Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1875.pdf: 2067578 bytes, checksum: 8ff948a97c937ef826fb4b4274b1c998 (MD5) Previous issue date: 2008-04-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work, several strategies were tested to improve the covalent multipoint attachment of chymotrypsin, carboxypeptidase A and cellulase on chitosan. Hybrid gels with different internal structures were obtained using sodium alginate, gelatin or κ-carrageenan and by changing the polymer concentration, 2.5-5.0% (m/v) and the activating reactant, glutaraldehyde, glycidol or epichlorohydrin. The addition of microorganisms to the hybrid polymer followed by cellular lysis, the increase of immobilization reaction time and the effect of the reduction of the final derivative with sodium borohydride were also tested. The influence of these variables on immobilization yields, recovered activities, and stabilization factors at 55°C and 65°C, were assessed. Chymotrypsin derivatives half-lives increased from 34 min at 55°C (for pure chitosan 2.5% activated with glutaraldehyde at pH 7.0, 4°C) to 468 min at 65°C (for chitosan 2.5%-carrageenan 2.5%, with the addition of 5% of S.cerevisiae, activation with epichlorohydrin, immobilization for 72 h at pH 10.05, room temperature and reduction of the final derivative). This best derivative was 9900-fold more stable than the soluble enzyme. A maximum load of 40 mg chymotrypsin.g.gel-1 was reached. The number of aldehyde and oxirane groups generated in the support, and of lysine residues of the enzyme involved in the multipoint attachment, as well SEM images of the gel structures, explain the obtained results. Carboxypeptidase A derivatives was analyzed. The results showed that immobilization via epichlorohydrin presented 40% (8.8) more stable derivatives than glutaraldehyde ones (5.3). However, derivative prepared with epoxides groups presented 100% of immobilization yield with 57% of recovered activity being 20-fold more stable than free enzyme after 48h of immobilization process. Derivatives activated by glutaraldehyde, epichlorohydrin and with epoxides presented diffusion limitations with Deff of 5.41.10-12, 5.59.10-12 m2.s-1 and 5.10.10-12 m2.s-1, respectively. To cellulase, assays of immobilization and saccharification of sugarcane bagasse cane were tested. The derivative used in a sequence of three distinct batches, was prepared with chitosan-alginate activated with glutaraldehyde/glycidol being 20-fold more stable than free enzyme. The best enzyme derivative was about 38 fold more stable activated via glycidol. The performance of the system of saccharification was excellent, indicating that enzyme immobilization may be a good alternative to reduce costs of ethanol production from lignocellulosic materials. / Neste trabalho de tese, várias estratégias foram analisadas com objetivo de melhorar e promover uma imobilização covalente multipontual de quimotripsina, carboxipeptidase A e celulase em quitosana. Géis híbridos com diferentes estruturas internas foram obtidos usando alginato de sódio, gelatina e κ-carragenana, bem como, variando a concentração de polímeros, 2,5-5,0% (m/v) e os agentes de ativação (glutaraldeído, glicidol e epicloridrina). A adição de células aos híbridos, seguido de lise celular, o aumento no tempo de imobilização e o efeito da redução no derivado final por borohidreto de sódio foram investigados. Foram averiguadas a influência destas variáveis nos rendimentos de imobilização, atividades recuperadas e estabilização a 55ºC e 65ºC. Derivados de quimotripsina tiveram um incremento de estabilidade de 34 min a 55ºC (para quitosana pura 2,5% ativada com glutaraldeído a pH 7,0 e a 4ºC) para 468 min a 65ºC (para quitosana 2,5%-carragenana 2,5% com adição de 5% de S.cerevisiae e ativado com epicloridrina com tempo de imobilização de 72h a pH 10,05 a 25ºC e reduzido). Este melhor derivado foi 9900 vezes mais estável que a enzima livre. A máxima capacidade de imobilização foi de 40 mg de quimotripsina g.gel-1. O número de grupos aldeídos e oxiranos gerados no suporte e a quantidade de lisina envolvidas na imobilização multipontual, bem como as imagens do MEV das estruturas dos suportes explicam os resultados obtidos. Derivados de carboxipeptidase A quando ativado com glutaraldeído mostrou uma melhor estabilização de 5,3 vezes, já para o ativado com epicloridrina foi de 8,8 vezes. Entretanto, o derivado preparado com grupos oxiranos apresentou 100% de rendimento de imobilização com recuperação de atividade de 57% e foi 20 vezes mais estável que a enzima livre a 55ºC com tempo de imobilização de 48h e bloqueio de grupos epóxidos com glicina. Os derivados ativados com glutaraldeído, epicloridrina e epoxilado apresentaram sérias limitações difusionais na hidrólise de hipuril-Lfenilalanina com Deff de 5,41.10-12 , 5,59.10-12 m2.s-1 e 5,10.10-12 m2.s-1, respectivamente. Ensaios de imobilização da celulase e sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar foram realizados concomitantemente. O derivado utilizado em uma seqüência de três bateladas foi obtido com quitosana-alginato ativado com glutaraldeído/glicidol sendo este derivado 20 vezes mais estável que a enzima livre. Entretanto o melhor derivado obtido nos ensaios de imobilização foi com ativação de glicidol com uma estabilidade de aproximadamente 38 vezes seguido da imobilização por encapsulação seguido de reticulação com glutaraldeído com um fator de estabilidade de aproximadamente 33 vezes em relação à livre. O desempenho do sistema de sacarificação foi muito bom, indicando a reusabilidade da celulase imobilizada é uma boa alternativa para reduzir custos na produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2277.pdf: 933463 bytes, checksum: 01507ff9166cf8406e37c047022142e1 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The objective of this work was stabilize and immobilize β-galactosidase from activated agarose and chitosan supports. Initially, it was evaluated the buffer type, ionic strength and bivalent ions Mn2+ and Mg2+ on the hydrolytic activity of the enzyme using as substrates lactose and o-NPG (o-nitrophenyl galactopyranoside). Then the enzyme was covalently immobilized on glyoxyl-agarose, epoxy-chitosan-alginate and chitosan activated with glutaraldehyde, encapsulation in agarose and chitosan and ionic adsorption on MANAE-agarose. After immobilization, different strategies were used to stabilize the derivative such as crosslinking with glutaraldehyde and polyaldehyde dextran for the enzyme immobilized by ionic adsorption and reduction with sodium borohydride (NaBH4) for the enzyme covalently immobilized. For the derivative with maximum catalytic activity obtained, we estimated the kinetic and biochemical parameters as well as thermal stability at different temperatures and storage, operational stability, effect of inhibition by galactose and lactose yield. In the lactose hydrolysis, the best conditions were evaluated at 45°C in 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 and addition of 2 mM MgCl2 and 0.1 mM MnCl2 (6786.5 U/mL of crude extract) and in the hydrolysis of synthetic substrate, o-NPG, the conditions for maximum catalytic activity was buffer sodium phosphate pH 7.0 50 mM with 2 mM MgCl2 at 25°C (4466.1 U/mL of crude extract). The enzyme immobilization on glyoxyl-agarose at pH 10.05 inactivated the enzyme. At pH 7.0, the enzyme was not immobilized. Similar behavior was observed for the enzyme immobilized on epoxy-chitosan-alginate. The ionic adsorption of the enzyme on MANAE-agarose allowed obtaining derivatives with high catalytic activity and immobilization yield around 100%. Neverthelless the crosslinking of the immobilized enzyme using polyaldehyde dextran and glutaraldehyde reduced drastically the hydrolytic activity of the derivatives by distortion of the enzyme structure. Besides the thermal stability of these derivatives at 10°C showed a similar behavior to the free enzyme. In order to obtain a derivative with high thermal stability on catalytic activity, the covalent immobilization on coagulated chitosan by different solutions and temperature. The derivative that provided higher catalytic activity was coagulated in a solution of 0.5 M KOH at 50°C and activated with glutaraldehyde 0.8% (v/v), with immobilization yield and recovered activity of 100%. An assay of looding of the support showed that 247,0 mg protein/ g gel was the maximum load. However diffusional limitation was verified even at 25 mg/g of gel. The immobilization process did not change the biochemical properties of the enzyme (optimum temperature and pH). In the storage stability at 10 ° C, the derivative covalently immobilized lost only 20% of initial activity after 90 days. The enzyme immobilized on chitosan was 3-5 fold more stable than the soluble enzyme at 20 and 40°C. The operational stability in 4 cycles showed a loss of 17% of hydrolytic activity after 4 cycles. Another important fact was the smallest effect of inhibition by galactose compared to soluble enzyme, even at high concentrations (5 g/L). In the hydrolysis of lactose the conversion was 70 % using insoluble and immobilized enzymes. We can conclude that the β-galactosidase immobilized on chitosan activated with glutaraldehyde showed good properties, because it allows the development of continuous processes, facility of downstream process (product purification), avoiding contamination of the product by the biocatalyst. This advantage is very important specially for food industry. / O objetivo deste trabalho foi imobilizar e estabilizar β-galactosidase de Kluyveromyces fragilis utilizando diferentes estratégias de imobilização em suportes orgânicos quitosana e agarose, com diferentes protocolos de ativação. Inicialmente, foi avaliado o tipo de tampão, força iônica e a suplementação com íons bivalentes Mn2+ e Mg2+ sobre a atividade hidrolítica da enzima empregando lactose e o-NPG (o-nitrofenil galactopiranosídeo) como substratos. A enzima foi imobilizada covalentemente em glioxil-agarose, epóxi-quitosana-alginato e quitosana ativada com glutaraldeído, por encapsulação em agarose e quitosana e por adsorção iônica em MANAE-agarose. Após a imobilização, diferentes estratégias foram adotadas para a estabilização do derivado como o entrecruzamento com glutaraldeído e polialdeído dextrana para a enzima imobilizada por adsorção iônica e a redução com borohidreto de sódio (NaBH4) para a enzima imobilizada covalentemente. Para o melhor derivado de β-galactosidase foram estimados pH e temperatura de máxima atividade catalítica; estudados estabilidade térmica e operacional; efeito de inibição pela galactose e conversão de lactose. Na hidrólise da lactose, as melhores condições avaliadas foram a 45°C em tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,0 e adição de 2 mM MgCl2 e 0,1 mM MnCl2 (6786,5 U/mL de extrato) e na hidrólise do substrato sintético, o-NPG, a máxima atividade foi obtida em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0 com 2 mM MgCl2 a 25°C (4466,1 U/mL de extrato). A imobilização da enzima em gel glioxil-agarose não forneceu um derivado ativo, pois no pH de imobilização (10,05) a enzima sofreu inativação. Comportamento similar foi verificado para a enzima imobilizada em epóxi-quitosana-alginato. A adsorção iônica da enzima em MANAE-agarose forneceu derivados com elevada atividade catalítica e rendimento de imobilização da ordem de 100%. Porém, o entrecruzamento com polialdeído dextrana e glutaraldeído pós-imobilização reduziu drasticamente a atividade hidrolítica dos derivados provavelmente por distorção da estrutura ativa da enzima. Mesmo com o entrecruzamento, a estabilidade térmica destes derivados a 10°C apresentou um comportamento similar à enzima livre. Com o propósito de obter um derivado mais estável termicamente e com elevada atividade catalítica, foram avaliadas diferentes estratégias de imobilização covalente em quitosana coagulada por diferentes soluções e temperatura. O derivado que forneceu maior atividade catalítica foi obtido imobilizando a enzima em quitosana coagulada em solução 0,5 M de KOH a 50°C e ativado com glutaraldeído 0,8% (v/v), com atividade recuperada e rendimento de imobilização de 100%. A máxima concentração de enzima imobilizada neste suporte foi de 247,0 mg de proteína/g de gel. Após o carregamento de 25 mg/g de gel, limitação difusional foi verificada. A imobilização não alterou o pH e temperatura de máxima atividade hidrolítica da β-galactosidase. A enzima imobilizada em quitosana-glutaraldeído perdeu apenas 20% da atividade inicial após 90 dias incubada no tampão fosfato de potássio 20 mM pH 7,0 com íons bivalentes Mn2+ e Mg2+a 10°C, foi 3-5 vezes mais estável que a enzima solúvel nas temperaturas de 20 e 40°C, pH7,0. A estabilidade operacional (40ºC e pH7,0) realizada em 4 ciclos mostrou uma perda de 17% da atividade hidrolítica inicial ao final do quarto ciclo. Outro fato relevante foi o menor efeito de inibição da enzima imobilizada pela galactose em comparação à enzima solúvel, mesmo em altas concentrações (5 g/L). Na hidrólise de lactose a 40ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 70% da lactose para ambas as enzimas, solúvel e imobilizada. De acordo com os resultados obtidos, pôde-se verificar que a imobilização de β-galactosidase em quitosana ativada com glutaraldeído foi vantajosa, pois permite o desenvolvimento de processos contínuos de produção, simplifica a etapa de purificação do produto final e especificamente para fins alimentícios, reduz ou evita a contaminação do produto pelo biocatalisador.

Submitted by SUHELEN TANNUS DE ALMEIDA null (suhelentannus@hotmail.com) on 2017-08-18T17:20:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Repositório.pdf: 1287953 bytes, checksum: 3dc924d2158011a641d73d8be8d38935 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-23T19:17:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 almeida_st_me_sjrp.pdf: 1287953 bytes, checksum: 3dc924d2158011a641d73d8be8d38935 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-23T19:17:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 almeida_st_me_sjrp.pdf: 1287953 bytes, checksum: 3dc924d2158011a641d73d8be8d38935 (MD5) Previous issue date: 2017-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As nanozeólitas têm atraído atenção dos pesquisadores em diversas áreas de pesquisa devido às propriedades físico-químicas que elas possuem, como por exemplo, grande área de superfície externa, alta dispersibilidade e facilidade de modulação das suas características de superfície, principalmente em relação à carga de superfície e propriedades de hidrofilicidade/hidrofobicidade. No presente trabalho foi realizado estudo de sínteses e caracterização da nanozeólita faujasita pura e trocada com terras-raras (La3+, Ce3+, Gd3+ e Dy3+). Primeiramente as nanozeólitas trocadas com os cátions de terras-raras foram empregadas como catalisadores hetereogêneos na reação de transesterificação química de triacilglicerídeos com o intuito de produzir biodiesel via rota metílica e etílica. Em paralelo a esse estudo os nanozeólitos trocados com cátions de terras-raras foram também estudados como suportes ou matrizes sólidas para a imobilização da lipase fúngica, mas especificamente a lipase de Thermomyces lanuginosus (LTL). Os complexos nanozeólitas-enzimas foram também empregados como catalisadores na reação de transesterificação de triacilglicerídeos para produção de ésteres etílicos de ácidos graxos utilizando óleo de soja como matéria prima via rota etílica. Os resultados do estudo de transesterificação do óleo de soja usando apenas as nanazeólitas trocadas com as terras-raras em termos de rendimentos de EEAG e EMAG usando 5% concentração de catalisador (em relação a massa de óleo), 650C, 8 e 12 horas foram: Nanozeólita faujasita trocada com lantânio a 0.1M/0.5M ( 0% de EEAG e EMAG), Nanozeólita faujasita trocada com Cério a 0.1M/0.5M ( 0% de EEAG e EMAG), Nanozeólita faujasita trocada com Gadolínio a 0.1M/0.5M (0% de EEAG e EMAG) e Nanozeólita faujasita trocada com Disprósio a 0.1M/0.5M (0% de EEAG e EMAG). Os mesmos resultados negativos foram obtidos trabalhando-se na temperatura de 120oC com tempo de 8 e 12 horas e mesma concentração de catalisador em relação a quantidade de massa de óleo. Em contrapartida, os resultados experimentais na produção de EEAG obtidos quando se empregou os complexos de nanozeolitas-enzimas foram bastante superiores e promissores em relação ao emprego puro dos nanezeólitos trocados com terras-raras. O rendimento de EEAG obtidos com os complexos Nanozeólita faujasita trocada com lantânio á 0.1M/LTL, Nanozeólita faujasita trocada com Cério á 0.1M/LTL, Nanozeólita faujasita trocada com Gadolínio á 0.1M/LTL e Nano- Nanozeólita faujasita trocada com Disprósio á 0.1M/LTL foram 67.4%, 0.0%, 24.7%, e 13.68% respectivamente. O rendimento EEAG obtidos com os complexos Nanozeólita faujasita trocada com lantânio a 0.5M/LTL, Nanozeólita faujasita trocada com Cério a 0.5M/LTL, Nanozeólita faujasita trocada com Gadolínio a 0.5M/LTL e Nanozeólita faujasita trocada com Disprósio a 0.1M/LTL foram 20.55%, 0.0%, 42.34%, e 22.94% respectivamente. O resultado mais relevante em termos catalíticos foi obtido para a enzima lipase de Thermomyces lanuginosus imobilizada no suporte Nanozeólita faujasita trocada com 0,1 mol.L-1 de cloreto de lantânio (Nanozeólita faujasita trocada com lantânio á 0.1M/LTL). Os rendimentos de ésteres etílicos de ácidos graxos (EEAG) para esse complexo foram de 67,39%. / Nanozeolites have attracted the attention of researchers in several research areas due to the physical-chemical properties they possess, such as large external surface area, high dispersibility and ease of modulation of their surface characteristics, mainly in relation to the charge of Surface and hydrophilicity / hydrophobicity properties. In the present work, a synthesis and characterization study of pure faujasite nanozeolite was performed with rare Earths (La3+, Ce3+, Gd3+ + and Dy3+). First, the nanozeolites exchanged with rare earth cations were used as heterogeneous catalysts in the reaction of chemical transesterification of triacylglycerides in order to produce biodiesel via methyl and ethyl route. In parallel to this study, nanozeolites exchanged with rare earth cations were also studied as solid supports or matrices for the immobilization of fungal lipase, but specifically the lipase Thermomyces lanuginosus (TLL). The nanozeolite-enzyme complexes were also used as catalysts in the transesterification reaction of triacylglycerides for the production of ethyl esters of fatty acids using soybean oil as raw material via the ethyl route. The results of the soybean oil transesterification study using only nanazeolites exchanged with rare earths in terms of FAME and FAEE yields using 5% catalyst concentration (based on oil mass), 65ºC, 8 hours and 12 hours Were: faujasite nanozeolite exchanged with lanthanum at 0.1M/0.5M (0% FAME and FAEE), faujasite nanozeolite exchanged with 0.1M /0.5M cerium (0% FAME and FAEE), faujasite nanozeolite exchanged with 0.1M/0.5M Gadolinium (0% FAME and FAEE) and faujasite Nanozeolite exchanged with Dysprosium at 0.1M/0.5M (0% FAME and FAEE). The same negative results were obtained by working at a temperature of 120ºC with time of 8 and 12 hours and the same concentration of catalyst in relation to the amount of oil mass. On the other hand, the experimental results in the production of FAEE obtained when using the complexes of nanozeolites-enzymes were much superior and promising in relation to the pure use of the nanozeolites exchanged with rare earths. The FAEE yields obtained with the complexes faujasite Nanozeolite exchanged with lanthanum at 0.1M / TLL, faujasite Nanozeolite exchanged with Cerium at 0.1M / TLL, Nanozeolite faujasita exchanged with Gadolinium at 0.1M / TLL and Nano-Nanozeolite faujasita exchanged with Dysprosium at 0.1M / TLL were 67.4%, 0.0%, 24.7%, and 13.68% respectively. The yield FAEES obtained with the complexes faujasite faujasite exchanged with lanthanum at 0.5M / TLL, faujasite Nanozeolite exchanged with Cerium at 0.5M / TLL, faujasite Nanozeolite exchanged with Gadolinium at 0.5M / TLL and faujasite Nanozeolite exchanged with Dysprosium at 0.1M / TLL Were 20.55%, 0.0%, 42.34%, and 22.94% respectively. The most relevant result in catalytic terms was obtained for the enzyme of Thermomyces lanuginosus immobilized on the support Nanozeolite faujasita and exchanged with 0.1 mol.L-1 of lanthanum chloride (faujasite nanozeolite exchanged with lanthanum at 0.1 M / TLL). The yields of ethyl fatty acid esters (FAEE) were 67.39.

Reptiles are animals that attract by their diversity and among them, the snakes deserve emphasis on use commercially like pet s and biological immune production. Considering the difficulties and the risk of management, is described methods off physic contention in snakes, including equipments and cautions. Was used hook, manual contention, barrows contention, Lutz s tie, bag of fabric and fabric, contention and transport box and bedding foam in 130 animals for 4 families, Boidae, Viperidae, Elapidae and Colubridae. The snakes physics contention techniques described in these opportunity was effective, provided that the conditions imposed by each state. / Répteis são animais que atraem pela sua diversidade e dentre eles as serpentes merecem destaque por serem utilizadas comercialmente como pet e na produção de imuno biológicos. Considerando as dificuldades e os riscos no manejo, descreveram-se métodos de contenção física em serpentes, incluindo os equipamentos e as precauções. Utilizaram-se gancho, contenção manual, tubo de contenção, laço de Lutz, tecido e saco de tecido, caixa de contenção e transporte e cama de espuma em 130 animais das quatro famílias Boidae, Viperidae, Elapidae e Colubridae. As técnicas de contenção física de serpentes descritas nesta oportunidade foram realizadas no Jardim Zoológico da Província de Córdoba Argentina, no serpentário do Instituto Vital Brasil em Niterói RJ, no setor de répteis do Instituto de Biociências da Universidade Federal de Uberlândia UFU e no Laboratório de Pesquisa em Animais Silvestres da UFU, onde mostraram-se eficazes, desde que respeitadas as condições impostas por cada situação. / Mestre em Ciências Veterinárias

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho teve como objetivo descrever o potencial de biossorção de lantânio pelas microalgas Ankistrodesmus sp. e Golenkinia sp. livres e pellets de alginato de cálcio, com e sem as microalgas imobilizadas, a partir de soluções aquosas. Para isso foram realizados estudos em regime batelada e em coluna de leito fixo. Modelos cinéticos de pseudo-primeira ordem e de segunda ordem e isotermas de equilíbrio de Langmuir e de Freundlich foram utilizados para a descrição quantitativa e a previsão do comportamento de adsorção do metal pelas biomassas livres e imobilizadas no sistema descontínuo. Os dados foram mais bem ajustados pelo modelo cinético de segunda ordem, com coeficientes de determinação (r2) maiores que 0,98. Foram obtidos tempos de equilibrio muito curtos, na faixa de 1-30 minutos. A isoterma de Langmuir foi a que melhor se ajustou aos dados experimentais, com valores de r2 maiores que 0,94. Foram observados valores de qmáx, isto é, a quantidade máxima de metal captado pelo biossorvente, entre 0,96 e 10,43 mmol/g. As células livres mostraram-se mais eficientes do que os pellets caracterizados com e sem os micro-organismos. Os pellets mostraram melhor potencial quando contendo microalgas imobilizadas, em comparação com eles puros. No estudo dinâmico, 12 L de solução contendo uma concentração de La (III) de 150 mmol/L ascenderam pela coluna contendo Ankistrodesmus sp. e Golenkinia sp. imobilizadas e pellets de alginato de cálcio puros durante 8 horas. No último minuto, os três biossorventes ainda apresentaram cerca de 80% de eficiência de remoção. Desta forma, o ponto de satuação não foi atingido. A rápida e alta capacidade de adsorção das microalgas revelou que sua aplicação em escala superior é possível em ambos os processos estudados, uma vez que a imobilização desses biomateriais não mudou a sua capacidade de sorção e nem o rápido contato entre o adsorvente e o soluto no processo de biossorção de lantânio / This study aimed to describe the potential of lanthanum biosorption by microalgal Ankistrodesmus sp. and Golenkinia sp. free and calcium alginate pellets with and without immobilized microalgae from aqueous solutions. To study this system in batch and fixed bed column were performed. Kinetic models of pseudo first-order and second order and equilibrium isotherms of Langmuir and Freundlich were used for the quantitative description and prediction of the behavior of metal adsorption by free and immobilized biomass in a batch system. The data were best fitted by a second-order kinetic model, with coefficients of determination (r2) values greater than 0.98. Very short equilibrium times were obtained in the range of 1-30 minutes. The Langmuir isotherm was the best fit to the experimental data, with r2 values greater than 0.94. qmax, that is, the maximum amount of metal captured by the biosorbent, values between 0.96 and 10.43 mmol/g were observed. The free cells were more efficient than with pellets characterized with and without the microorganisms. The pellets showed good potential when containing immobilized microalgae compared to pure them. In the dynamic study, 12 L of solution containing a concentration of La (III) 150 mmol/L reached by the column containing Ankistrodemsus sp. and Golenkinia sp. immobilized and pure calcium alginate pellets for 8 hours. At the end of the run, the three biosorbents still showed about 80% removal efficiency. Thus, the saturation point was not reached. The rapid and high adsorption capacity of microalgae revealed that its application in a higher scale is possible in both cases studied, since the immobilization of these biomaterials has not changed its sorption capacity or the rapid contact between the adsorbent and the solute in the process biosorption of lanthanum

O consumo e a utilização de produtos naturais, tanto para a alimentação quanto para utilização industrial é cada vez mais frequente. Assim, este trabalho teve como objetivo principal extrair um iridoide natural a partir do jenipapo, a genipina, a fim de empregá-la como agente de ativação em suportes de quitosana para imobilização de enzimas. Já que, dentre os agentes conhecidos este é o menos tóxico para este tipo de aplicação. Adicionalmente, foi iniciado um estudo para a construção de uma lactase recombinante visando a sua imobilização e síntese de prebióticos. Inicialmente, o jenipapo (Genipa americana L.), que pode possuir até 3 % de genipina disponível em seu fruto, foi submetido a diferentes condições de extração enzimática em um sistema aquoso bifásico (SAB). Com o intuito de compará-la com seu possível substituinte, o glutaraldeído, géis de quitosana foram produzidos e reticulados tanto com genipina quanto com glutaraldeído para avaliação das suas propriedades texturais e reológicas. Após, duas β-galactosidases modelos, de Kluyveromyces lactis e de Aspergillus oryzae, foram imobilizadas nos suportes de quitosana preparados a fim de avaliar a capacidade catalítica das enzimas imobilizadas O tratamento com a enzima comercial Celluclast à 10 % (v/v), a 36 °C e pH 3,7, promoveu a obtenção de 196 mg de genipina por grama de jenipapo – a maior concentração descrita na literatura. Quanto aos géis de quitosana reticulados, a utilização de 0,5 % de genipina (m/v) resultou em géis com propriedades texturais superiores e propriedades reológicas similares aos géis reticulados com 3 % de glutaraldeído (v/v). No geral, a hidrólise da lactose com a β-galactosidase de K. lactis imobilizada em quitosana ativada com 0,5 % de genipina (m/v) foi superior ao grau de hidrólise alcançada com as β-galactosidases imobilizadas em quitosana ativada com 3 % de glutaraldeído (v/v) (87 % e 9 %, respectivamente). Assim, a genipina extraída mostrou ser uma excelente substituta do glutaraldeído na ativação da quitosana e para utilização na imobilização de enzimas. Por fim, foi realizado o estudo para obtenção de uma β-galactosidase recombinante visando a síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS). / The consumption and use of natural products, both for food or for industrial use is increasingly common. Thus, the main objective of this work was to extract a natural iridoid from genipap, genipin, in order to use it as an crosslinking agent in chitosan supports for immobilization of enzymes. Since, among the known agents, it is the least toxic for this type of application. In addition, a study was started for a construction of a recombinant lactase aiming at its immobilization and synthesis of prebiotics. Initially, which may have up to 3% genipin available in its fruit, was submitted to different enzyme-assisted extractions in an aqueous biphasic system (ABS). Moreover, in order to compare it with its possible substituent, glutaraldehyde, chitosan gels were prepared and crosslinked with genipin and glutaraldehyde for evaluation of their textural and rheological properties. Lastly, the crosslinked chitosan was used as support for the immobilization of two model β-galactosidases from Kluyveromyces lactis and Aspergillus oryzae, in order to evaluate their catalytic capacities. The treatment carried out with Celluclast 10 % (v/v), at 36 °C and pH 3.7, provided an extraction of 196 mg of genipin per gram of genipap - the highest genipin concentration found in literature until now Chitosan gels crosslinked with genipin 0.5 % (w/v) showed better textural and similar rheological properties when compared to the chitosan crosslinked with glutaraldehyde 3 % (v/v). In general, the percentage of lactose hydrolysis by the β-galactosidases from K. lactis immobilized using genipin as a crosslinker was higher than when glutaraldehyde was used (87 % and 9 %, respectively). Therefore, genipin proves to be an excellent alternative for the use of glutaraldehyde in chitosan crosslinking studies. Finally, a study was carried out to obtain a recombinant β-galactosidase for the synthesis of galactooligosaccharides (GOS).

Aplicações de nanomateriais em biossensores têm recebido muito interesse nos últimos anos. Entre os vários tipos de biossensores estudados, sensores de glicose têm recebido destaque devido a sua importância em diagnósticos clínicos. Apesar do grande avanço no monitoramento de glicose nas últimas décadas, ainda há muitos desafios para alcançar um monitoramento de glicemia continuo, clinicamente preciso, em conexão a um sistema fechado otimizado para a entrega de insulina no corpo. Esta dissertação descreve a fabricação de filmes layer-by-layer (LbL) obtidos a partir da enzima glicose oxidase (GOx) e dos polieletrólitos poli(amidoamina) de geração 4 (PG4) e o hibrido PG4 com as nanopartículas de ouro (PG4AuNp). As nanopartículas de ouro foram sintetizadas em meio aquoso usando o dendrímero PG4, o ácido cloroáurico (HAuCl₄4) e ácido fórmico. As medidas de espectroscopia UV-Vis dos filmes automontados em substratos de quartzo mostraram um crescimento linear em função do número de bicamadas depositados apenas para o filme PG4-GOx. No filme PG4AuNp-GOx o crescimento não é linear. Em adição às caracterizações ópticas, estrutural e eletroquímica, os filmes LbL, depositados sobre substratos de vidro recoberto com óxido de índio (ITO) foram testados para a atuação em biossensores de peróxido de hidrogênio e de glicose. A biofuncionalidade da GOx e a viabilidade do método como biossensor foi demonstrada pelo aumento da corrente em função das sucessivas adições de alíquotas de glicose à solução. Os filmes sem nanopartículas não foram sensíveis a glicose. O biossensor com melhor desempenho foi o ITO-(PG4AuNp-GOx) com 5 bicamadas, que mostrou-se linear na faixa de 0 a 4,8 mM de glicose com sensibilidade 0,013 μA/mM e limite de detecção 0,44 mmolL ¹. / Applications of nanomaterials for biosensors have been target of substantial research in the last years. Among a large number of biosensors, glucose biosensors have attracted attention due to their applications in clinical diagnostics. Despite the remarkable progress in glucose biosensors in the last decades, there are still many challenges in achieving clinically accurate continuous glycemic monitoring in connection to closed-loop systems aimed at optimal insulin delivery. This dissertation describes the fabrication of layer-by-layer (LbL) films obtained from the enzyme glucose oxidase (GOx) and the polyelectrolytes poli(amidoamine) generation 4 (PG4) and PG4 containing gold nanoparticles (PG4AuNp). Gold nanoparticles were synthesized in aqueous solution using formic acid, PG4 and HAuCl ₄. UV-vis spectroscopy showed a linear growth on quartz substrate only in the system PG4-GOx. In addition to the optical, structural and electrochemistry investigation, these LbL films deposited on ITO-coated glass were employed as electrochemical glucose biosensors. The biofunctionality of GOx and feasibility of the method as biosensor are demonstrated by the increase of reduction current upon additions of successive aliquots of glucose. The biosensor ITO-(PG4AuNp-GOx) ₅ with the optimum performance had a detection limit of 0.44 mmolL¹ with a linear response in the range from 0 to 4.8 mmolL¹ and sensibility 0.013μA/mmolL ¹.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-05-25T15:44:48Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Francenya Kelley Lopes da Silva - 2018.pdf: 2672570 bytes, checksum: c14c9fc750994778f5b01e31548559c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-05-28T11:22:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Francenya Kelley Lopes da Silva - 2018.pdf: 2672570 bytes, checksum: c14c9fc750994778f5b01e31548559c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-28T11:22:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Francenya Kelley Lopes da Silva - 2018.pdf: 2672570 bytes, checksum: c14c9fc750994778f5b01e31548559c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-05-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Chitins are enzymes that act in the hydrolysis of chitin, a polysaccharide present in insect exoskeletons, crustacean shells, algae and fungal cell walls. Such enzymes can be applied in the preparation of chitosan and chitoligomers for pharmaceutical use, in the control of pathogenic fungi and in the treatment of chitinous residues derived from fishing. Improvement in the production of chitinase and other enzymes by microorganisms can be achieved by the cell immobilization technique, which consists in fixing or confining cells in an inert carrier. The cell immobilization confers protection against the shear force, promotes the easy separation of the cells from the culture medium, as well as the product and decrease of the cost of production, since, it allows the reuse of the biocatalyst. Among the materials used as support in a cellular immobilization, biopolymers, such as alginate, have been highlighted as non-toxic, inexpensive and highly available in nature. The present work aims to immobilize Paenibacillus illinoisensis in a polymer matrix of alginate for chitinase production, evaluating the differences in the production of the enzyme between free and immobilized cells. Thus, an anionic alginate solution containing the cells was dripped into a cationic solution of CaCl2, leading to the instant formation of spheres having an average size of 4 mm. The immobilization efficiency was 99.99% ± 0.01. The biomass was determined during enzymatic production and the maximum values were 1.45 x 108 CFU / mL in 96 hours for immobilized cells and 8.95 x 107 CFU / mL in 48 hours for free cells, evidencing an increase of 62.01% in the amount of cells immobilized in comparation to the free cells. The cell leakage from the immobilization support during the process was evaluated and corresponded to 6.46% of the total cells at the end of the fermentation. The enzymatic activity was 0.902 U in 96 hours for the immobilized cells and 0.641 U in 48 hours for the free cells, demonstrating an activity increase of 40.71%. The immobilized cells were also tested for reuse in a sequential batch system and demonstrated stability in the production for 4 cycles of 96 hours each, losing 21.04% of the initial activity at the end of the fourth cycle. The cellular immobilization methodology resulted in spheres with capacity to maintain the cell viability during the bioprocess, increase of the enzymatic activity, low leakage of cells of the support and reuse capacity, being able to be used in the future for the production of chitinase for its various applications. / As quitinases são enzimas que atuam no processo de hidrólise da quitina, um polissacarídeo presente nos exoesqueletos de insetos, carapaças de crustáceos, em algas e na parede celular de fungos. Tais enzimas podem ser aplicadas na preparação de quitosana e quitoligômeros para uso farmacêutico, no controle de fungos patogênicos e no tratamento de resíduos quitinosos derivados da pesca. A melhoria na produção de quitinase e de outras enzimas por microrganismos pode ser alcançada pela técnica da imobilização celular, que consiste na fixação ou confinamento de células em um suporte inerte. A imobilização celular confere proteção contra a força de cisalhamento, promove a fácil separação das células utilizadas do meio de cultura, bem como do produto e diminuição do custo de produção, uma vez que, possibilita o reuso do biocatalisador. Dentre os materiais utilizados como suporte em uma imobilização celular, os biopolímeros, tais como o alginato, têm recebido destaque por serem atóxicos, baratos e de grande disponibilidade na natureza. O presente trabalho teve como objetivo a imobilização de Paenibacillus illinoisensis em matriz polimérica de alginato para produção de quitinase, avaliando-se as diferenças na produção da enzima entre as células livres e imobilizadas. Para tal, uma solução aniônica de alginato contendo as células foi gotejada em uma solução catiônica de CaCl2, levando a formação instantânea das esferas que apresentaram tamanho médio de 4 mm. A eficiência de imobilização foi de 99,99 % ± 0,01, sendo utilizados para produção de quitinase. A biomassa foi determinada durante a produção enzimática e os valores máximos foram de 1,45 x 108 UFC/ mL em 96 horas para células imobilizadas e 8,95 x 107 UFC/ mL em 48 horas para células livres, evidenciando o aumento da quantidade de células imobilizadas em relação as células livres em 62,01 %. A saída de células do suporte de imobilização durante o processo foi avaliada e correspondeu a 6,46 % do total de células ao final da fermentação. A atividade enzimática foi de 0,902 U em 96 horas para as células imobilizadas em comparação com a das células livres de 0,641 U em 48 horas, demonstrando um aumento da atividade em 40,71 %. As células imobilizadas também foram testadas para a reutilização em um sistema de bateladas sequenciais e demonstraram estabilidade para produção por 4 ciclos de 96 horas cada, perdendo 21,04 % da atividade inicial ao final do quarto ciclo. Desse modo, verificou-se que a metodologia de imobilização celular empregada resultou em esferas com capacidade de manutenção da viabilidade celular durante o bioprocesso, aumento da atividade enzimática, baixa saída de células do suporte e capacidade de reuso, podendo futuramente ser empregada para produção de quitinase para suas diversas aplicações.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.