[ES] La ablación por radiofrecuencia (RF) se ha convertido en una técnica ablativa importante, ampliamente utilizada en el área de las terapias mínimamente invasivas de la medicina moderna. El avance en el campo de las tecnologías basadas en RF a lo largo de los años ha llevado a un número creciente de aplicaciones en diferentes áreas terapéuticas tales como arritmias cardíacas, epilepsia, oncología, resección asistida, apnea, dolor o cirugía estética. Sin embargo, existe una constante necesidad de desarrollar estudios computacionales y experimentales para mejorar el rendimiento de estas técnicas. El enfoque principal de esta tesis doctoral está centrado en examinar los efectos térmicos y eléctricos de ablación por radiofrecuencia de tejidos para mejorar la eficacia y la seguridad de las terapias y dispositivos basados en energía de radiofrecuencia. Las dos áreas principales de interés han sido el tratamiento del dolor y la cirugía hepática oncológica, que se han organizado en tres estudios independientes. La metodología de los estudios se ha basado en modelos computacionales y estudios experimentales sobre phantom de agar, modelos ex vivo e in vivo y ensayos clínicos. El estudio focalizado en el tratamiento del dolor ha incluido el análisis de los efectos eléctricos y térmicos del tratamiento con radiofrecuencia pulsada (PRF) y el riesgo relacionado con el daño térmico al tejido. Se han estudiado diferentes protocolos pulsados empleados en la práctica clínica utilizando modelos computacionales. La exactitud del modelo se ha validado mediante un modelo en phantom de agar. Se han propuesto también modelos computacionales adicionales para los protocolos pulsados alternativos en los cuales se reduciría el efecto térmico sin afectar al efecto eléctrico. En el estudio se ha discutido también el concepto de electroporación leve como el resultado de PRF. En el área de la cirugía hepática oncológica se han analizado dos técnicas diferentes. El primer estudio se ha centrado en examinar la hidratación del tejido durante la ablación por RF con un nuevo electrodo ICW. El nuevo diseño ha incluido dos agujas de perfusión expandibles integradas en el catéter. El objetivo principal ha sido mejorar la precisión del modelo computacional de ablación por RF de tumor utilizando una geometría realista de la distribución de solución salina en el tejido y evaluar el rendimiento del catéter de RF. Se han modelado diferentes casos de tumor infundido con solución salina y los resultados simulados se han comparado con los datos clínicos de un ensayo en 17 pacientes con cáncer hepático. Con el fin de obtener una distribución espacial realista de la solución salina infundida, se ha empleado un estudio in vivo sobre el modelo de hígado de cerdo. El segundo estudio se ha centrado en el desarrollo de una nueva técnica de sellado endoluminal basada en catéter, como una alternativa más efectiva para el manejo del remanente pancreático. El método ha consistido en una ablación por radiofrecuencia guiada por impedancia con la técnica de pullback. El ajuste del tipo de catéter de RF y del protocolo de ablación se ha realizado mediante modelos porcinos ex vivo. Posteriormente, la efectividad del sellado se ha evaluado sobre un modelo de cerdo in vivo. / [CAT] L'ablació per radiofreqüència (RF) s'ha convertit en una tècnica ablativa important, àmpliament utilitzada en l'àrea de les teràpies mínimament invasives de la medicina moderna. L'avanç en el camp de les tecnologies basades en RF al llarg dels anys ha portat a un número creixent d'aplicacions en diferents àrees terapèutiques com ara arítmies cardíaques, epilèpsia, oncologia, resecció assistida, apnea, dolor o cirurgia estètica. No obstant això, hi ha una constant necessitat de desenvolupar estudis computacionals i experimentals per a millorar el rendiment d'aquestes tècniques. Aquesta tesi doctoral ha estat centrada en examinar els efectes tèrmics i elèctrics de l'ablació per radiofreqüència de teixits per tal de millorar l'eficàcia i la seguretat de les teràpies i dispositius basats en energia de radiofreqüència. Dos àrees principals són el tractament del dolor i la cirurgia hepàtica. Aquestos han sigut organitzats en tres estudis independents. La metodologia dels estudis ha estat basada en models computacionals i experimentals sobre phantom d'agar, models ex vivo i in vivo i assajos clínics. L'estudi enfocat en el tractament del dolor ha inclòs l'anàlisi dels efectes elèctrics i tèrmics del tractament amb radiofreqüència polsada (PRF) i el risc relacionat amb el dany tèrmic al teixit. S'han estudiat diferents protocols polsats emprats en la pràctica clínica utilitzant models computacionals. L'exactitud del model ha estat validada per mitjà d'un model de phantom d'agar. S'han proposat també models computacionals addicionals per a protocols polsats alternatius en els quals es reduiria l'efecte tèrmic sense afectar l'efecte elèctric. En aquest estudi s'ha discutit també el concepte d'electroporació lleu com el resultat de PRF. A l'àrea de la cirugía hepàtica han sigut analitzades dos tècniques diferents. El primer estudi s'ha centrat en la hidratació del teixit durant l'ablació per RF amb un nou elèctrode ICW. El nou disseny ha inclòs dos agulles de perfusió expandibles integrades en el catèter. L' objetiu principal ha sigut millorar la precisió del model computacional d' ablació de tumors per RF utilitzant una geometria realista per a la distribució de sèrum salií en el teixit i evaluar el rendiment del catèter de RF. S'han modelat diferents casos de tumor infundit amb sèrum salí i els resultats simulats han sigut comparats amb les dades clíniques d'un assaig dut a terme sobre 17 pacients amb càncer hepàtic. Amb l'objetiu d'obtenir una distribució espacial realista del sèrum salí injectat, s'ha du a terme un estudi in vivo basat en un model de fetge de porc. El segon estudi s'ha centrat en el desenvolupament d'una nova tècnica de tancament endoluminal bassat en catèter, com una alternativa més efectiva per a gestionar el romanent pancreàtic. El mètode ha consistit en una ablació per radiofreqüència guiada per impedància amb la tècnica de pullback. L'ajust del tipus de catèter de RF i del protocol d'ablació ha sigut realitzat per mitjà de models porcins ex vivo. Posteriorment, l'efectivitat del tancament ha sigut avaluada sobre un model de porc in vivo. / [EN] Radiofrequency (RF) ablation has become an important ablative technique widely used in the area of minimally invasive therapies of the modern medicine. The advancement in the field of RF-based technologies over the years has led to a growing number of applications in different therapeutic areas such as cardiac arrhythmias, epilepsy, oncology, assisted resection, apnea, pain or aesthetic surgery. There is, however, a constant need for the development of computer and experimental studies, which would enhance the performance and safety of these techniques. The main focus of this PhD Thesis was on examining the thermal and electrical phenomena behind tissue radiofrequency ablation in order to improve the efficacy and safety of the RF-based therapies and applicators. Two main areas of interest were pain management and oncology, which were organized into three independent studies. The research methodology was based on computer modeling and experimental studies on phantoms, ex vivo and in vivo models, and clinical trials. The research on pain management involved the analysis of electrical and thermal effects of the pulsed radiofrequency (PRF) treatment and the related risk of tissue thermal damage. Different pulse protocols used in clinical practice were studied using computer modeling and the study accuracy was validated by means of agar phantom model. Additional computer models for alternative pulse protocols were also proposed, in which thermal effect would be reduced but the electrical effect would remain unchanged. The study also discussed the concept of a mild electroporation from PRF. In the area of oncology, two different techniques were analyzed. First study focused on examining tissue hydration technique during RF ablation with a novel internally cooled wet (ICW) electrode. The new design involved two expandable perfusion needles built into the catheter. The main aim was to improve the accuracy of computer model of tumor RF ablation using a realistic geometry of saline distribution in tissue, and to assess the performance of the RF catheter. Different cases of saline-infused tumor were modeled and the simulated results were compared with the clinical data from a trial on 17 hepatic cancer patients. An in vivo study on pig liver model was used to obtain a realistic spatial distribution of the infused saline. The second study focused on the development of a new catheter-based endoluminal sealing technique as more effective alternative for management of the pancreatic stump. The method consisted of the impedance-guided radiofrequency ablation with pullback. Fine-tuning involving RF catheter type and ablation protocol was performed using ex vivo porcine models, and posteriorly, sealing effectiveness was assessed on an in vivo pig model. / The completion of this work would have not been possible without the financial support of the Spanish Ministerio de Economía, Industría y Competitividad that provided funding for the development of this research project, my Predoctoral scholarship, and also Travel Grant for the research stay in The Wellman Center for Photomedicine / Ewertowska, E. (2019). Computer modeling and experimentation in radiofrequiency-based minimally invasive therapies [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/134057 / TESIS

Diatoms are unicellular, eukaryotic microalgae inhabiting nearly all aquatic habitats. They are famous for their micro- and nanopatterned silicabased cell walls, which are envisioned for various technologic purposes. Within this review article, we summarize recent in vivo modifications of diatom biosilica with respect to the following questions: (i) Which metals are taken up by diatoms and eventually processed into nanoparticles (NPs)? (ii) Are these NPs toxic for the diatoms and––if so––what factors influence toxicity? (iii) What is the mechanism underlying NP synthesis and subsequent metabolism? (iv) How can the obtained materials be useful for materials science?

1-Hydroxy-4-methyl-6-cyclohexyl-2-pyridon (Ciclopirox) ist außerordentlich gründlich auf genetische Wirksamkeit hin untersucht worden. Im Einzelnen handelt es sich um folgende Untersuchungen: Genmutationen in vitro und in vivo Chromosomenaberrationen in vitro und in vivo Rekombinationen Zelltransformationen

En radiothérapie externe, le traitement est administré au patient avec une séance chaque jour en utilisant le traitement établi en amont et répété jusqu’à la fin du traitement. La planification du traitement est établie par un système de planification du traitement (TPS) qui utilise des informations basées sur l’anatomie du patient (CT, IRM, TEP) et un calcul de dose. L'intégration aux unités de traitement des dispositifs d´ imagerie embarquée peuvent être utilisées pour vérifier la position du patient et son anatomie (dispositif d’imagerie Portal Électronique - EPID-, tomodensitométrie à faisceau conique - CBCT -). L'objectif principal est de fournir une solution robuste pour la routine afin de contrôler la dose délivrée au patient avec la dose prévue établie à partir du TPS. La première partie de ce travail consiste à intégrer une comparaison d'images EPID pour chaque fraction par rapport à la fraction planifiée (images CT) en acceptant, rejetant ou ignorant la différence de position et de niveau de dose du patient selon une tolérance seuil définie par l’utilisateur. La deuxième partie consiste à utiliser l´ imagerie volumique embarquée pour reconstruire la dose délivrée fraction par fraction en réalisant un calcul de dose. Avec la dose reçue par le patient jour après jour, sur la base de nouveaux indicateurs, il est possible d’établir une traçabilité permettant d’identifier les déviations et d’évaluer la qualité du traitement.Pour conclure, ces nouveaux indicateurs permettraient une double traçabilité : d'une part l'amélioration du calcul de dose puis l'efficacité du traitement ; d´ autre part, la sécurité du traitement et de la technique utilisée. / In external radiation therapy, the treatment is delivered to the patient with a fraction every day using the treatment established before and repeated until the end of the treatment. Treatment planning is establish using anatomical information of the patient and a dose calculation. New technologies already integrated to the treatment units can be used to check the positioning of the patient and anatomical information (Electronic Portal Imaging Device - EPID-, Cone Beam Computed Tomography - CBCT - ).The main goal is to develop a system to control the dose delivered to the patient from the dose establish with the TPS.The first aim of this work is to integrate portal images to compare and assess the position of the patient at each fraction to the planned one (CT images) by accepting, rejecting or ignoring the patient positioning and dose level discrepancy according to a tolerance threshold defined by the user. The second aim is to integrate on boardimaging to reconstruct the delivered dose using a dose calculation. Following the dose received by the patient day after day, based on new indicators, it can be established a traceability to identify deviation and assess treatment quality.To conclude, these new indicators would allow a double traceability : in one hand the improvement of the calculation and then the efficiency of the treatment ; in another hand the safety of the treatment and the technique used.

En plus des crises, les patients atteints d'épilepsie du lobe temporale (ELT) souffrent de déficits cognitifs tels que des troubles de l'apprentissage et de la mémoire épisodique. La formation de la mémoire épisodique nécessite des interactions entre le cortex et l'hippocampe pendant le sommeil. Ces interactions sont orchestrées par l'oscillation lente qui est générée dans le réseau thalamocortical. L'oscillation lente se propage dans d'autres structures sous corticales mais l'hippocampe semble être moins influencé. Cela pourrait être du à la fonction de filtre du gyrus denté. Dans l'ELT, le gyrus denté subit une réorganisation structurelle et fonctionnelle qui pourrait altérer sa fonction de filtre et aussi modifier la propagation d'activités épileptiformes du cortex vers l'hippocampe. Cependant, la propagation de rythmes physiologiques du cortex vers le réseau hippocampique pendant l'épileptogenèse a été peu étudié. Ce travail de thèse a eu pour but d'étudier l'influence des oscillations lentes corticales sur le potentiel de membrane et la décharge des cellules granulaires du gyrus denté dans un modèle d'ELT sous anesthésie. Nos résultats montrent une augmentation de la modulation du potentiel de membrane et ainsi que de la décharge des cellules granulaires du gyrus par l'oscillation lente corticale pendant l'épileptogenèse. Les changements qui s'opèrent dans le gyrus denté pendant l'épileptogenèse le rendraient plus permissif aux informations en provenance du cortex facilitant ainsi la propagation des oscillations lentes du cortex vers l'hippocampe. / In addition to seizures, patients with temporal Lobe Epilepsy (TLE) suffer from cognitive deficits such as learning and episodic memory impairment. The functional interactions between the cortex and the hippocampus notably during sleep are thought to be important for episodic memory formation. These interactions are orchestrated by the slow oscillation which is generated in thalamo-cortical networks. The slow oscillation is not confined to thalamo-neocortical networks but propagates to other subcortical structures but the hippocampus seems however less strongly influenced by the widespread propagation of the slow oscillation. This could result from the gate function of the dentate gyrus. In TLE, the dentate gyrus is associated with profound structural and functional network alterations which can alter the propagation of pathological activities such as epileptiform discharges from the cortex to the hippocampus. However, whether and how epilepsy modifies the impact of physiological activities on hippocampal networks remains to be investigated. This work was designed to study the influence of slow cortical oscillations on the membrane potential and discharge of granule cells in the dentate gyrus in an animal model of TLE. Our results show an increase in the modulation of membrane potential and as well as the discharge of granule cells in the dentate gyrus by the cortical slow oscillation during epileptogenesis. The changes that occur in the dentate gyrus during epileptogenesis would make it more permissive facilitating the spread of slow oscillations from the cortex to the hippocampus.

La vaccination est considérée comme l’un des plus grandes découvertes de l’histoire des maladies infectieuses, ayant permis le déclin et l’éradication de plusieurs pathogènes. Cependant, nous ignorons encore tous les mécanismes impliqués dans la protection contre les pathogènes. Cette méconnaissance est la cause de notre incapacité à formuler des nouveaux vaccins contre le VIH, la tuberculose, le paludisme et les pathogènes émergents. Récemment, on note des efforts pour induire une réponse cellulaire efficace après une vaccination, qui joue un rôle crucial dans la clairance des pathogènes.Cette thèse s’appuie sur un modèle de vaccin vivant atténue issu du virus de la vaccine : le MVA (Modified Vaccinia Ankara) et sur le modèle de primate non-humain. Nous avons caractérisé la réponse cellulaire après une immunisation intradermique suivant un schéma en prime-boost homologue, avec un boost à 2, suivi d’un boost à 9 mois. Le MVA a induit une infiltration massive de Lymphocytes T CD8 au niveau du site d’injection, 7 jours après l’immunisation. La réponse cellulaire systémique était modérée et ne reflétait pas l’amplitude de la réponse locale. Les injections du prime et du boost ont orienté la réponse cellulaire de façon différente, ce qui a mené à une importante induction de cellules T CD4 et CD8, persistantes, spécifiques de l’antigène et polyfonctionnelles après l’injection du boost à 9 mois.Cette étude souligne la différence entre les réponses systémiques et locales, démontrant l’importance de se focaliser sur la réponse tissulaire. Elle a également mis en lumière l’impact du schéma d’immunisation sur la qualité de la réponse cellulaire. / Vaccination has been considered as one of the greatest discoveries in the history of infectious diseases by allowing pathogens decline or eradication. However, we still ignore all the mechanism that lead to protection and therefore, fail to elaborate new vaccines against HIV, tuberculosis, malaria and emergent pathogens. Recently, efforts have been made to elicit effective cellular response after vaccination, which is crucial for pathogen clearance.This thesis relied on live-attenuated vaccine model derived from the vaccinia virus: the MVA (Modified Vaccinia Ankara) and a non-human primate model. We characterized the cellular immune response triggered by a homologous prime-boost intradermal injection of MVA, with a 2 months and 9 months boost. The MVA induced a massive infiltration of CD8 T cells at the injection site 7 days post immunization. In comparison, the systemic cellular response was mild and did not reflect the magnitude of the local response. The prime and boost injections elicited distinct orientation of the systemic and local T cells, which led to an important induction of a persistent, antigen-specific and polyfunctional CD8 and CD4 T cell responses after the 9 months boost.This work emphasizes the difference between local and systemic response, demonstrating the importance of the focus on tissue immunity. It also highlights the impact of the immunization schedule on the quality of the cellular response.

En raison de leur diffusion sauvage sur le e-commerce, leur soi-disant sécurité d’usage et l’alternative légale aux stupéfiants habituels qu’ils constituent, les nouvelles substances psychoactives (NPS) sont un phénomène mondial émergeant. Au-delà de différents défis dans nos sociétés (législation, prévention,... ), la capacité d'identifier les NPS dans des échantillons biologiques présente de nombreux challenges analytiques : ces nouvelles substances ne sont pas référencées dans les bibliothèques habituelles de spectrométrie de masse commerciales, leur métabolisme est inconnu (avec parfois des métabolites actifs), les doses actives sont parfois très faibles et par conséquent, les concentrations dans le sang ou l'urine sont également faibles. Dans ce contexte, notre laboratoire effectue régulièrement des analyses toxicologiques dans un contexte clinique, et pour les forces de l’ordre, dans des échantillons biologiques à l'aide de deux principaux types d’analyseurs : la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (CL-SM/SM) pour le criblage ciblé et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (CL-SMHR) pour le criblage non ciblé. Cette dernière technique est basée sur la masse exacte (mais également, le profil isotopique et le temps de rétention) des composés de l’échantillon à partir de laquelle la formule chimique est déterminée et recherchée dans une base de données spectrales en utilisant un logiciel dédié. L’objectif de ma thèse est de caractériser des NPS et leurs métabolites (afin d’alimenter cette base de données) en utilisant une stratégie combinant des approches in vitro, in silico et in vivo. Il s’agit, en particulier, d’augmenter la sensibilité de détection de la prise de NPS en se focalisant sur les métabolites qui sont le plus souvent les produits majeurs d’élimination des NPS.A cet effet, une méthode in vitro destinée à produire les métabolites des NPS et utilisant des microsomes hépatiques humains a été mise en oeuvre. Les métabolites obtenus, comparés aux prédictions in silico, ont été enregistrés dans la base de données. Cette approche a été confrontée à l’analyses de comprimés et d’autres produits non biologiques contenant des NPS, mais également, à des données in vivo d’exposition aux NPS : cas d’intoxications, études expérimentales et études épidémiologiques prospectives et rétrospectives dans des populations ciblées, ou non…Au total, ce travail basé sur cette stratégie in vitro, in silico, in vivo m’a permis d’enrichir notre base de données de spectres de masse haute résolution (SMHR) pour le criblage non ciblé et également notre base de données de criblage ciblé (SM/SM). Notre méthode en haute résolution, qui s’est enrichie au cours de ces 3 années de thèse de 83 nouveaux NPS et 281 métabolites, constitue aujourd’hui un outil analytique efficient pour la détection d’une exposition aux NPS. / Owing to wild e-commerce diffusion, alleging safety and legal alternative to usual drugs of abuse arguments, the new psychoactive substances (NPS) are emerging phenomenon in the world. In our societies, through various consecutive challenges (legislation, prevention, …), the ability to identify NPS in biological samples exhibits numerous analytical pitfalls: new substances which are not referenced in the usual commercial mass spectrometric libraries, unknown metabolism (with sometimes active metabolites), sometimes very low active dosages and consecutively low concentrations in blood or urine. In this context, clinical and forensic toxicological analyses in biological samples are routinely performed in our laboratory using two main analytical devices: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for targeted screening and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) for non-targeted screening. This last technique is based on the accurate mass (together with isotopic pattern and retention time) of sample components, from which the chemical formula is calculated and searched against a database of mass spectra using dedicated software. The aim of my thesis is to characterize NPS and metabolites (in order to increase the spectral database) using a strategy combining in vitro, in silico, and in vivo approaches. Therefore, the main goal is to increase the detection sensitivity of the NPS use by focusing on the metabolites that are most often the major products of NPS elimination. For this purpose, an in vitro method designed to produce NPS metabolites using human liver microsomes incubations was applied. Obtained metabolites, after confrontation with metabolites in silico predicted, were saved in database. This approach was subsequently confronted with analysis of tablets or other non-biological product containing NPS, but also, with in vivo observed data from NPS exposure: intoxication cases, experimental studies and prospective and retrospective epidemiological studies in targeted population or not … All in all, this work based on this in vitro, in silico and in vivo strategy allowed me to enhance our high resolution spectra database (HRMS) for non-targeted screening and also our spectra database for targeted screening (MS/MS). Today, our HRMS device, with a database that was increased with 83 new NPS and 281 metabolites for the duration of my thesis, is an efficient analytical tool for NPS use detection.

Tuberculosis, the leading cause of death by a single infection disease caused by bacteria, requires long treatments and the bacteria are prone to develop drug resistance. Therefore, new efficient treatment regiments needs developing, which requires new tools for drug development. A major reason for discontinuance of a drug under development is undesired pharmacokinetic properties. Therefore, it is important to have early information of this, preferably the first time the drug is tested in animals. The first in vivo pharmacokinetic experiment is often done in mice and the only information present at this stage are often in vitro values and physicochemical properties. Physiological-based pharmacokinetic modelling can be used to extrapolate from in vitro to in vivo values. From this, the first in vivo pharmacokinetic experiment can be designed, often with the goal of reducing the amount of mice. This goal is one of the three R.s and it is called Reduction. To explore the Reduction of an experiment population pharmacokinetic modelling can be utilized via exploration of the imprecision, bias and probability of an informative experiment to evaluate if a design meets the goal of Reduction. In this report a recommendation of the first in vivo pharmacokinetic experiment is presented. This is based on in vitro values and physicochemical properties that are common in anti-tuberculosis drugs. If the probability of an informative experiment is critical, a terminal sampling of 40 mice is recommended. If imprecision and bias are necessary, zipper sampling of 10 mice is recommended.

Cardiovascular diseases are the leading causes of death worldwide and improved diagnostic methods are needed for early intervention and to select the most suitable treatment for patients. Currently, carotid artery plaque vulnerability is typically determined by visually assessing ultrasound B-mode images, which is influenced by user-subjectivity. Since plaque vulnerability is correlated to the mechanical properties of the plaque, quantitative techniques are needed to estimate plaque stiffness as a surrogate for plaque vulnerability, which would reduce subjectivity during plaque assessment. The work in this thesis focused on three noninvasive ultrasound-based techniques to quantitatively assess plaque vulnerability and measure arterial stiffness. In Study I, a speckle tracking algorithm was validated in vitro to assess strain in common carotid artery (CCA) phantom plaques and thereafter applied in vivo to carotid atherosclerotic plaques where the strain results were compared to visual assessments by experienced physicians. In Study II, hard and soft CCA phantom plaques were characterized with shear wave elastography (SWE) by using phase and group velocity analysis while being hydrostatically pressurized followed by validating the results with mechanical tensile testing. In Study III, feasibility of assessing the stiffness of simulated plaques and the arterial wall with SWE was demonstrated in an ex vivo setup in small porcine aortas used as a human CCA model. In Study IV, SWE and pulse wave imaging (PWI) were compared when characterizing homogeneous CCA soft phantom plaques. The techniques developed in this thesis have demonstrated potential to characterize carotid artery plaques. The results show that the techniques have the ability to noninvasively evaluate the mechanical properties of carotid artery plaques, provide additional data when visually assessing B-mode images, and potentially provide improved diagnoses for patients suffering from cerebrovascular diseases. / <p>Doctoral thesis in medical technology and medical sciences</p><p>QC 20160921</p>

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes. / Most RNA molecules have to adopt a complex tertiary structure to accomplish their biological functions. However, the important determinants of a polynucleotide chain that are required for its proper folding and its interactions with other elements are essentially unknown. The establishment of structure-function relationships in large RNA molecules goes inevitably through the analysis of each element of their structure separately and in context with other elements. Like a building, an RNA structure is built of repetitive pieces that are glued together in a specific way. These repetitive elements, instead of being bricks, are recurrent motifs. Recurrent RNA motifs are arrangements of nucleotides found in different parts of a tertiary structure and have identical or very similar conformations. Thus, a necessary step toward the understanding of RNA structure and function consists in the systematic identification of recurrent motifs, followed by their comparative analysis and establishment of their sequence consensus. The analysis of all instances of helical packing within the ribosome structure led to the identification of a new structural arrangement, named the along-groove packing motif (AGPM), which is found in 14 places of the ribosome structure as well as between the 23S ribosomal RNA and the transfer RNA molecules bound to the P and E sites. The motif is formed by the packing of two double helices via their minor grooves. The sugar-phosphate backbone of one helix goes along the minor groove of the other helix and vice versa. In each helix, the contact region includes four base pairs. The closest packing occurs in the center where one can often see a GU base pair packed against a WC base pair. While the presence of the central base pairs GU versus WC in the core of the motif enhances its stability, other alternatives are also present among available structures of the motif. A comparative analysis of three different combinatorial gene libraries of AGPM, in which the central base pairs were fully randomized, shows that the structural context influences the scope of nucleotide sequence variability of the central base pairs. The fact that the identity of the central base pairs can vary suggested that there are other determinants responsible of the motif’s integrity. Analysis of all other inter-helix contacts has shown that outside the center of the motif the interactions between backbones are made via three ribose-ribose contacts. Within each of these contacts, the riboses of the nucleotides that are in touch adopt particular positions in order to provide for collision-free interactions between them. We show that the position of these riboses is modulated by the specific base pair conformation in which it belongs. Finally, another recurrent arrangement that occurs within the structure of three cases of AGPM was identified and called the adenosine-wedge. Analysis has shown that the latter motif is itself composed of a smaller arrangement, called the NAG-triangle motif. We show that the adenosine-wedge motif represents a complex RNA arrangement composed of four repetitive elements, AGPM, the hook-turn, the A-minor and the NAG-triangle, which clearly illustrates the hierarchical organisation of the structure that could also occur in other RNA motifs as well. Altogether, my results enrich our general understanding of the role of different types of tertiary interactions in the formation of large RNA molecules.