En raison de leur diffusion sauvage sur le e-commerce, leur soi-disant sécurité d’usage et l’alternative légale aux stupéfiants habituels qu’ils constituent, les nouvelles substances psychoactives (NPS) sont un phénomène mondial émergeant. Au-delà de différents défis dans nos sociétés (législation, prévention,... ), la capacité d'identifier les NPS dans des échantillons biologiques présente de nombreux challenges analytiques : ces nouvelles substances ne sont pas référencées dans les bibliothèques habituelles de spectrométrie de masse commerciales, leur métabolisme est inconnu (avec parfois des métabolites actifs), les doses actives sont parfois très faibles et par conséquent, les concentrations dans le sang ou l'urine sont également faibles. Dans ce contexte, notre laboratoire effectue régulièrement des analyses toxicologiques dans un contexte clinique, et pour les forces de l’ordre, dans des échantillons biologiques à l'aide de deux principaux types d’analyseurs : la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (CL-SM/SM) pour le criblage ciblé et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (CL-SMHR) pour le criblage non ciblé. Cette dernière technique est basée sur la masse exacte (mais également, le profil isotopique et le temps de rétention) des composés de l’échantillon à partir de laquelle la formule chimique est déterminée et recherchée dans une base de données spectrales en utilisant un logiciel dédié. L’objectif de ma thèse est de caractériser des NPS et leurs métabolites (afin d’alimenter cette base de données) en utilisant une stratégie combinant des approches in vitro, in silico et in vivo. Il s’agit, en particulier, d’augmenter la sensibilité de détection de la prise de NPS en se focalisant sur les métabolites qui sont le plus souvent les produits majeurs d’élimination des NPS.A cet effet, une méthode in vitro destinée à produire les métabolites des NPS et utilisant des microsomes hépatiques humains a été mise en oeuvre. Les métabolites obtenus, comparés aux prédictions in silico, ont été enregistrés dans la base de données. Cette approche a été confrontée à l’analyses de comprimés et d’autres produits non biologiques contenant des NPS, mais également, à des données in vivo d’exposition aux NPS : cas d’intoxications, études expérimentales et études épidémiologiques prospectives et rétrospectives dans des populations ciblées, ou non…Au total, ce travail basé sur cette stratégie in vitro, in silico, in vivo m’a permis d’enrichir notre base de données de spectres de masse haute résolution (SMHR) pour le criblage non ciblé et également notre base de données de criblage ciblé (SM/SM). Notre méthode en haute résolution, qui s’est enrichie au cours de ces 3 années de thèse de 83 nouveaux NPS et 281 métabolites, constitue aujourd’hui un outil analytique efficient pour la détection d’une exposition aux NPS. / Owing to wild e-commerce diffusion, alleging safety and legal alternative to usual drugs of abuse arguments, the new psychoactive substances (NPS) are emerging phenomenon in the world. In our societies, through various consecutive challenges (legislation, prevention, …), the ability to identify NPS in biological samples exhibits numerous analytical pitfalls: new substances which are not referenced in the usual commercial mass spectrometric libraries, unknown metabolism (with sometimes active metabolites), sometimes very low active dosages and consecutively low concentrations in blood or urine. In this context, clinical and forensic toxicological analyses in biological samples are routinely performed in our laboratory using two main analytical devices: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for targeted screening and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) for non-targeted screening. This last technique is based on the accurate mass (together with isotopic pattern and retention time) of sample components, from which the chemical formula is calculated and searched against a database of mass spectra using dedicated software. The aim of my thesis is to characterize NPS and metabolites (in order to increase the spectral database) using a strategy combining in vitro, in silico, and in vivo approaches. Therefore, the main goal is to increase the detection sensitivity of the NPS use by focusing on the metabolites that are most often the major products of NPS elimination. For this purpose, an in vitro method designed to produce NPS metabolites using human liver microsomes incubations was applied. Obtained metabolites, after confrontation with metabolites in silico predicted, were saved in database. This approach was subsequently confronted with analysis of tablets or other non-biological product containing NPS, but also, with in vivo observed data from NPS exposure: intoxication cases, experimental studies and prospective and retrospective epidemiological studies in targeted population or not … All in all, this work based on this in vitro, in silico and in vivo strategy allowed me to enhance our high resolution spectra database (HRMS) for non-targeted screening and also our spectra database for targeted screening (MS/MS). Today, our HRMS device, with a database that was increased with 83 new NPS and 281 metabolites for the duration of my thesis, is an efficient analytical tool for NPS use detection.

Tuberculosis, the leading cause of death by a single infection disease caused by bacteria, requires long treatments and the bacteria are prone to develop drug resistance. Therefore, new efficient treatment regiments needs developing, which requires new tools for drug development. A major reason for discontinuance of a drug under development is undesired pharmacokinetic properties. Therefore, it is important to have early information of this, preferably the first time the drug is tested in animals. The first in vivo pharmacokinetic experiment is often done in mice and the only information present at this stage are often in vitro values and physicochemical properties. Physiological-based pharmacokinetic modelling can be used to extrapolate from in vitro to in vivo values. From this, the first in vivo pharmacokinetic experiment can be designed, often with the goal of reducing the amount of mice. This goal is one of the three R.s and it is called Reduction. To explore the Reduction of an experiment population pharmacokinetic modelling can be utilized via exploration of the imprecision, bias and probability of an informative experiment to evaluate if a design meets the goal of Reduction. In this report a recommendation of the first in vivo pharmacokinetic experiment is presented. This is based on in vitro values and physicochemical properties that are common in anti-tuberculosis drugs. If the probability of an informative experiment is critical, a terminal sampling of 40 mice is recommended. If imprecision and bias are necessary, zipper sampling of 10 mice is recommended.

Cardiovascular diseases are the leading causes of death worldwide and improved diagnostic methods are needed for early intervention and to select the most suitable treatment for patients. Currently, carotid artery plaque vulnerability is typically determined by visually assessing ultrasound B-mode images, which is influenced by user-subjectivity. Since plaque vulnerability is correlated to the mechanical properties of the plaque, quantitative techniques are needed to estimate plaque stiffness as a surrogate for plaque vulnerability, which would reduce subjectivity during plaque assessment. The work in this thesis focused on three noninvasive ultrasound-based techniques to quantitatively assess plaque vulnerability and measure arterial stiffness. In Study I, a speckle tracking algorithm was validated in vitro to assess strain in common carotid artery (CCA) phantom plaques and thereafter applied in vivo to carotid atherosclerotic plaques where the strain results were compared to visual assessments by experienced physicians. In Study II, hard and soft CCA phantom plaques were characterized with shear wave elastography (SWE) by using phase and group velocity analysis while being hydrostatically pressurized followed by validating the results with mechanical tensile testing. In Study III, feasibility of assessing the stiffness of simulated plaques and the arterial wall with SWE was demonstrated in an ex vivo setup in small porcine aortas used as a human CCA model. In Study IV, SWE and pulse wave imaging (PWI) were compared when characterizing homogeneous CCA soft phantom plaques. The techniques developed in this thesis have demonstrated potential to characterize carotid artery plaques. The results show that the techniques have the ability to noninvasively evaluate the mechanical properties of carotid artery plaques, provide additional data when visually assessing B-mode images, and potentially provide improved diagnoses for patients suffering from cerebrovascular diseases. / <p>Doctoral thesis in medical technology and medical sciences</p><p>QC 20160921</p>

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes. / Most RNA molecules have to adopt a complex tertiary structure to accomplish their biological functions. However, the important determinants of a polynucleotide chain that are required for its proper folding and its interactions with other elements are essentially unknown. The establishment of structure-function relationships in large RNA molecules goes inevitably through the analysis of each element of their structure separately and in context with other elements. Like a building, an RNA structure is built of repetitive pieces that are glued together in a specific way. These repetitive elements, instead of being bricks, are recurrent motifs. Recurrent RNA motifs are arrangements of nucleotides found in different parts of a tertiary structure and have identical or very similar conformations. Thus, a necessary step toward the understanding of RNA structure and function consists in the systematic identification of recurrent motifs, followed by their comparative analysis and establishment of their sequence consensus. The analysis of all instances of helical packing within the ribosome structure led to the identification of a new structural arrangement, named the along-groove packing motif (AGPM), which is found in 14 places of the ribosome structure as well as between the 23S ribosomal RNA and the transfer RNA molecules bound to the P and E sites. The motif is formed by the packing of two double helices via their minor grooves. The sugar-phosphate backbone of one helix goes along the minor groove of the other helix and vice versa. In each helix, the contact region includes four base pairs. The closest packing occurs in the center where one can often see a GU base pair packed against a WC base pair. While the presence of the central base pairs GU versus WC in the core of the motif enhances its stability, other alternatives are also present among available structures of the motif. A comparative analysis of three different combinatorial gene libraries of AGPM, in which the central base pairs were fully randomized, shows that the structural context influences the scope of nucleotide sequence variability of the central base pairs. The fact that the identity of the central base pairs can vary suggested that there are other determinants responsible of the motif’s integrity. Analysis of all other inter-helix contacts has shown that outside the center of the motif the interactions between backbones are made via three ribose-ribose contacts. Within each of these contacts, the riboses of the nucleotides that are in touch adopt particular positions in order to provide for collision-free interactions between them. We show that the position of these riboses is modulated by the specific base pair conformation in which it belongs. Finally, another recurrent arrangement that occurs within the structure of three cases of AGPM was identified and called the adenosine-wedge. Analysis has shown that the latter motif is itself composed of a smaller arrangement, called the NAG-triangle motif. We show that the adenosine-wedge motif represents a complex RNA arrangement composed of four repetitive elements, AGPM, the hook-turn, the A-minor and the NAG-triangle, which clearly illustrates the hierarchical organisation of the structure that could also occur in other RNA motifs as well. Altogether, my results enrich our general understanding of the role of different types of tertiary interactions in the formation of large RNA molecules.

Le contrôle de la longueur des télomères est une étape critique régissant le potentiel réplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problème de fin de réplication, les chromosomes raccourcissent à chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit dans des séquences particulières appelées télomères. La longueur des télomères est en relation directe avec les capacités prolifératives des cellules et est responsable de la limite de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des cancers, la longueur des télomères va être maintenue par une enzyme spécialisée appelée télomérase. Encore aujourd’hui, comprendre la biogénèse de la télomérase et savoir comment elle est régulée reste un élément clé dans la lutte contre le cancer. Depuis la découverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqués dans sa maturation ont été identifiés. Cependant, comment ces facteurs sont intégrés dans le temps et dans l’espace, afin de produire une forme active de la télomérase, est une question restée sans réponse. Dans ce projet, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiæ comme modèle d’étude des voies de biogénèse et de trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase, en condition endogène. La première étape de mon travail fut d’identifier les facteurs requis pour l’assemblage et la localisation de la télomérase aux télomères en utilisant des techniques d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante ARN de la télomérase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition endogène, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggèrent que ce trafic sert de contrôle qualité puisqu’un défaut d’assemblage de la télomérase conduit à son accumulation cytoplasmique et prévient donc sa localisation aux télomères. De plus, nous avons identifié les voies d’import/export nucléaire de cet ARN. Dans une deuxième approche, nous avons réussi à développer une méthode de détection des particules télomérasiques in vivo en utilisant le système MS2-GFP. Notre iv étude montre que contrairement à ce qui a été précédemment décrit, la télomérase n’est pas associée de façon stable aux télomères au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au moment de la réplication des télomères, la télomérase se regroupe en 1 à 3 foci dont certains colocalisent avec les foci télomériques, suggérant que nous visualisons la télomérase active aux télomères in vivo. La délétion des gènes impliqués dans l’activation et le recrutement de la télomérase aux télomères entraine une forte baisse dans l’accumulation des foci d’ARN au sein de la population cellulaire. Nos résultats montrent donc pour la première fois la localisation endogène de l’ARN TLC1 in situ et in vivo et propose une vue intégrée de la biogenèse et du recrutement de la télomérase aux télomères. / Telomere length control is a critical step that governs the replicative potential of eukaryotic cells. Due to the end replication problem, chromosomes shorten at each round of division. This attrition occurs in specialized sequences at the extremity of chromosomes called telomeres. Telomere size is in direct relationship with proliferative potential and responsible for Hayflick’s division limit. However, in different cell type and in cancers, an end-specialized enzyme called telomerase maintains telomere length. Reactivation of telomerase in somatic cells triggers a pre-tumoral phenotype and more than 90% of cancers highly express this enzyme. Still today, understanding how telomerase is synthesized and reactivated can be a key step for the understanding of cancer arising and progression. Since the discovery of this enzyme in 1985, several factors involved in the regulation of this enzyme have been discovered. However, the spatio-temporal regulation of telomerase biogenesis and regulation has not been determined. We used the yeast S.cerevisiæ to study the biogenesis and recruitment of telomerase to telomeres. The first step in my work was to determine the factors required for the biogenesis and recruitment of telomerase to telomeres using fluorescence in situ hybridization. We have shown that the telomerase RNA component shuttles between the nucleus and the cytoplasm in wild type endogenous conditions. We have shown that this intracellular trafficking is used as a quality control mechanism that prevents the nuclear localization of miss assembled telomerase complexes. Moreover, we have identified the import/export pathways of the telomerase RNA. In a second step, we developed an in vivo localization system to follow the telomerase RNA dynamics. We used the MS2-GFP system to track this RNA in vivo. Our study shows that, contrary to what was previously described, telomerase is not stably associated to telomeres during the cell cycle but freely diffuses in the nucleus of G1 cells. In late S phase, at the moment of telomere replication, telomerase clusters in 1 to 3 big foci vi that colocalizes with telomeres clusters in vivo, suggesting the visualization of active telomerase particles replicating telomeres. Disruption of gene coding for telomerase activators triggers a great reduction of telomerase RNA clusters in a cell population. Altogether, our results shows for the first time the localization of the endogenous form of the telomerase RNA and propose an integrated view of telomerase biogenesis and recruitment to telomeres.

La rigidité artérielle est un critère clé dans l'analyse de plusieurs maladies cardiovasculaires comme l'athérosclérose. Cette maladie est l'une des causes principales de mortalité dans les pays de l'OCDE. L'analyse des propriétés mécaniques des artères in vivo permettrait d'améliorer le diagnostic de ce type de pathologie. L'originalité de ce travail de recherche est de s'intéresser à la problématique de l'identification non invasive des propriétés mécaniques des artères in vivo en utilisant l'IRM. Une nouvelle méthode d'identification adaptée à la résolution spatiale de l'IRM a été développée. Celle-ci se base sur la minimisation d'une fonction coût caractérisant l'écart entre une image expérimentale déformée et une image recalée numériquement. Cette dernière consiste à utiliser une image expérimentale au repos et à recaler celle-ci à l'aide d'un champ de déplacements issu d'un calcul éléments finis.Cette méthodologie a été appliquée pour identifier les propriétés élastiques d'artères carotides communes de plusieurs sujets sains et de patients atteints d'athérosclérose. Ces travaux ont permis de mettre en évidence la rigidification des artères carotides avec l'âge et l'évolution de la rigidité des artères lors de l'évolution du cycle cardiaque, ainsi que les effets de la mesure de la pression sanguine et des propriétés mécaniques du milieu extérieur à l'artère sur les résultats de l'identification.Cette étude offre de grandes promesses quant à la possibilité d'identifier les propriétés non linéaires hétérogènes d'artères sclérosées en utilisant l'IRM. / Arterial stiffness is a key criterion for the analysis of several cardiovascular diseases such as atherosclerosis. This disease is one of the major causes of mortality in OECD countries. The analysis of the in vivo mechanical properties of arteries could improve the diagnosis of this type of pathology. The originality of this research is to contribute to the non-invasive identification of the in vivo mechanical properties of arteries from MRI images.A new identification method adapted to the spatial resolution of MRI has been developed. It is based on the minimisation of a cost function which measures the similarity between an experimental deformed image, and a numerical registered image. This registered image is calculated from the non-deformed experimental image using a displacements field obtained by finite elements analysis.This methodology has been applied to identify the elastic properties of the common carotid arteries of several healthy subjects and of patients with atherosclerosis. This work highlighted the stiffening of carotid arteries with age and the evolution of the stiffness of arteries throughout the cardiac cycle. An extensive parametric study has underlined the effect of the measurement of blood pressure and the influence of the mechanical properties of the surrounding tissue on the results of the identification.Promising perspectives exist for identifying the non-linear and heterogeneous mechanical properties of sclerosed arteries from MRI.

Dans mes travaux de thèse, je me suis intéressé à la fonction de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et son impact dans le développement de médicaments à visée du système nerveux central (SNC). Cependant, plusieurs obstacles limitant le processus de développement de nouveaux médicaments ont été identifiés. Parmi eux, une faible biodisponibilité cérébrale est reconnue pour être un facteur limitant majeur. Malgré ce constat, la biodisponibilité et la pharmacodynamie cérébrales sont souvent inconnues ou globalement négligées durant le processus de développement des médicaments. Actuellement, 3 méthodes permettent d'explorer la pharmacocinétique cérébrale in vivo, à savoir l'analyse du liquide céphalorachidien, la tomographie par émission de positron et la microdialyse cérébrale. Chaque approche présente certaines contraintes, la première fournit des informations restreintes, la seconde est coûteuse et limitée à une utilisation principalement académique, la troisième est souvent réalisée sur des modèles rongeurs rendant la transposabilité des données à l’homme complexe. Le projet de recherche réalisé s’est articulé autour de cette problématique et a suivi deux axes de développement. Le premier s’est orienté sur l’étude du passage dans le contexte particulier de la maladie de Parkinson. Le second aborde le manque de modèles pertinents utilisables lors du développement d’un nouveau médicament et présente une solution possible, la microdialyse intracérébrale sur macaque vigile. Les études en lien avec la maladie de Parkinson ont mis en évidence que premièrement, les statines sont inefficace dans le traitement des dyskinésies lévodopa induites chez les patients parkinsoniens. Cet échec peut être en partie explicable par une biodisponibilité cérébrale insuffisante du principe actif. Deuxièmement, la fonction de BHE est modifiée sur le modèle de référence de la maladie de Parkinson, le macaque traité au 1-méthyle 4-phényl 1,2,3,6-tétrahydro pyridine (MPTP). Le travail réalisé selon le second axe démontre la faisabilité de l’échantillonnage du liquide extracellulaire cérébral sur macaque vigile par microdialyse. / While working on my thesis, I focused on the function of the blood-brain barrier (BBB) and its impact in drug development to target the central nervous system (CNS). However, several obstacles that slow down the process of developing new successful drugs have been identified. Among several factors, the poor brain bioavailability is acknowledged as a primary limiting factor. Despite this statement, both brain bioavailability and brain pharmacodynamic are either unknown or globally overlooked during the drug development process. Currently, 3 methods allow exploring in vivo brain pharmacokinetic: cerebral spinal fluid sampling analysis, Positron Emission Tomography imaging and brain microdialysis. Each approach has its own constraints, the first provides restricted information, the second is expensive and limited to a mainly academic use, and the third is often carried out on rodent models making the transferability of data in complex man. The research project is focused on this issue and followed two paths of development. The first is focused on the study of the crossing in the particular context of Parkinson's disease. The second addresses the lack of appropriate model used in the development of a new drug and presents a possible solution, intracerebral microdialysis in awake macaque. Studies linked with Parkinson's disease show that statins has proved ineffective in the treatment of levodopa-induced dyskinesia in parkinsonian patients. This failure can be explained in part by insufficient brain bioavailability of the active compound. Secondly, in macaques treated with 1-methyl 4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydro pyridine (MPTP), the gold standard model of Parkinson's disease, the BBB is modified. The work done along the second axis shows the feasibility of sampling brain extracellular fluid by microdialysis in awake macaque.

Les Cellules Folliculaires Dendritiques (FDC) régulent l'homéostasie des lymphocytes B et sont indispensables à la mise en place des réponses immunes humorales. Les FDC s'organisent, au sein des organes lymphoïdes secondaires, en réseaux tridimensionnels denses, nécessaires à leur fonctionnement. Les études s'intéressant aux FDCs, empruntent classiquement des approches in vitro ou ex vivo, peu adaptées à la nature de ce type cellulaire. Au cours de mon travail de thèse, nous avons utilisé plusieurs systèmes de 'multicolor fate mapping' dans le but de déchiffrer in situ les mécanismes à l'origine du développement initial, et du remodelage des réseaux de FDCs en contexte inflammatoire. Nous avons démontré que les FDCs provenaient de la prolifération clonale et de la différentiation des Cellules Marginales Réticulaires (MRC), un autre sous-type cellulaire stromal résidant près des sinus sous-capsulaires ganglionnaires, et dont les fonctions étaient à ce jour, inconnues. Lors des réponses immunes, nous avons prouvé que les FDCs nouvellement formées, ne dérivaient ni du recrutement de progéniteurs circulants ni de la prolifération de FDCs matures, mais plutôt de la prolifération clonale des MRCs, suivie de leur différentiation en FDCs. Au-delà de l'étude de la biologie des FDCs, notre travail a révélé une fonction importante des MRCs dans le soutien de la plasticité des réseaux de FDCs. / Follicular Dendritic Cells (FDCs) regulate B cell function and development of high affinity antibody responses but little is known about their biology. FDCs associate in intricate cellular networks within secondary lymphoid organs. In vitro and ex vivo methods may thus be of little interest to understand the genuine immunobiology of FDCs in their native habitat. Herein, we utilised various multicolor fate mapping systems to investigate the ontogeny and dynamics of lymph node (LN) FDCs in situ. We show that LN FDC networks arise from the clonal expansion and differentiation of Marginal Reticular Cells (MRCs), a population of lymphoid stromal cells lining the LN subcapsular sinus. We further demonstrate that during an immune response, FDCs accumulate in germinal centers and that neither the recruitment of circulating progenitors nor the division of local mature FDCs significantly contributes to this accumulation. In contrast, we provide evidence that newly generated FDCs also arise from the proliferation and differentiation of MRCs, thus unraveling a critical function of this poorly defined stromal cell population.

La progéria ou HGPS (Hutchinson-Gilford progeria syndrome) est une maladie caractérisée par un vieillissement prématuré et accéléré extrêmement rare. Son incidence est estimée à environ 1 cas pour 4 à 8 millions de naissances selon les études. Les signes cliniques qui la caractérisent incluent notamment un retard de croissance majeur, une lipodystrophie, des ostéolyses distales et une atteinte cardiovasculaire qui est la cause du décès à l'âge moyen de 13 ans. La progéria est causée de façon prédominante par une mutation de novo dans le gène LMNA codant les lamines A et C, découverte par notre équipe en 2003. Cette mutation récurrente, prédite pour être silencieuse (c.1824C>T; p.Gly608Gly), active un site d'épissage cryptique qui génère une forme tronquée, anormalement prénylée et toxique de la lamine A, appelée la progérine. Ce travail de thèse a eu pour objectifs : 1) la caractérisation de différents marqueurs moléculaires et phénotypiques des lignées de patients atteints d'HGPS ou de syndromes apparentés ainsi que dans le modèle murin de progéria LmnaG609G/G609G, 2) la caractérisation des aspects cognitifs de ce modèle murin ainsi qu'une étude élargie de l'expression des lamines dans le cerveau, 3) le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans le cadre de la progéria, in vitro et in vivo, incluant notamment l'exploration des effets d'une molécule antioxydante, le resvératrol, ainsi que l'adaptation de l'approche thérapeutique par oligonucléotides antisens (AON) (Osorio et al. 2011) visant à son administration par voie orale. / Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) is an extremely rare genetic disease characterized by premature, accelerated and segmental aging with an estimated incidence of 1 in 4 to 8 million of births. Children with HGPS present with major growth retardation, lipodystrophy, distal osteolysis and cardiovascular defects that cause their death at the mean age of 13 years. In 2003, our team discovered the causative mutation of HGPS in the LMNA gene. Despite being predicted as silent (c.1824 C>T; p.Gly608Gly), this de novo mutation activates a cryptic splicing site leading to the production of a truncated, aberrantly prenylated and toxic form of lamin A, called progerin. The main objectives of this thesis have been: 1) characterizing molecular and cellular biomarkers in HGPS or related syndromes patients' cell lines, together with the progeria mouse model LmnaG609G/G609G, 2) characterizing cognitive aspects as well as lamins' and progerin expression in the central nervous system in the same in vivo model and 3) the developement, in vitro and in vivo, of novel therapeutic approaches for progeria using either resveratrol, an antioxidant molecule, or micelle-coated antisense oligonucleotides with the intent of adapting an oral treatement for progeria children.

<p>Intricate neural circuits underlie all brain functions. However, these neural circuits are highly dynamic. The ability to change, or the plasticity, of the brain has long been demonstrated at the level of isolated single synapses under artificial conditions. Circuit organization and brain function has been extensively studied by correlating neuronal activity with information input. The primary visual cortex has become an important model brain region for the study of sensory processing, in large part due to the ease of manipulating visual stimuli. Much has been learned from studies of visual cortex focused on understanding the signal-processing of visual inputs within neural circuits. Many of these findings are generalizable to other sensory systems and other regions of cortex. However, few studies have directly demonstrated the orchestrated neural-circuit plasticity occurring during behavioral experience. </p> <p>It is vital to measure the precise circuit connectivity and to quantitatively characterize experience-dependent circuit plasticity to understand the processes of learning and memory formation. Moreover, it is important to study how circuit connectivity and plasticity in neurological and psychiatric disease states deviates from that in healthy brains. By understanding the impact of disease on circuit plasticity, it may be possible to develop therapeutic interventions to alleviate significant neurological and psychiatric morbidity. In the case of neural trauma or ischemic injury, where neurons and their connections are lost, functional recovery relies on neural-circuit repair. Evaluating whether neurons are reconnected into the local circuitry to re-establish the lost connectivity is crucial for guiding therapeutic development.</p> <p>There are several major technical hurdles for studies aiming to quantify circuit connectivity. First, the lack of high-specificity circuit stimulation methods and second, the low throughput of the gold-standard patch-clamp technique for measuring synaptic events have limited progress in this area. To address these problems, we first engineered the patch-clamp experimental system to automate the patching process, increasing the throughput and consistency of patch-clamp electrophysiology while retaining compatibility of the system for experiments in <i>ex vivo </i>brain slices. We also took advantage of optogenetics, the technology that enables control of neural activity with light through ectopic expression of genetically encoded photo-sensitive channels in targeted neuronal populations. Combining optogenetic stimulation of pre-synaptic axonal terminals and whole-cell patch-clamp recording of post-synaptic currents, we mapped the distribution and strength of synaptic connections from a specific group of neurons onto a single cell. With the improved patch-clamp efficiency using our automated system, we efficiently mapped a significant number of neurons in different experimental conditions/treatments. This approach yielded large datasets, with sufficient power to make meaningful comparisons between groups.</p> <p>Using this method, we first studied visual experience-dependent circuit plasticity in the primary visual cortex. We measured the connectivity of local feedback and recurrent neural projections in a Fragile X syndrome mouse model and their healthy counterparts, with or without a specific visual experience. We found that repeated visual experience led to increased excitatory drive onto inhibitory interneurons and intrinsically bursting neurons in healthy animals. Potentiation at these synapses was absent or abnormal in Fragile X animals. Furthermore, recurrent excitatory input onto regular spiking neurons within the same layer remained stable in healthy animals but was depressed in Fragile X animals following repeated visual experience. These results support the hypothesis that visual experience leads to selective circuit plasticity which may underlie the mechanism of visual learning. This circuit plasticity process is impaired in a mouse model of Fragile X syndrome. </p> <p>In a separate study, in collaboration with the laboratory of Dr. Gong Chen, we applied the circuit-mapping method to measure the effect of a novel brain-repair therapy on functional circuit recovery following ischemic injury, which locally kills neurons and creates a glial scar. By directly reprogramming astrocytes into neurons within the region of the glial scar, this gene-therapy technology aims to restore the local circuit and thereby dramatically improve behavioral function after devastating neurological injury. We found that direct reprogramming converted astrocytes into neurons, and importantly, we found that these newly reprogrammed neurons integrated appropriately into the local circuit. The reprogramming also improved connections between surviving endogenous neurons at the injury site toward normal healthy levels of connectivity. Connections formed onto the newly reprogrammed neurons spontaneously remodeled, the process of which resembled neural development. By directly demonstrating functional connectivity of newly reprogrammed neurons, our results suggest that this direct reprogramming gene-therapy technology holds significant promise for future clinical application to restore circuit connectivity and neurological function following brain injury.</p>