Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui contrôlent l’expression génique, en s’hybridant, le plus souvent, de manière imparfaite à des séquences spécifiques qui se trouvent généralement dans la région non traduite en 3' (3’UTR) de transcrits cibles. Les miARN guident sur l’ARN messager (ARNm) un complexe protéique appelé RNA-induced Silencing Complex (RISC), composé des protéines Argonaute et TNRC6, qui perturbe l’initiation de la traduction et provoque la déadénylation et la dégradation du transcrit. C'est l’interaction entre le RISC et le complexe de pré-initiation de la traduction 43S (composé de la petite sous-unité ribosomique 40S et des facteurs d’initiation associés) qui entraîne la répression traductionnelle de l’ARNm ciblé. Des résultats récents ont démontré que le RISC perturbe le balayage de la région non traduite en 5’ (5’UTR) par le ribosome, étape qui requiert la présence de 2 facteurs d’initiation qui sont eIF4F qui reconnaît et lie la coiffe ainsi que la protéine PABP, fixée le long de la queue poly(A). Toutefois, les miARN peuvent également induire la stimulation de la traduction des transcrits cibles dans les cellules quiescentes, dans un lysat d’embryons de drosophiles ou encore dans les ovocytes de Xénope. Le mécanisme moléculaire de stimulation de l’expression par les miARN est encore mal connu mais requiert l’absence de queue poly(A) en 3’ des ARN cible et de TNRC6 au sein du complexe RISC. Le Virus de l’Hépatite C (VHC) possède en 5’ de son ARNg un site d’entrée interne du ribosome (IRES) qui recrute la petite sous-unité ribosomique 40S, sans nécessiter la reconnaissance de la coiffe par eIF4F, ni la protéine PABP, ni le balayage de la 5’UTR par le ribosome. Ces caractéristiques singulières nous ont conduits à rechercher l'impact du complexe RISC fixé en 3’ de l’ARNm sur l’initiation de la traduction du VHC. Pour cela, nous avons utilisé des transcrits contenant l'IRES du VHC en 5' et des sites d’hybridation du miARN let-7 en 3’. Ces ARNm ont ensuite été transfectés dans des lignées cellulaires hépatocytaires, ou non. A notre grande surprise, nous avons observé que la fixation du miARN let-7 sur la région 3' du transcrit stimulait fortement l’expression dirigée par l’IRES de VHC. Toutefois, l’augmentation de l’expression n’est pas due à la stabilisation du transcrit mais bien à une hausse significative de la synthèse protéique indépendamment d’un quelconque effet de miR-122. En utilisant d’autres IRES dites 'HCV-like', nous avons pu confirmer ces résultats et démontrer que, l’ajout d’une queue poly(A) en 3’ du transcrit, capable de fixer la PABP, annule cet effet stimulateur suggérant que l’absence de cette protéine est nécessaire pour que le complexe RISC stimule la traduction du VHC. / MicroRNAs (miRNAs) are small non coding RNAs which control gene expression by recognizing and hybridizing to a specific sequence generally located in the 3’UTR of targeted messenger RNA (mRNA). miRNAs serve as a guide for the RNA-Induced Silencing Complex (RISC) that is composed by, at least, the Argonaute proteins and TNRC6. Recent studies have suggested that translation inhibition occurs first and is then followed by deadenylation and degradation of the targeted transcript. The miRNA-induced inhibition of protein synthesis occurs at the level of translation initiation during the ribosomal scanning step and it requires the presence of both the initiation factor eIF4G and the poly(A) Binding Protein (PABP). In this process, the RISC interacts with both PABP and 43S pre-initiation complex (composed by initiation factors and ribosome) and it results in the disruption of linear scanning of the ribosome along the 5’ Untranslated Region (5’UTR). In some specific cases, the binding of miRNAs to their target sequences can upregulate translation initiation. This has notably been demonstrated in G0 quiescent cells, drosophila embryos and Xenopus oocytes. Although the molecular mechanism by which upregulation occurs remains to be precisely determined, it appears that the absence of a poly(A) tail and the lack of availability of the TNRC6 proteins are amongst the major determinants. In the particular case of the Hepatitis C Virus (HCV), the genomic RNA is uncapped and non polyadenylated and harbors an Internal Ribosome Entry Site (IRES) which directly binds to the ribosome with no need for cap-recognition, PABP binding and ribosome scanning. These peculiar features of the HCV IRES prompted us to investigate how viral translation can be regulated by the miRNA machinery. In order to do that, we have used a mRNA that contains the HCV IRES in 5’ and 4 let-7 binding sites in its 3’ extremity. To most of our surprise, we have observed a strong stimulation of the expression of the HCV IRES when the construct is bearing the let-7 sites. This effect is not due to any interference with the miR-122 binding sites although the magnitude of stimulation reached the same level. Our data show that it is the presence of the RISC on the 3' end of the transcript that can stimulate internal ribosome entry at the 5' end. By using other HCV-like IRESes, we could confirm these data and further showed that the absence of a poly(A) tail was an absolute requirement for the stimulation to occur. These effects are not due to an increase of mRNA stability and are rather exerted at the level of translation.

Ce projet de doctorat est aux prises avec un problème de ruptures en fatigue de un alliage de titane aéronautique en raison de haute fréquence chargement. Matériel pour cette enquête a été prise de compresseur du moteur disque de l'avion réel. Essais de fatigue à ultrasons ont été réalisées jusqu'à dépasser la limite de 1010 cycles. Cette région de la durée de vie est connu comme Gigacycle ou fatigue très grand nombre de cycles. Ce projet de thèse montre pour la première fois les résultats des tests de fatigue sur l'lliage de titane aéronautique VT3-1 dans la région Gigacycle. Les propriétés de fatigue de l'alliage de titane ont été déterminées à 109 cycles pour les conditions de chargement différentes: traction-compression, tension-tension et de torsion. Mécanismes d'initiation des fissures typiques ont été identifiés et des défauts critiques de microstructure ont été trouvés. L'effet de l'anisotropie en raison de processus de fabrication sur les propriétés de fatigue de l'alliage de titane VT3-1 forgé a été étudiée. Une influence du processus de fabrication sur les propriétés de fatigue a également été étudiée par comparaison les résultats sur extrudé et forgé VT3-1 alliage de titane. La nouvelle machine de torsion à ultrasons a été conçu et installé pour la longue durée de vie (jusqu'à 1010 cycles) de tests de fatigue en rotation. Les premiers résultats sous la chargement en torsion ultrasons ont été obtenues pour l'alliage de titane réalisé par extrusion et technologies forgés. / This PhD project is dealing with a problem of fatigue failures of aeronautical titanium alloy due to high frequency loading. The material for investigation was taken from the real aircraft engine compressor disk. Ultrasonic fatigue tests were carried out up to outrun limit of 1010 cycles. This region of lifetime is known as Gigacycle or very high cycle fatigue. This PhD project shows for the first time the results of fatigue tests on the VT3-1 aeronautical titanium alloy in the Gigacycle region. The fatigue properties of the titanium alloy were determined at 109 cycles for different loading conditions: tension-compression, tension-tension and torsion loading. Typical crack initiation mechanisms were identified and critical defects of microstructure were found. The effect of anisotropy due to fabrication process on the fatigue properties of the forged VT3-1 titanium alloy was studied. An influence of technological process on fatigue properties was also studied by comparison the results on extruded and forged VT3-1 titanium alloy.The new ultrasonic torsion machine was designed and installed for the long life (up to 1010 cycles) fatigue tests under rotation. The first results under ultrasonic torsion loading were obtained for the titanium alloy made by extrusion and forged technologies.

Text has abstracts in English and isiNdebele languages / This study focused on the naming and praises of amasokana (initiates) among the South African amaNdebele during and after the initiation process. An explanation is offered as to why amasokana of amaNdebele use Sepedi names instead of isiNdebele names during their transition from boyhood to manhood. Using critical language awareness, this study examined names and praises based on the cultural and traditional poetic forms recited by the amasokana during their homecoming ceremonies when they are introduced to their community by their post-initiation names. This is a case study that made use of interviews and observations as instruments to acquire data about the naming practices and praises of the amasokana of the amaNdebele. The research aims to make a meaningful contribution to the recording and preservation of the indigenous names of amasokana and their praises for posterity and to sustain cultural identity and the quintessential elements of humanity. / Irhubhululo leli linqophe ekuthiyweni kwamabizo kanye neembongweni zamasokana wamaNdebele eSewula Afrika ngesikhathi nangemva kwengoma. Isendlalelo siqale khulu ekutheni kubayini amasokana wamaNdebele asebenzisa amabizo weSepedi esikhundleni samabizo wesiNdebele ngesikhathi lokha nakasuka ebusaneni aya ebudodeni. Kilelirhubhululo, kuhlolwe amabizo kanye neembongo ngokuqalisa eendleleni ezibukondlo zangokwesiko kanye nomkhuba wokubonga kwamasokana nakagodukako lokha nakazazisa ngamabizo wabo wobusokana. Ngalokho- ke amabizo wendabuko wamasokana kanye neembongo kufanele kurekhodwe, kubulungwe ukuze kubulungwe ubunjalo besiko kanye neengcenye eziqakathekileko zobuntu. / African Languages / M.A. (African Languages)

L’œuvre de JMG Le Clézio se caractérise par sa perpétuelle évolution. Elle échappe aux classifications génériques et maintient son statut subversif et indépendant. L’écriture de cet écrivain traduit les diverses influences qui l’ont marqué, les problèmes auxquels il fait face et la thématique majeure dans laquelle il inscrit son œuvre. À travers l’étude de La quarantaine, paru en 1995, nous essayerons lors du premier chapitre de comprendre comment Le Clézio réinvente son écriture pour remédier au problème de l’impureté du langage qui caractérisait son œuvre d’avant les années quatre-vingts. Dans le deuxième chapitre, nous analyserons les thématiques littéraire, familiale et historique qui font de cet ouvrage un roman de filiation. La quarantaine insiste sur l’importance de l’altérité traditionnelle et non occidentale en tant que facteur dans ce changement romanesque, et dont le mode de vie réfléchit différemment le problème de l’identité chez l’individu occidental. Dans le troisième chapitre, nous aborderons la question des enjeux de l’identité à travers l’expérience initiatique à laquelle se livre le protagoniste de La quarantaine en quête d’un devenir identitaire, d’une émancipation qui réconcilie l’individu moderne avec soi-même. / The work of JMG Le Clézio can be characterised by its perpetual evolution. It defies standard classification, maintaining a subversive and independent status. This writer’s work reflects a diversity of influences that have marked him, the challenges he has faced, and the major themes in which he has set his writing. In the first chapter examining the 1995 publication, La quarantaine, we will discuss Le Clézio’s reinvention of his own writing, in order to resolve the problem of impurities in the language that characterized his earlier work, prior to the 1980s. In the second chapter of this study, literary, familial and historic themes that mark this novel as a “filiation story” will be analysed. This shift in literary style is demonstrated in La quarantaine by its insistence on the importance of the “other,” traditional people of non-western culture; their lifestyle prompts reflection on the identity crisis of the western individual. In the third chapter of this study we will address the identity issues raised in Le Clézio’s novel through an initiation experience in which the protagonist in La quarantaine is engaged at a time of significant rebirth in his life. His quest is for self-actualisation, for an emancipation that will serve to reconcile the modern individual with himself.

Pour comprendre les différents rôles que joue la Télémachie dans l’Odyssée d’Homère, il faut explorer à fond le thème de l’identité. La structure de la Télémachie et les rôles accessoires qu’elle joue dans l’Odyssée contribuent à définir l’identité de Télémaque et celle d’Ulysse. À la fin du poème, même si Télémaque a intériorisé et accepté son origine filiale, son rôle social et l’identité qui y est associée sont laissés indéterminés au moment du retour de son père et en sont même la conséquence. Cela peut expliquer le manque de consensus chez les auteurs modernes en ce qui a trait au développement de Télémaque, ou à son statut social et héroïque (i.e. épithète, maturité, etc.). La Télémachie agit à titre d’élément déclencheur de l’initiation de Télémaque dans la vie héroïque mais le processus qui se poursuit, à la fin de l’Odyssée, y est laissé incomplet. L’étape finale, l’incorporation, durant laquelle la communauté reconnaît la nouvelle identité de Télémaque en tant que héros et adulte, prêt à assumer de plus grandes responsabilités, n’est pas présentée dans l’œuvre d’Homère. / One can understand the various functions of the Telemacheia within the Odyssey only by taking into consideration the identity theme. The structure of the Telemacheia and the accessory functions it plays within the Odyssey contribute to defining Telemachus’ own identity as well as Odysseus’. At the end of the poem, even though Telemachus has internalized and accepted his filial origin, his social role and identity are left undefined at the moment of his father’s return and as a consequence thereof. This may explain the lack of consensus among scholars with regard to Telemachus’ development, or social and heroic status (i.e. epithet, maturity, etc.). The Telemacheia triggers Telemachus’ initiation into heroic life but the process is left incomplete. The final step, incorporation, during which everyone recognizes Telemachus’ new identity as a hero and adult, ready to assume higher responsibilities, is not enacted by the poem.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the causative agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Viral strains that are resistant to antiretroviral agents used for the treatment of HIV-1 infected patients rapidly emerge. It is thus important to study the viral replication cycle in order to discover new targets for the development of novel agents against HIV-1. Translation of structural proteins and viral enzymes is a key step of the viral replication cycle. These proteins are translated from the HIV-1 full-length mRNA during late stages of the replication. This mRNA can be translated by a cap-dependent mode which is used by the majority of cellular mRNAs. However, since its 5’ untranslated region (5’UTR) contains an internal ribosome entry site (IRES) that we call IRES5’UTR, it can also be translated by an IRES-dependent mode. The IRES-dependent mode enables the full-length mRNA to be translated when the cap-dependent mode is impaired. The activity of the IRES5’UTR is weak in physiological conditions, but it is stimulated when the cell cycle is arrested at the G2/M transition, an arrest induced by HIV-1 infection. A large portion of this IRES, which we name IRES5’UTRc, is present in all HIV-1 mRNAs and its activity is similar to the activity of the complete IRES, which indicates that the IRES-dependent mode can be used by all HIV-1 mRNAs. During my doctoral studies, I investigated how the HIV-1 IRES5’UTR functions. I transfected Jurkat T cells, a lymphocytic cell line derived from the natural target cells of HIV-1, with a dual-luciferase reporter containing the coding sequences of the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) separated by the complete 5’UTR of the HIV-1 full-length mRNA. Translation of Rluc is cap-dependent while translation of Fluc depends on HIV-1 IRES5’UTR. First, I performed a mutational analysis and I discovered three regions that stimulate the activity of IRES5’UTR and a stem-loop that represses its activity, which we named IRENE (IRES negative element). I showed that the repression induced by IRENE is relieved when cells are exposed to oxidative stress, a type of stress caused by HIV-1 infection. We propose that IRENE maintains the IRES5’UTR in a weakly active conformation in physiological conditions. It is known that IRESes are activated by cellular factors, called ITAFs (IRES trans-acting factors). We propose that the IRES5’UTR adopts an active conformation triggered by the binding of an ITAF that is expressed or relocalized during oxidative stress. These results generated a publication (Gendron et al. Nucleic Acids Research, 2011, 39, 902-912). I then decided to study the effect of the viral protein Tat on the IRES5’UTR activity. In addition to its essential role in the transcription of HIV-1 mRNAs, Tat stimulates the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs by interfering with the inhibition of a canonical initiation factor, eIF2, induced by the protein kinase modulated by double-stranded RNA (PKR) and by unwinding the TAR structure present at the 5’end of all HIV-1 mRNAs. Tat also affects the expression of several cellular genes. I showed that the Tat86 and Tat72 isoforms, but not Tat101, stimulate the activity of the IRES5’UTR. This effect is independent of PKR and TAR, but appears to be dependent upon the conformation of Tat. We suggest that Tat could activate a transcription factor that controls the expression of an ITAF of the IRES5’UTR or else that Tat could directly activate such an ITAF. I also showed that PKR stimulates the IRES5’UTR activity, which is surprising since PKR is an antiviral protein. This effect is independent of the inhibition of eIF2 by PKR and could result from the activation of an ITAF. Knowing that IRES5’UTRc, an active portion of IRES5’UTR is present in all HIV-1 RNAs, our hypothesis is that the stimulation of the IRES activity by PKR would allow Tat mRNA to be translated in the beginning of the replication cycle. This would subsequently allow the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs to proceed, which is stimulated by Tat. These results generated a manuscript that is submitted for publication to RNA. Altogether, my results, coupled to data from literature, lead me to conclude that, in the late phases of the replication cycle, the activity of the HIV-1 IRES5’UTR is stimulated by oxidative stress, by the cell cycle arrest in G2/M and by the presence of high amounts of Tat, while cap-dependent translation is impaired. The IRES5’UTR would thus be critical to translate the HIV-1 full-length mRNA. Consequently, the IRES5’UTR would constitute a very interesting target for the development of novel anti-HIV agents.

Translation initiation is a complex process which results in the assembly of the elongation competent 80S ribosome from the 40S and 60S ribosomal subunits, the initiator tRNA and mRNA, and is orchestrated by numerous eukaryotic initiation factors (eIFs). Although it represents one of the most regulated processes of gene expression, the exact mechanism of one of the key steps of translation initiation - mRNA recruitment to the 43S pre-initiation complex (PIC) - is still only poorly understood. Recent studies indicated that besides eIF4F and poly(A)-binding protein, also eIF3 might play an important, if not crucial, role in this step. In our laboratory, we recently identified a 10 Ala substitution (Box37) in the a/TIF32 subunit of Saccharomyces cerevisiae eIF3, which interfered with translation initiation rates. Detailed analysis showed that this mutation significantly reduces the amounts of model mRNA in the gradient fractions containing 48S PICs as the only detectable effect in vivo. Moreover, a recently solved crystal structure of the N-terminal part of a/TIF32 pointed to two Box37 residues, Arg363 and Lys364, both proposed to contribute to one of the positive, potentially RNA-binding areas on the a/TIF32 surface. The fact that also their substitutions with alanines severely impaired the mRNA recruitment...

Les microARN jouent un grand rôle dans la régulation de l'expression des gènes bien que leur mécanisme d'action soit encore sujet à débat. Des premières études chez le vers C. elegans aux différents systèmes in vitro qui ont ensuite été développés, plusieurs modèles ont été proposés, comme l'inhibition de la traduction au niveau de l'initiation ou de l'élongation, et la déstabilisation du transcrit par déadénylation. Cependant, à la lumière des découvertes récentes, un consensus semble apparaître et indique que les miARN inhiberaient d'abord la traduction avant d'induire la déadénylation du transcrit, provoquant ainsi sa dégradation prématurée. D'autre part, le blocage traductionnel semble impliquer à la fois la coiffe en 5' et la queue poly(A) en 3' de l'ARNm ainsi que les facteurs qui s'y lient, c'est à dire le facteur d'initiation de la traduction eIF4F et la Poly(A) Binding Protein (PABP). Ces résultats ont conduit au modèle selon lequel, les miARN seraient capables d'empêcher la liaison entre ces deux facteurs et donc la circularisation du transcrit qui est essentielle à la fois au recrutement de la machinerie traductionnelle et à la stabilité de l'ARNm. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, notre laboratoire a développé un système in vitro basé sur l'utilisation du lysat de réticulocytes de lapin qui permet d'étudier l'effet traductionnel des miARN en s'affranchissant de dégradation du transcrit. L'étude de l'effet de drogues et d'enzymes virales, capables de bloquer spécifiquement la fonction de chaque facteur d'initiation dans ce système, a permis de déterminer le rôle clé de eIF4G et PABP dans l'inhibition traductionnelle par les miARN. Cependant, leur interaction n'est pas requise et le blocage s'effectue plutôt au cours de l'étape de balayage de la région 5' non codante par la petite sous-unité ribosomique. En parallèle de cette étude in vitro, un travail sur des lignées cellulaires a permis de déterminer l'influence de la queue poly(A) sur l'effet miARN. De façon très surprenante, l'expression des transcrits non polyadénylés n'est plus inhibée et est même stimulée par les miARN. Cet effet est dépendant de l'association du domaine MIF4G du facteur eIF4G avec le facteur eIF3, ce qui suggère qu'en l'absence de queue poly(A), les miARN seraient capables de stimuler le recrutement de la petite sous-unité ribosomique sur l'ARNm. L'ensemble de ces résultats révèle la complexité de l'effet miARN sur la traduction et ouvre de nouvelles voies / The mechanism by which microRNAs (miRNAs) can control gene expression has been a great matter of debate. From the first studies in worm to the in vitro systems that are used today, many models have been proposed that include regulation at the level of translation or at the level of mRNA stability by controlling 3' deadenylation and decay. Recent studies provided a consensus model of all these discrepancies and suggested that translation inhibition occured first and is followed by deadenylation and further degradation of the target transcript. Moreover, translation silencing seems to occur at the initiation level, and requires eIF4F and PABP initiation factors. This led to the hypothesis that miRNAs could interfere with the interaction between these two factors thus affecting the circularisation of the mRNA, which is essential for translation efficiency. In order to gain insight into this mechanism, we have used an in vitro system based on the rabbit reticulocyte lysate that fully recapitulates miRNA effects on translation with virtually no effect on deadenylation and decay. Using this system and a wide spectrum of translational inhibitors, we have narrowed down the step of initiation at which repression is exerted and we found that miRNAs affect mainly ribosomal scanning. This effect requires the presence of both eIF4G and PABP but does not rely on their physical interaction. Further analysis of miRNA repression in cells revealed that the poly(A) tail was an absolute requirement for miRNA action. To most of our surprise, we observed that removal of the poly(A) resulted in a shift from repression to stimulation of mRNA expression. This effect seems to require the middle domain of eIF4G and the presence of the Ago proteins. Altogether, these results reveal the complexity of miRNA effect and open new prospects on translation regulation

Chez les mammifères l’initiation de la traduction et, plus particulièrement, la formation du complexe eIF4F, est principalement régulée par la protéine kinase TOR (Target of rapamycin). Cette voie de régulation fait intervenir les protéines 4E-BP (eIF4E-binding proteins) dont l’activité est modulée par la phosphorylation par TOR. Sous leur forme non-phosphorylée, les 4E-BP se lient au facteur d’initiation eIF4E, empêchent son recrutement dans le complexe eIF4F et inhibent ainsi l’initiation de la traduction. Phosphorylées par TOR, les 4E-BP perdent leur affinité pour eIF4E et sont remplacées par eIF4G ce qui active la traduction. La régulation de l’initiation de la traduction par TOR via 4E-BP a été bien décrite dans plusieurs modèles eucaryotes, tels que la levure, les insectes et les mammifères, mais reste encore obscure chez les plantes. Les recherches réalisées au cours de ma thèse ont permis l’identification de deux protéines homologues de 4E-BP chez Arabidopsis. Ces protéines, que nous avons appelées ToRP1 et ToRP2 (TOR Regulatory Proteins), sont caractérisées par la présence d’un motif consensus indispensable pour la liaison à eIF4E, et qui existe chez les protéines 4E-BP des mammifères ainsi que chez eIF4G et eIFiso4G d’Arabidopsis. La protéine ToRP1 est capable d’interagir spécifiquement avec eIF4E, mais aussi avec TOR via son extrémité N-terminale en système double-hybride de levure. ToRP1 et ToRP2 ont également été caractérisées comme étant des cibles directement phosphorylées par TOR chez Arabidopsis. Deux sérines, en position 49 et 89 dans la protéine ToRP1, ont été identifiées comme des sites potentiels de cette phosphorylation. De plus, l’état de phosphorylation de ces sites affecte l’interaction avec eIF4E en système double-hybride de levure. Par ailleurs, des plants d’Arabidopsis déficients en ToRP1 et ToRP2 renforcent la traduction strictement coiffe-dépendante de l’ARNm CYCB1;1, alors que la surexpression de ToRP1 ou de ToRP2 réprime sa traduction. Ces résultats suggèrent donc que les protéines ToRP, identifiées chez Arabidopsis, sont de nouvelles cibles directes de TOR, qui, par leur phosphorylation, régule l’initiation de la traduction coiffe-dépendante. / The target of rapamycin (TOR) is an evolutionarily conserved kinase that is a critical sensor of nutritional and cellular energy and a major regulator of cell growth. TOR controls cap-dependent translation initiation, in particular the assembly of the eIF4F complex, by modulating the activity of eIF4E-binding proteins (4E-BPs). In their unphosphorylated state 4E-BP proteins sequester eIF4E and repress translation. Upon phosphorylation by TOR, 4E-BPs have a low affinity binding to eIF4E and are replaced by eIF4G thus activating translation initiation. 4E-BPs have been discovered in yeast and mammals but remain to be obscure in plants. Here, we identified and characterized two Arabidopsis proteins termed TOR Regulatory Proteins (ToRPs 1 and 2) that display some characteristics of mammalian 4E-BPs. ToRP1 and ToRP2 contain a canonical eIF4E-binding motif (4E-BM) found in mammalian 4E-BPs and Arabidopsis eIF4G and eIFiso4G. ToRP1 interacts with eIF4E, and, surprisingly, the N-terminal HEAT domain of TOR in the yeast two-hybrid system. ToRP1 and ToRP2 are highly phosphorylated at several phosphorylation sites in TOR-dependent manner in planta. Two of these phosphorylation sites have been identified as—S49 and S89—their phosphorylation status modulates ToRP1 binding to eIF4E in the yeast two-hybrid system. In plant protoplasts, ToRP2 can function as translation repressor of mRNAs that are strictly cap-dependent. Our results suggest that ToRPs can specifically bind the Arabidopsis cap-binding proteins (eIF4E/eIFiso4E) and regulate translation initiation under the control of TOR

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