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Caracterização funcional in vitro de variantes no gene PCSK9 identificadas em pacientes com Hipercolesterolemia Familial / In vitro functional characterization of PCSK9 variants identified in patients with Familial HypercholesterolemiaLos, Bruna 25 June 2019 (has links)
A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença genética do metabolismo das lipoproteínas, caracterizada pelo aumento do colesterol plasmático, transportado principalmente pela lipoproteína de baixa densidade (LDL). A HF é causada principalmente por mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As mutações conhecidas na PCSK9 podem levar ao aumento ou diminuição da função proteolítica da proteína, as quais são associadas ao aumento ou diminuição da LDL-c plasmática, respectivamente. Com o projeto genoma humano surgiram novos métodos de sequenciamento, o que resultou em um grande número de novas variantes genéticas relacionadas à HF. Entretanto, os mecanismos pelos quais essas variantes influenciam na concentração do colesterol e sua interferência na resposta terapêutica não estão totalmente elucidados. O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro o efeito de variantes na região codificadora e reguladora do gene PCSK9 identificadas em pacientes HF utilizando sequenciamento de nova geração. Para a caracterização funcional das variantes na região codificadora da PCSK9, primeiramente foi avaliado o impacto dessas variantes na interação PCSK9-LDLR via Docking molecular. Células HEK293FT foram transfectadas com as diferentes construções da PCSK9, e posteriormente, foram utilizadas em ensaios para avaliar a atividade do LDLR e a internalização de LDL por citometria de fluxo. Para as variantes na região reguladora da PCSK9, foi realizado uma predição in silico do possível efeito de variantes na região 3UTR na ligação de miRNAs. A avalição da interação entre os miRNAs preditos, e a região 3UTR da PCSK9, e o possível impacto nessa interação na presença de variantes na região 3UTR, foi realizada em células HEK293FT transfectadas com um plasmídeo contendo a 3UTR da PCSK9 e um gene repórter da Gaussia luciferase, juntamente com um plasmídeo de expressão contendo os miRNAs de interesse. Foi também estudado o efeito dos miRNAs preditos sobre a expressão, RNAm e proteína, da PCSK9 via RT-qPCR e Western blot, em células HepG2. Foram identificadas 9 variantes na região codificadora da PCSK9, e duas, E32K e R469W, foram selecionadas para os ensaios posteriores. Para a R469W foi observada uma possível alteração conformacional a qual poderia aumentar a afinidade da PCSK9 pelo LDLR. Para a E32K, uma possível associação com HF foi observada em uma família brasileira com ascendência japonesa. As variantes E32K e R469W apresentaram uma redução na atividade do LDLR de 5 e 11%, respectivamente em comparação a PCSK9-WT. Entretanto, não foram observadas reduções estaticamente significativas na atividade do LDLR e na internalização da LDL em células transfectadas com ambas as variantes. Dez variantes foram encontradas na região 3UTR da PCSK9, entre elas três foram selecionadas por impactar a ligação de quatro miRNAs. Nossos dados demonstraram uma redução significativa na expressão da PCSK9 em células HepG2 transfectadas com os miR-4721 e miR-564 (p=0,036 e p=0,010, respectivamente). Porém, não foi observada diferenças na expressão da luciferase em células transfectadas com esses miRNAs, não sendo possível validar a interação miRNA-RNAm. As variantes no gene PCSK9 identificadas no nosso estudo podem não explicar individualmente o fenótipo HF, mas podem contribuir para a severidade da doença juntamente com outras variantes em outros genes. / Familial Hypercholesterolemia (FH) is a genetic disorder of lipoprotein metabolism, characterized by elevated plasma cholesterol levels, mostly carried by low-density lipoprotein (LDL). FH is mainly caused by mutations in three genes, LDLR, APOB, and PCSK9. Gain-of-function mutations in PCSK9 reduce LDL receptor levels, resulting in high levels of LDL cholesterol in the plasma. Loss-of-function mutations lead to higher levels of the LDL receptor, resulting in lower LDL cholesterol levels. The Human Genome Project led to a faster technological development related to sequencing methods, which allowed identifying many novel variants associated with FH. However, the mechanisms by which these variants influence cholesterol levels and their interference in therapeutic response are not fully understood. The aim of the present study was to perform an in vitro characterization of the effect of PCSK9 variants identified in FH patients using Next-Generation Sequencing. For the functional characterization of variants in the coding region of PCSK9, the impact of these variants on PCSK9-LDLR interaction was evaluated by molecular docking. HEK293FT cells were transiently transfected with different PCSK9 constructs, and the amount of cell surface LDLR and LDL internalization were determined by flow cytometry. For the variants in PCSK9 3UTR region, an in silico prediction of PCSK9 3UTR variants in miRNA seed regions and target sites was performed. To determine whether the predicted miRNAs directly interact with PCSK9 3UTR region, HEK293FT cells were co-transfected with a vector containing a PCSK9 3\'UTR region and a Gaussia luciferase reporter gene, together with an expression plasmid containing the miRNAs of interest. The effect of the predicted miRNAs on the expression of PCSK9 was evaluated using RT-qPCR and Western blot in HepG2 cells transiently transfected with miRNA mimics. Nine missense variants were identified in PCSK9 gene. E32K e R469W were chosen for further analysis. For R469W, a possible conformational change was observed that could increase the affinity of PCSK9 for LDLR, when compared to the wild-type. For E32K, a possible association with FH in a Brazilian family with Japanese ancestry was observed. E32K and R469W had a 5% and 11% decreased level of cell surface LDLR, respectively, as compared with WT-PCSK9. However, no significant reduction in the number of cell surface LDLR and LDL internalization was observed in transfected cells for both variants. Ten variants were found in PCSK9 3\'UTR region, of which three were selected for affecting the binding of four miRNAs. Our data demonstrated a significant downregulation of PCSK9 in cells transfected with miR-4721 and miR-564 miRNA mimics, compared to cells transfected with a scramble control (p=0,036 and p=0,010, respectively). However, no differences in luciferase expression were observed in cells transfected with these miRNAs, therefore, it was not possible to experimentally validate miRNA-mRNA interaction. PCSK9 variants found in our study may not fully explain FH phenotype but may contribute to the severity of the disease together with other variants in other genes.
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Ação dos fitoesteróis sobre lesão aterosclerótica em camundongos com ablação gênica do receptor de LDL / Phytosterols effects over atherosclerotic lesion in mice with ablation of the LDL receptor geneBombo, Renata de Paula Assis 13 August 2014 (has links)
Introdução: Os fitoesteróis (FE) são reconhecidos por reduzirem a concentração plasmática de LDL-colesterol, sendo importantes coadjuvantes no tratamento da hipercolesterolemia moderada. Entretanto, estudos publicados recentemente demonstram resultados conflitantes em relação à eficiência dos FE na prevenção da aterosclerose. Além disso, algumas investigações evidenciaram que o aumento da concentração plasmática de FE está positivamente relacionado ao risco de desenvolvimento de aterosclerose. Com a finalidade de elucidar a sua ação sobre esses parâmetros, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de FE no desenvolvimento da aterosclerose em camundongos com ablação gênica para o receptor de LDL (LDLr-KO). Métodos: Os animais foram alimentados durante 16 semanas, com dieta rica em gordura (40% do valor calórico total da dieta), suplementada (grupo FE; 2%, n=10) ou não (Controle; n=10) com FE. Foram avaliadas as concentrações plasmáticas e hepáticas de colesterol, triglicérides, FE (beta-sitosterol, campesterol e latosterol). Na aorta dos animais, determinaram-se as concentrações de colesterol total, colesterol livre e éster e FE, além do infiltrado de macrófagos e infiltrado de lípides. Nos macrófagos do peritôneo dos animais, os quais assemelham-se aos presentes na artéria, avaliou-se a expressão de RNA mensageiro dos genes envolvidos no efluxo e influxo de colesterol (ABCA1, ABCG1, LOX1 e CD36). Também determinou-se as concentrações de FE no intestino e baço dos animais. Resultados: Conforme esperado, o consumo de FE induziu elevação plasmática dos principais FE, campesterol e de beta-sitosterol, reduzindo a concentração de colesterol no plasma. Houve aumento nas concentrações hepáticas de triglicérides e FE, entretanto, não foram observadas diferenças entre os grupos nas expressões de RNA mensageiro de genes lipolíticos (CPT, PPAR alfa) e lipogênicos (SREBP1-c, MTP, LXR e PPAR gamma) no fígado. Não houve, também, alteração no SREBP2, gene relacionado à síntese de colesterol. O conteúdo de colesterol total na artéria foi menor nos animais do grupo FE, não diferindo entre as formas livre e éster. As concentrações de FE na artéria foram iguais entre os grupos. A área de lesão no grupo FE foi menor em relação ao grupo-controle. A suplementação com FE induziu redução na expressão de RNA mensageiro de ABCG1, não interferindo na expressão dos outros genes estudados na artéria. Conclusão: Os achados deste estudo demonstram que a elevação de FE no plasma não induziu o seu acúmulo na parede da artéria e preveniu o desenvolvimento da aterosclerose / Introduction: The plasma cholesterol-reducing effect of hytosterols (PS) is well recognized and they are considered important adjuncts in the treatment of moderate hypercholesterolemia. However, recent studies have shown conflicting results regarding the efficiency of PS in the prevention of atherosclerosis. In addition, some studies showed that the increase in plasma PS concentration is positively correlated to the risk of atherosclerosis. In order to elucidate its action on these parameters, the objective of this study was to evaluate the effects of PS supplementation in the development of atherosclerosis in LDL receptor knock-out mice (LDLr -KO). Methods: The animals were fed during 16 weeks with high fat diet (40 % of calories as fat), supplemented (PS group, 2%, n = 10) or not (Control, n = 10) with PS. Plasma and liver concentrations of cholesterol, triglycerides, PS (beta - sitosterol, campesterol and lathosterol) were evaluated. In the aorta of the animals, the concentrations of total cholesterol, free cholesterol, cholesterol ester and PS, besides macrophage and lipids infiltration were determined. The mRNA expression of genes involved in cholesterol efflux and influx (ABCA1, ABCG1, LOX1 and CD36) were evaluated, in peritoneum macrophage, which resemble those present in the artery. It was also determined the intestine and spleen PS concentrations from the animals of both groups. Results: As expected, PS supplementation induced increasing plasma concentration of the main PS, campesterol and beta -sitosterol and reducing cholesterol plasma concentration. It was observed an increase so intestine and spleen PS concentrations. There was an increase in hepatic triglyceride concentrations and PS, however, no differences were observed between the groups of hepatic mRNA expression of lipolytic (CPT, PPARalfa) and lipogenic genes (SREBP1c, MTP, CPT, LXR, and PPAR gamma). There was no difference on SREBP2, gene related to cholesterol synthesis. The content of total cholesterol in the artery was lower in PS group animals however did not differ between the free and ester forms. Artery PS concentrations did not differ between groups. The lesion area in the PS group was lower than in the control group. PS supplementation induced reduction in mRNA expression of ABCG1, not affecting the expression of other genes studied in artery. Conclusion: The findings of this study demonstrate that the elevation of plasma PS concentration did not induce its accumulation in the arterial wall and prevented the development of atherosclerosis
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Papel de inibidores da síntese e absorção do colesterol na modulação de biomarcadores de inflamação e adesão celular in vivo e in vitro / Role of inhibitors of the cholesterol synthesis and absorption on modulation of inflammation and cell adhesion biomarkers in vivo and in vitroCerda Maureira, Álvaro Danilo 24 May 2013 (has links)
O processo inflamatório tem um papel fundamental na gênese e desenvolvimento da aterosclerose, sendo que a disfunção endotelial é considerada um dos estágios iniciais da aterogênese. Por meio da inibição da enzima hidroxi-metil-glutaril coA redutase (HMGCR), as estatinas reduzem a biossíntese do colesterol e a formação de isoprenóides, produtos intermediários da síntese do colesterol que são importantes na modificação pós-transcricional de GTPases pequenas que estão envolvidas na disfunção endotelial e inflamação vascular. A ezetimiba é um inibidor da absorção do colesterol através da inibição da proteína NPC1L1. Com a finalidade de esclarecer os mecanismos moleculares da inibição da síntese e da absorção do colesterol sobre a modulação de biomarcadores inflamatórios e de adesão celular foram utilizados modelos in vitro com células endoteliais (HUVEC) e monócitos (células THP-1), e in vivo com células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos hipercolesterolêmicos (HC). O efeito das estatinas, atorvastatina e sinvastatina, e da ezetimiba na expressão de RNAm e proteínas de moléculas de adesão endoteliais e moduladores do processo inflamatório, como citocinas e óxido nítrico (NO), foi estudado em células HUVEC. O efeito desses fármacos sobre a expressão de moléculas de adesão monocitárias foi estudado em células THP-1. O efeito da terapia hipolipemiante sobre essas moléculas foi também estudada em CMSP de HC tratados com ezetimiba (10 mg/dia/4 semanas), sinvastatina (10 mg/dia/8 semanas) e sinvastatina combinada com ezetimiba (10 mg de cada/dia/4 semanas). A expressão de RNAm foi avaliada por RT-qPCR. A expressão de moléculas de adesão na superfície de células THP-1 e HUVEC foi estudada por citometria de fluxo. A quantificação de citocinas secretadas no sobrenadante de células HUVEC e no plasma dos HC foi analisada pela tecnologia Milliplex. A quantificação do perfil lipífico, Proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e NO foi realizada por métodos laboratoriais convencionais. O papel do NO na modulação dos marcadores inflamatórios pelas estatinas foi também estudada, usando modelo de células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm e também por meio do uso do inibidor da síntese do óxido nítrico, L-NAME. Também foi avaliado o efeito de hipolipemiantes na expressão dos microRNAs (miRs) 221, miR-222 e miR-1303 em células HUVEC por meio do stem-loop RT-qPCR. O tratamento com atorvastatina e sinvastatina reduziu a expressão de RNAm e proteínas das moléculas de adesão LSelectina, PSGL-1 e VLA-4, em células THP-1 pré-tratadas com TNFα por 12 h. A ezetimiba reduziu a expressão de L-Selectina apenas no nível transcricional. Em células HUVEC, as estatinas diminuíram a expressão de RNAm de IL1B e SELP, entretanto aumentaram a de VCAM1. A ezetimiba reduziu a expressão de RNAm do IL1B. Entretanto as expressões de SELE, MMP9, IL6 e MMP9 não foram afetadas pelos tratamentos. A expressão das proteínas ICAM-1 e P-Selectina, na superfície de células HUVEC, foi diminuída pelo tratamento com as estatinas, mas não pela ezetimiba. Da mesma forma, a secreção das citocinas IL-6 e MCP-1 foram reduzidas pelas estatinas, entretanto a secreção de IL-8 não foi modificada por nenhum dos tratamentos. A expressão de NOS3 e a liberação de NO em células HUVEC foi aumentada pelas estatinas, porém não foi estimulada pela ezetimiba. Entretanto, os efeitos antiinflamatórios exercidos pelas estatinas foram independentes dessa via devido a que estes efeitos foram mantidos em células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm. Apesar de que o efeito sobre ICAM-1 e MCP-1 foi atenuado quando as células foram simultaneamente tratadas com L-NAME, os efeitos das estatinas parecem ser independentes da liberação de NO. As estatinas e a ezetimiba reduziram a expressão do miR-221, em células HUVEC. A expressão do miR-222 foi reduzida só pelo tratamento com atorvastatina. A expressão do miR-1303 não foi modulada pelos tratamentos hipolipemiantes. Em pacientes HC, a terapia de associação da sinvastatina e ezetimiba demonstrou melhorar o perfil lipídico de forma mais efetiva que ambas monoterapias. Da mesma forma, o tratamento combinado resultou em maior beneficio pela redução da expressão de RNAm em CMSP e da concentração plasmática das proteínas IL-1 β, MCP-1, IL-8 e TNFα. A expressão de ICAM1 foi diminuída apenas no nível transcricional, entretanto a expressão de RNAm mas não da proteína do TNFα foi também reduzida pela sinvastatina em monoterapia. Não houve modulação de RNAm ou proteínas de outros marcadores estudados no modelo in vivo. Por outro lado, os efeitos anti-inflamatórios observados nos indivíduos HC foram independentes da modulação de PCRus e NO que não foram modificados pelos tratamentos hipolipemiantes. Neste estudo, foram confirmados os propostos efeitos pleiotrópicos das estatinas em modelos células de monócito e endotélio vascular in vitro e em pacientes HC. Por outro lado, apesar de ser menos potente que as estatinas foi mostrado que a inibição da absorção do colesterol tem também um efeito anti-inflamatório. A redução adicional do colesterol causado pela combinação das terapias hipolipemiantes outorga um maior beneficio cardiovascular em pacientes hipercolesterolêmicos. / The inflammatory process has a key role in the genesis and development of atherosclerosis and the endothelial disfunction is considered as a first step in atherogenesis. By inhibiting the hydroxyl-methyl-glutaryl coA reductase (HMGCR)m statins reduce the cholesterol synthesis and isoprenoid generation, which are intermediary products of cholesterol synthesis with important role in posttranscriptional modifications of small GTPases that are involved in endothelial disfunction and vascular inflammation. The ezetimibe is an inhibitor of cholesterol absorption by inhibiting the NPC1L1 protein. To clarify the molecular mechanisms of the inhibition of cholesterol synthesis and absorption modulating inflammatory and cell adhesion biomarkers we used in vitro models of endothelial cells (HUVEC) and monocytes (THP-1), and an in vivo model of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from hypercholesterolemic (HC) patients. The effect of the statins, atorvastatin and simvastatin, and the ezetimibe on mRNA and protein expression of endothelial adhesion molecules and modulators of the inflammatory process, as citokynes and nitric oxide (NO), was analyzed in HUVEC. The effect of these drugs on the expression of monocyte adhesion molecules was also studied in THP-1. The influence of hypolipemiant therapy on the adhesion molecules was also analyzed in PBMC from HC treated with ezetimibe (10 mg/day/4-weeks), simvastatin (10 mg/day/8-weeks) and simvastatin combined with ezetimibe (10 mg each/day/4-weeks). The mRNA expression was evaluated by RT-qPCR. The expression of adhesion molecules on the surface of THP-1 and HUVEC cells was analyzed flow cytometry. The citokynes in the supernatants of HUVEC were quantified using the milliplex technology. The Lipid profile, high-sensivity PCR (hsPCR) and NO were determined by conventional laboratory methods. The role of the NO on the statin-modulation of inflammatory markers was also studied using a model with silenced NOS3 by interference of mRNA and by the use of the inhibitor of NO synthesis, L-NAME. The effect of hypolipemiants on the expression of microRNAs (miRs) 221, miR-222 and miR-1303 was also evaluated in HUVEC using the stem-loom RT-qPCR. Atorvastatin and simvastatin reduced the mRNA and protein expression of the adhesion molecules L-Selectin, PSGL-1 and VLA-4 in THP-1 cells pre-treated with TNFα for 12 h. The ezetimibe reduced the L-Selectin expression only at transcriptional level. In HUVEC, statins diminished IL1B and SELP mRNA expression, whereas VCAM1 was increased. The ezetimibe reduced the IL1B mRNA expression. However, SELE, MMP9, IL6 and MMP9 mRNA expressions were not affected by the treatments. The protein expression of ICAM-1 and P-Selectin on the surface of HUVEC was reduced by statins, but not by the ezetimibe. Similarly, IL-6 and MCP-1 secretion were reduced by statins, whereas IL-8 secretion was not modified by the treatments. The NO release and NOS3 expression in HUVEC was increased by the statins, however it was not stimulated by ezetimibe. Moreover, the anti-inflammatory statin effects were independent of this pathway due to statin effects were maintained in HUVEC with silenced NOS3. Although the statin effect on ICAM-1 and MCP-1 were attenuated by L-NAME co treatment, the statin effects seem to be independent of NO release. Statins and ezetimibe reduced miR221 in HUVEC. miR-222 expression was reduced only by atorvastatin. miR-1303 was not affected by the treatments. In HC patients, the improvement of the lipid profile simvastatin combined with ezetimibe was more efficient than both monotherapies. Similarly, the association therapy was better in reducing the mRNA expression in PBMC and plasma concentration of IL-1β, MCP-1, IL-8 and TNFα. ICAM1 expression was reduced only at transcriptional level, whereas mRNA but not protein expression of TNFα was also reduced by the simvastatin monotherapy. There was no modulation mRNA or protein expression of other studied markers in the in vivo model. Additionally, the anti-inflammatory effects observed in the HC were independent of PCRus or NO modulation, which were not altered by the hypolipemiant treatments. In this study, the proposed plitropic effects of statins were confirmed in monocytes and endothelial cells in vitro and in HC patients. Moreover, although it was less potent than statins, an anti-inflammatory effect was also observed for the inhibition of cholesterol absorption. An additional reduction of the cholesterol caused by combined hypolipemiant therapies gives a greater cardiovascular beneffict in hypercholesterolemic patients.
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Avaliação do efeito do extrato aquoso e da fração fenólica livre do Alecrim (Rosmarinus officinalis L.) sobre o estado antioxidante e o perfil lipídico em ratos com hipercolesterolemia induzida pela dieta / Evaluation of the effect of aqueous extract and free phenolic fraction from Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) on antioxidant status and lipid profile in rats with hypercholesterolemia induced by dietAfonso, Milessa da Silva 07 July 2010 (has links)
A hipercolesterolemia é considerada um importante fator de risco para as doenças cardiovasculares, já que a hiperlipidemia associada ao estresse oxidativo é um dos fatores para estabelecimento destas doenças. Neste contexto, antioxidantes presentes em alimentos como vitaminas, compostos fenólicos, entre outros têm recebido crescente atenção devido sua função quimiopreventiva contra danos oxidativos. O alecrim (Rosmarinus officinalis L.) é um membro da família Labiatae, cujas propriedades antioxidantes têm sido atribuídas a uma variedade de compostos fenólicos capazes de finalizar as reações de radicais livres e varrer as espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade antioxidante in vitro dos extratos e frações de ácidos fenólicos obtidos das folhas de alecrim e seu efeito sobre ratos com hipercolesterolemia induzida pela dieta suplementada com 0,50% de colesterol e 0,25% de ácido cólico. Os resultados mostraram que tanto os extratos quanto as frações apresentaram altos teores de compostos fenólicos totais e expressiva atividade antioxidante in vitro nos métodos de cooxidação de substratos β-caroteno/ácido linoleico e na varredura do radical DPPH. No ensaio in vivo, observou-se aumento significativo (p≤0,05) de colesterol total e de LDL colesterol nos animais que consumiram a dieta hipercolesterolêmica. Os compostos fenólicos presentes tanto no extrato aquoso quanto na fração não esterificada do alecrim foram capazes de atuar sobre a atividade das enzimas antioxidantes endógenas CAT, GPx e SOD, confirmando a ação dos compostos antioxidantes presentes nesta especiaria sobre parâmetros do estresse oxidativo. O extrato aquoso na concentração 70 mg/Kg reduziu os valores de colesterol total (39,8%) e LDL-c (45,6%) e melhorou o estado antioxidante dos animais, uma vez que aumentou a atividade da GPx no tecido cardíaco (43,2%) e reduziu a formação de SRATB (32,3%) no soro dos animais. Não foi observado efeito dose resposta no lipidograma destes animais, sugerindo um limiar de atuação do extrato aquoso. Em um contexto geral, o extrato aquoso e a fração não esterificada do alecrim apresentaram capacidade antioxidante in vitro significativa e, nas condições do estudo, exerceram um papel importante sobre o estresse oxidativo presente na hipercolesterolemia experimental, uma vez que os resultados obtidos para o extrato aquoso administrado na concentração de 70 mg/Kg sugerem um papel importante dos compostos fenólicos presentes neste extrato sobre o metabolismo de colesterol. / Hypercholesterolemia is considered an important risk factor for cardiovascular diseases, since hyperlipidemia associated to oxidative stress is one of the risk factors for these diseases. In this context, antioxidants derived from foods such as vitamins, phenolic compounds and others have been receiving increased attention due to their chemopreventive function against oxidative damages. Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) belongs to the Labiatae family, whose antioxidant properties have been attributed to a variety of phenolic compounds capable of reacting with free radicals and quenching reactive oxygen species. The aim of this work was to evaluate the in vitro antioxidant capacity of extracts and phenolic acids fractions obtained from rosemary leaves and their effect on rats fed with 0.50% cholesterol and 0.25% cholic acid enriched diet. The results showed that extracts and fractions had high levels of total phenolic compounds and expressive antioxidant activity in vitro in both methods β-caroteno/ linoleic acid cooxidation and in the DPPH radical scavenge. Analysis in vivo showed a significant increase (p≤0.05) in total cholesterol and LDL cholesterol in hypercholesterolemic animals. Phenolic compounds present in rosemary aqueous extract and non-esterified fraction were capable to act on the activity of CAT, GPx and SOD, confirming the action of antioxidant compounds present in this spice on parameters of oxidative stress. Aqueous extract in concentration of 70 mg/Kg had reduced total cholesterol (39.8%) and LDL-c (45.6%) values and improved the animals\' antioxidant status, once it increased heart GPx activity (43.2%) and decreased SRATB production (32.3%) in the serum of this group. There was no dose response effect on serum lipids of these animals, suggesting a threshold of the aqueous extract activity. In a general context, the aqueous extract and non-esterified fraction of rosemary presented significant antioxidant capacity in vitro and in the conditions of the study, played an important role on the oxidative stress in experimental hypercholesterolemia, and the results obtained for the aqueous extract administered in the concentration of 70 mg/kg suggests an important role of phenolic compounds present in this extract on cholesterol metabolism.
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Avaliação dos efeitos do extrato hidroalcoólico das folhas de erva-de-passarinho (Tripodanthus acutifolius) em ratos wistar hipercolesterolêmicosCoelho, Ritiéle Pinto 31 March 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-03-31 / As doenças cardiovasculares (DCV) representam um problema de saúde pública, e as dislipidemias constituem importantes fatores de risco para seu desencadeamento. A alteração de lipídeos circulantes constitui o maior fator de impacto no desenvolvimento da doença aterosclerótica. Segundo pesquisas fitoquímicas, sabe-se que a planta nativa erva-de-passarinho (EP) da espécie Tripodanthus acutifolius (TA) possui atividade antioxidante promissora, sendo utilizada em alguns estudos como hipoglicemiante, antibacteriano, antiinflamatório e diurético. Estudos evidenciam que o estresse oxidativo (EO) está diretamente relacionado com a dislipidemia, ocupando um local de destaque no processo inflamatório e na progressão da aterosclerose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do extrato hidroalcoólico das folhas de Tripodanthus acutifolius em ratos Wistar hipercolesterolêmicos. Os animais foram divididos em 5 grupos: CN (Controle Normocalórico); CH (Controle Hipercalórico); Suspensão oral de Sinvastatina 10 mg/Kg (SIM 10 mg/Kg); Extrato de TA 50 mg/Kg (TA 50 mg/Kg) e Extrato TA 100 mg/Kg (TA 100 mg/Kg). Somente o CN recebeu apenas ração, os demais grupos receberam uma dieta hipercolesterolêmica por 30 dias, após a confirmação da hipercolesterolemia, as formulações foram administradas por gavage uma vez ao dia. Após este período, os ratos foram eutanasiados e o sangue venoso e órgãos coletados para análises posteriores. Foi realizada a análise fitoquímica do pó liofilizado das folhas de TA através da HPLC-DAD. O composto majoritário encontrado nas folhas de TA foi a isoquercitrina, seguido pela catequina e a luteolina. Foram realizados ensaios in vitro para determinação da atividade antioxidante. Os resultados encontrados neste trabalho indicam que o extrato de TA (0,5 mg/mL) obteve uma porcentagem de inibição de 95,3 % frente ao DPPH e 92,40 % ao radical ABTS. A quantidade de polifenóis totais mostrou comportamento dose-dependente. Na concentração de 1,0 mg/mL a concentração de fenólicos totais foi de 45,80 mg de ácido gálico/mL. Nos ensaios realizados vii
in vivo os resultados demonstram que todos os grupos suplementados com TA, mostraram uma redução significativa (p <0.05) na contagem total de plaquetas em relação aos grupos controle. Além disso, os grupos CH e SIM apresentaram elevada contagem de monócitos quando comparados aos grupos suplementados com TA. Na suplementação com TA observou-se uma redução significativa (p <0.05) nos níveis de colesterol total em todos os grupos suplementados em relação ao CH, apresentando níveis menores que o próprio grupo CN. Também observou-se uma redução significativa (p <0.05) nos níveis de triglicerídeos, colesterol-LDL, em todos os grupos tratados, assim como o aumento dos níveis do colesterol-HDL, em comparação com o grupo CH. No tratamento com TA observou-se uma redução significativa (p <0.05) nos marcadores de função hepática, renal e cardíaca. Durante a análise dos marcadores inflamatórios, notou-se um aumento significativo (p <0.05) de Adiponectina nos grupos suplementados com TA e uma redução nos níveis de PCRus em relação ao grupo CH. Os grupos que receberam TA apresentaram uma redução significativa (p <0.05) em relação ao CH na peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e frequência de micronúcleos induzidos pela hipercolesterolemia. Os grupos suplementados com TA demonstraram também aumento significativo (p <0.05) na atividade das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx. Observou-se ainda aumento dos níveis de Polifenóis, Vit C e GSH. Na análise histológica, o tratamento foi capaz de diminuir o espassamento da aorta, mostrando um efeito protetor contra a aterosclerose. Assim, pode-se sugerir que extrato de TA é promissor no tratamento da dislipidemia. / Cardiovascular diseases (CVD) represent a public health problem, and dyslipidemias are important risk factors for their onset. Changes in the levels of circulating lipids constitute the major impact factor in the development of atherosclerotic disease. According to phytochemical research, it is known that Tripodanthus acutifolius (TA) shows promising antioxidant activity, and has been applied as a hypoglycemic, antibacterial, anti-inflammatory and diuretic compound. Studies indicate that oxidative stress (OE) is directly related to dyslipidemia, playing a prominent role in inflammatory processes and in the progression of atherosclerosis. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effects of hydroalcoholic Tripodanthus acutifolius leaf extracts on hypercholesterolemic Wistar rats. The animals were divided into 5 groups: NC (Normocaloric Control); HC (Hypercaloric Control); Oral Simvastatin Suspension 10 mg/kg (SIM 10 mg/kg); TA Extract 50 mg/kg (TA 50 mg/kg) and TA Extract 100 mg/kg (TA 100 mg/kg). The NC group was the only one to receive only feed, while the others received a hypercholesterolemic diet for 30 days. After hypercholesterolemia confirmation, the formulations were administered by gavage once a day. Rats were then euthanized and venous blood and organs were collected for further analyses. The phytochemical analysis of the lyophilized TA powder leaves was performed by HPLC-DAD. The major compound found in the TA leaves was isoquercitrin, followed by catechin and luteolin. In vitro assays were performed to determine antioxidant activity. The TA extract (0.5 mg/mL) resulted in 95.3% DPPH inhibition and 92.40% ABTS inhibition. Total polyphenols showed a dose-dependent behavior. At 1.0 mg/mL, total phenolic concentrations showed 45.80 mg gallic acid mL-1. In vivo assays demonstrated that all TA-supplemented groups showed a significant (p <0.05) decrease in total platelet counts relative to the control groups. In addition, the HC and SIM groups showed high monocyte counts when compared to the TA-supplemented groups. A significant (p <0.05) decrease in total
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cholesterol levels was observed in all TA-supplemented groups compared to HC, with lower levels than even the NC group. A significant (p <0.05) decrease in triglycerides and LDL-cholesterol levels in all TA-treated groups was also observed, as well as increases in HDL cholesterol levels compared to the HC group. Significant decreases (p <0.05) in liver, renal and cardiac function markers were observed after TA treatment. The analysis of inflammatory markers revealed a significant increase (p <0.05) in adiponectin and decrease in PCRus levels in the TA-supplemented groups in relation to the HC group. The TA-supplemented groups also showed a significant decrease (p <0.05) in relation to HC in lipid peroxidation, protein carbonylation and micronucleus frequency induced by hypercholesterolemia, as well as a significant increase (p <0.05) in the activity of the antioxidant enzymes CAT, SOD and GPx and an increase in Polyphenols, Vit C and GSH. The histological analysis demonstrated that the treatment was able to reduce aortic spasm, exhibiting a protective effect against atherosclerosis. Thus, it may be suggested that TA extract is promising in the treatment of dyslipidemia.
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Biodisponibilidade de peptídeos do feijão caupi (Vigna unguiculata L.Walp) e o metabolismo do colesterol / Bioavailability of cowpea peptides (Vigna unguiculata L. Walp) and the cholesterol metabolismSalvador, Bianka Caliman 19 April 2017 (has links)
Introdução: Doenças cardiovasculares constituem importante causa de morte em todo mundo e a hipercolesterolemia está diretamente relacionada a elas. A dieta desempenha papel importante neste processo e alguns alimentos como o feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp), especialmente sua proteína, tem sido apontado com potencial capacidade de redução do colesterol plasmático. Os efeitos hipocolesterolêmicos já observados indicaram o uso da proteína do feijão caupi, ou dos seus peptídeos, como ingrediente funcional de alimentos para a promoção da saúde e a redução do risco de doenças. Entretanto, as consequências da digestão gastrointestinal na absorção destes peptídeos são claramente complexas tornando essenciais estudos in vitro e in vivo para avaliar a sua bioacessibilidade e sua resistência à degradação gastrointestinal, além da disponibilidade e real eficácia destes peptídeos. Objetivo: Analisar a biodisponibilidade de peptídeos e avaliar parâmetros ligados ao metabolismo do colesterol em modelos animais após ingestão de isolado proteico de feijão caupi. Métodos: A farinha de feijão caupi foi desengordurada e sua proteína isolada. O isolado proteico foi submetido a métodos de hidrólise in vitro, para verificação das frações peptídicas formadas e inferência sobre a capacidade de ligação à albumina. Dois experimentos in vivo foram conduzidos. No primeiro, o isolado proteico do feijão caupi foi administrado a ratos e a concentração dos peptídeos monitorada no sangue, por 2 horas. O experimento in vivo 2 consistiu na alimentação de hamsters com dietas normo (N) - e hipercolesterolêmicas por 21 dias, contendo a proteína do feijão caupi como única proteína da ração (I), comparada ao controle de caseína (H). Neste experimento foram analisados no plasma: colesterol total (CT) e frações (LDLc, VLDLc e HDLc), triglicerídeos (TG) e peptídeos; nas fezes: colesterol total (CF) e ácidos biliares (AB); no fígado: colesterol (CH) e lipídeos totais (LH), HMGCR (atividade enzimática e expressão) e expressão de SREBP2, LDLR, ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, LXRa e AMPK. Resultados: Os peptídeos identificados a partir da hidrólise proteica do feijão caupi, ou a partir do plasma dos animais estudados não evidenciaram similaridades entre os experimentos ou corresponderam a sequências previamente identificadas para o feijão caupi a partir de banco de dados. CT, VLDLc, HDLc, TG, CH dos hamsters foram maiores nos grupos H e I quando comparado ao N; LDLc foi maior para I comparado aos demais; LH foi maior em H comparado a N, sendo que I não diferiu dos demais; CF foi maior para I comparado a N, sendo que H não diferiu dos demais. A expressão de ABCA1 foi maior para I em relação aos demais; LXRa foi maior para I em relação a H, mas N não diferiu dos demais; SREBP2 foi menor em H em comparação aos demais; HMGCR foi mais expressa em N em comparação aos demais, ao passo que a atividade desta enzima foi maior em I quando comparado a N, sendo que H não diferiu dos demais. Não houve diferença entre os grupos quanto a AB ou expressão de ABCG8 ou AMPK. Não foram obtidos resultados de expressão para LDLR, ABCG1 e ABCG5. Conclusão: Apesar de pesquisas anteriores a este trabalho terem evidenciado a capacidade do isolado proteico do feijão caupi em inibir a atividade da HMGCR, inibir a solubilização micelar ou melhorar o perfil de lipídeos plasmáticos, no trabalho atual esta matéria prima não mostrou atuação positiva quanto ao metabolismo do colesterol de hamsters nas condições experimentais utilizadas. Os fragmentos indicados como peptídeos obtidos a partir da hidrólise proteica do feijão caupi, ou do plasma dos animais estudados não corresponderam a peptídeos com comprovada, ou até mesmo, com indicação de bioatividade / Introduction: Cardiovascular diseases are important cause of death worldwide and hypercholesterolemia is directly related to them. Diet plays an important role in this process and some foods such as cowpea (Vigna unguiculata L. Walp), especially its protein, have been shown to have a potential for reducing plasma cholesterol. The hypocholesterolemic effects already observed indicated the use of cowpea protein, or its peptides, as a functional food ingredient for health promotion and reduction of disease risk. However, the consequences of gastrointestinal digestion on the absorption of these peptides are clearly complex, making in vitro and in vivo studies essential to assess their bioaccessibility and resistance to gastrointestinal degradation, as well as the availability and actual efficacy of these peptides. Objectives: To analyze the bioavailability of peptides and evaluate parameters related to cholesterol metabolism in animal models after ingestion of protein isolate of cowpea. Methods: Cowpea flour was defatted and its protein isolated. The protein isolate was subjected to in vitro hydrolysis methods to verify the formed peptide fractions and inference about albumin binding ability. Two in vivo experiments were conducted. In the first, the cowpea protein isolate was administered to rats and the concentration of the peptides monitored in the blood for 2 hours. The in vivo experiment 2 consisted of feeding hamsters with normal (N) - and hypercholesterolemic diets for 21 days, containing the cowpea protein as the sole dietary protein (I), compared to casein control (H). In this experiment were analyzed in the plasma: total cholesterol (TC) and fractions (LDLc, VLDLc and HDLc), triglycerides (TG) and peptides; In feces: total cholesterol (CF) and bile acids (AB); In the liver: cholesterol (CH) and total lipids (LH), HMGCR (enzymatic activity and expression) and expression of SREBP2, LDLR, ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, LXRa and AMPK. XX. Results: The peptides identified from the protein hydrolysis of cowpea or from the plasma of the animals studied did not show similarities among the experiments or correspond to sequences previously identified for the cowpea from the database. CT, VLDLc, HDLc, TG, CH of hamsters were higher in groups H and I when compared to N; LDLc was higher for I compared to the others; LH was higher in H compared to N, and I did not differ from the others; CF was higher for I compared to N, and H did not differ from the others. The expression of ABCA1 was higher for I than the others; LXRa was higher for I than H, but N did not differ from the others; SREBP2 was lower in H compared to the others; HMGCR was more expressed in N compared to the others, whereas the activity of this enzyme was higher in I when compared to N, and H did not differ from the others. There was no difference between groups regarding AB or expression of ABCG8 or AMPK. No expression results were obtained for LDLR, ABCG1 and ABCG5. Conclusion: Although previous research to this work evidenced the ability of the cowpea protein isolate to inhibit HMGCR activity, inhibit micellar solubilization or improve the plasma lipid profile, in the current work this raw material did not show a positive cholesterol metabolism of hamsters under the experimental conditions used. The fragments indicated as peptides obtained from the protein hydrolysis of cowpea beans, or from the plasma of the animals studied did not correspond to peptides with proven, or even, with indication of bioactivity
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Identificação de mutações no gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR) em pacientes com hipercolesterolemia familiar / Identification of mutation in the low density lipoprotein receptor gene (LDLR) in familial hypercholesterolemia patientsVasconcelos, Karina Alves da Silva 15 January 2015 (has links)
Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.
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A hipercolesterolemia abole o efeito cardioprotetor do pré e pós-condicionamento isquêmico em um modelo experimental de isquemia e reperfusão em ratos / Hypercholesterolemia abolishes the cardioprotective effect of ischemic pre and postconditioning in an experimental model of ischemia and reperfusion in ratsLandim, Maurício Batista Paes 10 November 2009 (has links)
O pré e pós-condicionamento isquêmico são fenômenos cardioprotetores que limitam o dano tecidual no infarto agudo do miocárdio. Seus efeitos benéficos ocorrem através da ativação de complexas vias sinalizadoras intracelulares, que têm a inibição da formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial como efetor final comum. A presença de fatores de risco, como a hipercolesterolemia, pode interferir nos resultados finais quando se lança mão de tais medidas cardioprotetoras. Entretanto, há na literatura achados contraditórios que não mostram interferência do colesterol elevado sobre a cardioproteção do pré-condicionamento isquêmico. No pós-condicionamento isquêmico, mais recentemente descrito, as primeiras evidências também mostram resultados conflitantes, que carecem de mais estudos. A baixa disponibilidade do óxido nítrico presente na hipercolesterolemia está associada a níveis elevados de dimetilarginina assimétrica, um inibidor da óxido nítrico sintetase, e pode ser o responsável por abolir os benefícios de ambas as medidas cardioprotetoras aqui estudadas. Procuramos, neste trabalho, avaliar a influência da hipercolesterolemia sobre o pré e pós-condicionamento isquêmico, e correlacionar os níveis de colesterol total e dimetilarginina assimétrica com o tamanho do infarto do miocárdio experimental em ratos anestesiados. Nós encontramos um maior tamanho do infarto nos animais hipercolesterolêmicos apesar do uso destas medidas cardioprotetoras. / Ischemic pre and postconditioning are cardioprotective phenomena that limit heart tissue damage in acute myocardial infarction. Its beneficial effects occur through the activation of complex intracellular signaling pathways, which have the inhibition of the formation of the mitochondria permeability transition pore as common final effector. The presence of risk factors such as hypercholesterolemia may interfere with final results when it makes use of such cardioprotective measures. However, there are contradictory findings in the literature which show no interference of high cholesterol on cardioprotection of ischemic preconditioning. In ischemic postconditioning, more recently described, the initial evidences also shows conflicting results, which require further studies. The low availability of nitric oxide present in hypercholesterolemia is associated with high levels of asymmetric dimethylarginine, an inhibitor of nitric oxide synthase, and may be responsible for removing the benefits of both cardioprotective measures studied here. The objective of our study was to assess the effect of hypercholesterolemia on ischemic pre and postconditioning and correlate the levels of total cholesterol and asymmetric dimethylarginine with the size of experimental myocardial infarction in anesthetized rats. We found a larger myocardial infarction in the hypercholesterolemic animals despite the use of these cardioprotective measures.
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Uso de carmustina associada a nanoemulsões ricas em colesterol (LDE) para tratamento da aterosclerose induzida em coelhos / Use of carmustine associated with cholesterol-rich nanoemulsions (LDE) to treatment of atherosclerosis induced in rabbitsDaminelli, Elaine Nunes 10 February 2015 (has links)
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica e proliferativa que tem início quando fatores de risco alteram o endotélio vascular. As partículas da nanoemulsão lipídica LDE concentram-se em sítios inflamatórios e de intensa proliferação celular, como acontece nas lesões ateroscleróticas. A carmustina, um fármaco antiproliferativo usado na quimioterapia do câncer, não foi ainda explorada no tratamento da aterosclerose. Em trabalhos anteriores, mostrou-se que a associação com a LDE reduz drasticamente a toxicidade da carmustina, o que já foi demonstrado em pacientes com câncer avançado. O propósito do estudo é avaliar se a carmustina associada à LDE pode promover o efeito antiproliferativo nas lesões ateroscleróticas induzidas em coelhos. No presente trabalho, dezoito coelhos machos da raça New Zealand, receberam dieta rica em colesterol a 1% durante 8 semanas. Depois de 4 semanas foram divididos em dois grupos: grupo controle, que recebeu injeção endovenosa contendo apenas solução salina e grupo tratado, que recebeu LDE-carmustina na dose de 4mg/Kg semanalmente durante 4 semanas. Foram avaliados perfil hematológico, lipídico, bioquímico, ponderal e o consumo de ração. Após a eutanásia, foram medidas as lesões ateroscleróticas macroscópicas. Em seguida, o arco aórtico foi analisado por morfometria e por imunohistoquímica. Observou-se que não houve diferença no perfil ponderal e no consumo de ração entre os grupos de estudo. Não houve toxicidade hematológica, hepática e renal no grupo tratado. No perfil lipídico, ao final do estudo, as concentrações de colesterol total, não HDL-C e triglicerídeos aumentaram em todos os grupos. Portanto, o tratamento com LDE-carmustina inibiu as lesões ateroscleróticas em aproximadamente 90%, comparado ao grupo controle. LDE-carmustina também reduziu a presença de macrófagos, de células de músculo liso e das células reguladoras de linfócitos T na íntima arterial, bem como a expressão protéica de MMP9, das citocinas inflamatórias e dos receptores de lipoproteínas. O tratamento da aterosclerose induzida em coelho com LDE-carmustina resultou em marcante redução das lesões na aorta, da proliferação e invasão da íntima por macrófagos e células musculares lisas, características da doença, além dos fatores inflamatórios. Tendo em vista que, associada à LDE, a carmustina tem baixa toxicidade, a nova preparação LDE-carmustina tem grande potencial para a terapêutica das doenças cardiovasculares de natureza aterosclerótica / Atherosclerosis is a chronic inflammatory and proliferative disease that starts when risk factors alter vascular endothelium. The particles of the lipid nanoemulsion LDE concentrate on inflammatory sites and with intense cell proliferation, as occurs in atherosclerotic lesions. The carmustine, an antiproliferative drug used in cancer chemotherapy has not yet been explored for the treatment of atherosclerosis. In previous work, we showed that the association with LDE drastically reduces toxicity of carmustine, which has been demonstrated in patients with advanced cancer. The purpose of this study is to evaluate whether carmustine associated with LDE can promote antiproliferative effect on atherosclerotic lesions induced in rabbits. In this study, eighteen male New Zealand rabbits were given a diet rich in cholesterol 1% for 8 weeks. After 4 weeks they were divided into two groups: control group, which received an intravenous injection containing only saline and treated group receiving LDE-carmustine dose of 4 mg/kg weekly for 4 weeks. Hematology, lipid, biochemical, weight profile and feed intake were evaluated. After euthanasia, macroscopic atherosclerotic lesions were measured. Then, the aortic arch was analyzed by morphology and by immunohistochemistry. It was observed that there was no difference in weight and profile in feed intake between the study groups. There were not hematological, hepatic and renal toxicity in the treated group. Lipid profile at the end of the study, the concentrations of total cholesterol, non-HDL-C and triglycerides increased in all groups. Therefore, treatment with LDE-carmustine inhibit atherosclerotic lesions in approximately 90%, compared to the control group. LDE-carmustine also reduced the presence of macrophages, smooth muscle cells and regulatory T cells in the arterial intima as well as the protein expression of MMP9, inflammatory cytokines and lipoprotein receptors. Treatment of rabbits with induced atherosclerosis LDE-carmustine resulted in marked reduction of lesions in the aorta, proliferation and invasion by macrophages and intimal smooth muscle cells, disease characteristics, in addition to inflammatory factors. Given that, associated with LDE, carmustine has low toxicity, the new formulation LDE-carmustine has great potential for the therapy of atherosclerotic cardiovascular disease nature
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Efeitos da associação de quimioterápicos na regressão de placa aterosclerótica e no perfil de marcadores inflamatórios em coelhos / Effects of chemotherapy association on atherosclerotic plaque regression and inflammatory markers profile in rabbitsGomes, Fernando Luiz Torres 21 October 2015 (has links)
A aterosclerose é considerada, hoje, doença inflamatória e com intensa proliferação celular, daí o racional de se usar medicamentos antiproliferativos e com ação anti-inflamatória como o paclitaxel (PTX) e o metotrexato (MTX) no tratamento dessa condição. A nanoemulsão lipídica (LDE), de composição semelhante à da lipoproteína de baixa densidade (LDL), se liga a receptores de LDL após sua injeção endovenosa na corrente sanguínea. Como tais receptores estão superexpressos em células com altas taxas de proliferação, como ocorre no câncer e na aterosclerose, a LDE pode ser usada como veículo para direcionar agentes antiproliferativos a essas células, aumentando a sua eficácia e diminuindo a toxicidade. O paclitaxel é um quimioterápico com ação antiproliferativa usado em vários tipos de câncer e recobrindo stents farmacológicos, trabalhos anteriores, usando coelhos submetidos a uma dieta aterogênica, nos animais tratados com LDE-PTX houve redução de 60% da área lesionada. O metrotexato, além de ser usado em vários esquemas quimioterápicos, possui, também, ação anti-inflamatória, sendo usado em doenças inflamatórias crônicas, como a artrite reumatoide. Em outro estudo envolvendo, coelhos hipercolesterolêmicos, o uso de MTX comercial por 4 semanas demonstrou uma redução de 75% na área de placa aterosclerótica. Esse estudo tem por objetivo avaliar macroscopicamente a eficácia das terapias quimioterápicas combinada, composta de PTX-LDE com MTX-LDE, e monoterapia, apenas com PTX-LDE, na regressão da aterosclerose experimental. No presente trabalho, vinte e oito coelhos machos da raça New Zealand receberam dieta rica em colesterol a 1% durante 8 semanas. Depois desse período, foram divididos em quatro grupos: grupo CONTROLE, que foi sacrificado e as aortas fixadas para análise posterior, grupo DIETA, que apenas teve a ração enriquecida com colesterol a 1% suspensa, PTX, que recebeu tratamento com injeções endovenosas semanais de LDE-paclitaxel na dose de 4 mg/kg por 8 semanas, e PTX+MTX, que recebeu LDE-paclitaxel e LDE-metotrexato na dose de 4 mg/kg/semana por 8 semanas. Foram avaliados perfil hematológico, lipídico, bioquímico, ponderal e o consumo de ração. Após a eutanásia, foram medidas as lesões ateroscleróticas macroscópicas nas aortas dos coelhos. Em seguida, o arco aórtico foi analisado por morfometria e por imuno-histoquímica. Os marcadores inflamatórios foram analisados no plasma, por ELISA e por meio de expressão gênica por Qrt-pcr. Observou-se que não houve diferença no perfil ponderal e no consumo de ração entre os grupos de estudo. Não houve toxicidade hematológica, hepática e renal relacionada ao tratamento. No perfil lipídico, ao final do estudo, as concentrações de colesterol total, não HDL-C e triglicerídeos aumentaram significativamente em todos os grupos. Houve uma marcante regressão na área de placa aterosclerótica nos coelhos tratados com LDE-paclitaxel, da ordem de 64% e mais marcante no grupo LDE-metotrexato de 71%, quando comparados ao grupo CONTROLE. Na comparação com o grupo DIETA, houve, também, regressão, de 49% nos coelhos do grupo PTX e de 59% no grupo PTX+MTX. O tratamento quimioterápico também mostrou ação antiaterosclerótica nos outros parâmetros avaliados, destacando a intensa redução na relação íntima-média das aortas, na expressão proteica de MMP-9 e da redução na expressão gênica de TNF-? em relação ao grupo DIETA. Portanto, o tratamento quimioterápico com PTX e MTX associado à LDE possui potencial para uso clínico em pacientes com doença aterosclerótica, sendo muito eficaz e com boa tolerabilidade / Atherosclerosis is nowadays considered as an inflammatory disease with intense cell proliferation, hence the rationale of using antiproliferative drugs with an anti-inflammatory action such as paclitaxel (PTX) and methotrexate (MTX) in the treatment of this condition. The lipid nanoemulsion (LDE), with a similar composition to low density lipoprotein (LDL) binds to LDL receptors after their intravenous injection into the bloodstream. Since such receptors are overexpressed in cells with high proliferation rates, such as occurs in cancer and atherosclerosis, LDE can be used as a vehicle to direct antiproliferative agents to these cells, increasing their efficacy and reducing toxicity. Paclitaxel is a chemotherapeutic drug with an anti-proliferative action used in various types of cancer and drug-eluting stents. In previous studies using rabbits subjected to an atherogenic diet, animals treated with LDE-PTX had a 60% reduction in the injured area. Methotrexate in addition to being used in various chemotherapy regimens also has an anti-inflammatory action and is used for chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis; another study involving hypercholesterolemic rabbits using commercial MTX for 4 weeks showed a 75% reduction of the atherosclerotic plaque area. This study aims to evaluate the effectiveness of combined chemotherapy treatments, composed of PTX-LDE with MTX-LDE, and PTX-LDE in monotherapy, on the regression of experimental atherosclerosis. In this study, twenty eight male New Zealand breed rabbits received a diet enriched with 1% cholesterol for 8 weeks. After that time, they were divided into four groups: the CONTROL group, which was sacrificed and the aortas kept for later analysis, the DIET group, which only had the diet supplemented with 1% cholesterol suspended; the PTX group which received treatment with weekly intravenous injections of LDE paclitaxel, at a dose of 4 mg/kg for 8 weeks and the PTX+MTX group which received PTX - LDE + MTX-LDE at a dose of 4 mg/kg per week for 8 weeks. The hematological, lipid, biochemical, weight and food intake profiles were evaluated. After euthanasia, macroscopic atherosclerotic lesions in the aortas of the rabbits were measured. Then, the aortic arch was analyzed by morphology and immunohistochemistry. The inflammatory markers were analyzed in the plasma by ELISA and gene expression by qRT-PCR. There was no difference in weight profile and feed intake among the study groups. There was no hematological, hepatic or renal toxicity related to treatment. The lipid profiles of all the groups at the end of the study showed significantly increased concentrations of total cholesterol, non-HDL-C and triglyceride levels. There was a marked regression of 64% in the atherosclerotic plaque area, in the LDE-paclitaxel treated rabbits, and an even more striking 71% in the LDE-methotraxate group compared to the CONTROL group. There was also regression when compared to the DIET group, 49% in rabbits from the PTX group and 59% in the PTX+MTX group. The chemotherapy also showed an anti-atherosclerotic action in the other evaluated parameters, especially notable were the intense reduction in the intima-media ratio of the aortas in protein expression of MMP-9 and the reduction in gene expression of TNF-alpha compared to the DIET group. Therefore, chemotherapy with PTX and MTX associated with LDE, has potential for clinical use in patients with atherosclerotic disease, as it is very effective and well tolerated
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