and/or absence of HPV during follow-up. Penile smears of HIV-positive men showed a higher frequency of oncogenic types in relation to the HIV-negative (P = 0.041), as well as a higher frequency of multiple HPV types (P = 0.049). Significantly higher HPV DNA acquisition and persistence rates were observed among HIV-positive men not submitted to HAART, with higher HIV loads and lower CD4+ cells count. Among those men using anti-retroviral therapy, lower viral loads and higher T cell counts, higher rates of clearance and HPV DNA absence were observed. CONCLUSIONS: This male population altogether is considered to be at high risk of HPV DNA infection, which may be the reason why no differences in HPV acquisition, persistence and clearance were observed. HIV-positive men had a higher frequency of multiple HPV infection and the most frequent were oncogenic types. HPV types 16, 6 and 84 were the most frequently found in HIV-positive men, while in HIV-negative men, HPV types 6, 51 and 84 prevailed. Clinical and aceto-white lesions presented the same histological features in both HIV seropositive and -negative men. Koilocytosis and papillomatosis were the most significant histological features found in clinical lesions when compared to the aceto-white lesions. In condylomas, only one type of HPV was present, often HPV 6 or 11. About 23% of aceto-white lesions had no HPV DNA; in HPV-positive lesions, the predominant type was HPV 6. Higher rates of acquisition and persistence of HPV infection occurred in men who were using HAART, with high HIV viral load and low count of CD4. In contrast, those not under anti-retroviral therapy, had low HIV load and high CD4 T cells levels showed higher rates of clearance of HPV infection.

As oncoproteínas E6 e E7 do Papilomavírus Humano (HPV) estão envolvidas na desregulação do sistema imune inato, provocando alterações na expressão dos receptores do tipo Toll (TLR). Considerando-se a função da via de sinalização iniciada por TLR, haveria uma vantagem para o vírus capaz de manipular a resposta desta via de modo que possa persistir nas células sem ser detectado pelo sistema imune ou ainda modulando essa resposta e criando um ambiente mais propício à manutenção da infecção. No entanto, muitos dos mecanismos que levam à eliminação da infecção ou persistência do HPV ainda são pouco conhecidos. O objetivo principal desse trabalho é investigar o papel das vias de TLR no processo de carcinogênese mediado por HPV. Inicialmente, foi analisada a expressão de genes da via de TLR em linhagens de tumores cervicais e em células expressando as oncoproteínas virais. Foram identificados vários genes diferencialmente expressos entre linhagens de células tumorais e queratinócitos normais, incluindo moléculas adaptadoras da via de TLR e genes associados à via da MAP quinase, ativação de NFkappaB e resposta imune antiviral. Cerca de 90% destes genes foram regulados negativamente. Entre eles, destacamos HMGB1, que apesar de possuir menos RNAm nas células tumorais possui um nível proteico muito maior, além de ter-se mostrado de grande importância para a viabilidade e proliferação das células tumorais, conforme demonstrado através de experimentos de supressão gênica. Em conjunto, os nossos dados indicam que E6 e E7 de HPVs de alto risco inibem proteínas da via de sinalização de TLR / Previous studies have shown that E6 and E7 HPV oncoproteins are involved in innate immune system dysregulation, causing alterations on Toll-like receptors (TLR) expression. Considering TLR pathway function, it would be advantageous for a virus to manipulate the response of this pathway so it can persist in cells without being detected by the immune system or to modulate this response to create a better environment for persistence of infection. However, many of the mechanisms leading to HPV infection clearance or persistence are still unknown and matter of active investigation. We analyzed in cervical cancer cell lines expression of genes from TLR pathway; several were differentially expressed between tumor cells lines and normal keratinocytes, including TLR adaptors molecules and genes associated with MAP kinase pathway, NFkappaB activation and antiviral immune response. About 90% of these genes were down regulated. Among them, we selected HMGB1 for further characterization due to its interference with tumor cell viability and proliferation. Altogether, our data indicate that high risk HPV E6 and E7 can inhibit TLR signaling pathway

Seres humanos dependem incessantemente de um sistema de reconhecimento efetivo contra infecções para sobreviver. Dentre as diversas proteínas que compõem a resposta imune inata estão os receptores do tipo Toll (TLR Toll-like Receptors), que possuem a função de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos e dar início a uma resposta imune adequada. O carcinoma do colo uterino é uma das principais causas de morte de mulheres por câncer mundialmente, sendo o terceiro tipo de câncer mais comum entre mulheres. Este tipo de neoplasia é vinculada etiologicamente à infecção pelo Papilomavírus humano (HPV). Dentre as principais proteínas virais, E6 e E7 são responsáveis pela manipulação dos processos celulares para promover ciclo viral, sendo essenciais no processo de transformação celular. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar a importância da via de sinalização de TLRs sobre a infecção por HPV. O polimorfismo rs5743836, na região promotora de TLR9, capaz de alterar a expressão deste receptor, foi estudado quanto à influência sobre a história natural da infecção por HPV em uma coorte de mulheres brasileiras; nenhuma associação relevante foi encontrada, indicando que este polimorfismo não interfere significativamente na resposta à infecção e risco de desenvolvimento de lesões no colo do útero causadas por HPV. Proteínas componentes da via de TLRs demonstraram serem alvos de interação com E6 de HPV16; dentre elas, o notável adaptador MyD88 e IKK&#949;, enzima ativadora de importantes transfatores do sistema imune. Estas interações foram aqui estudadas. A interação de E6 com MyD88 resultou em estabilização da proteína viral, o que parece não depender do sítio LxxLL presente em MyD88, como ocorre com outros parceiros moleculares de E6. O sítio de interação de E6 com IKK&#949; coincide com a região onde se localiza o sítio catalítico desta enzima, sugerindo a ação de E6 na ativação de proteínas alvo de IKK&#949;. Esta interação foi observada em queratinócitos, células alvo das infecções por HPV. A produção de citocinas foi afetada por E6 de HPV16, resultando num aumento da quantidade de IL-8 e IL-6; a indução desta citocina poderia ser explicada pela ativação de IKK&#949;. Estes resultados apontam para a capacidade do HPV16 de interferir com o sistema imune, contribuindo para o processo de carcinogênese. / Humans constantly rely on an effective recognition system against infections in order to survive. Among various proteins that compose the innate immune response, Toll-like Receptors (TLRs) have the role to recognize pathogen associated molecular patterns and initiate a proper immune response. The cervical cancer is one of the main causes of women death worldwide, being the third most common cancer type among women. This type of neoplasia is etiologically associated with the Human papillomavirus (HPV) infection. E6 and E7, two main viral proteins, are responsible for manipulating the cellular processes to promote the virus\' life-cycle, being essential to the cellular transformation process. In the context, the objective of this work was to investigate the relevance of the TLR signaling pathway on the HPV infection. The rs5743836 polymorphism, in the TLR9 promoter region, capable of altering this receptor\'s expression, was studied regarding its influence on the natural history of HPV infection in a Brazilian women cohort; no relevant association was found, indicating that this polymorphism does not interfere significantly in the infection response and risk of developing cervix lesions caused by HPV. Component proteins of TLR pathway were shown to be interaction targets of HPV16 E6; among them, the notable adaptor MyD88 and IKK&#949;, enzyme that activates important immune system transfactors. These interactions were studied in this work. The interaction of E6 with MyD88 resulted in the stabilization of the viral protein, which seems independent of the LxxLL site present on MyD88, as in other E6 molecular partners. The interaction site on IKK with E6 matches with the region containing the enzyme\'s catalytic site, suggesting an influence of E6 in the activation of IKK&#949; target proteins. This interaction was observed in keratinocytes, natural targets of HPV infections. The cytokines production was altered by HPV16 E6, resulting in an increase of IL-8 and IL-6 concentration; the induction of the latter could be explained by the activation of IKK&#949;. These results point to the ability of HPV16 of interfering with the immune system, contributing to the carcinogenesis process.