Os projetos genoma têm fornecido uma grande quantidade de informação sobre a arquitetura gênica e sobre a configuração física de suas respectivas regiões flanqueadoras (RF). Estas RF contêm informações com o potencial de auxiliar na elucidação de vários processos biológicos, como os mecanismos de expressão gênica e de sua regulação. Estes mecanismos são de extrema importância para a compreensão do correto funcionamento dos organismos e das patologias que os afetam. Uma parte significativa dos mecanismos de controle de expressão gênica atuam na fase transcricional. Na base destes mecanismos está o recrutamento de proteínas que se ligam às regiões promotoras da transcrição, as quais são segmentos específicos de DNA que podem estar localizados tanto próximos à região de início da transcrição (TSS) quanto a centenas ou até a milhares de pares de bases dela. Essas proteínas compõem a maquinaria transcricional e podem ativar ou inibir o processo de transcrição. Experimentalmente, os segmentos regulatórios podem ser identificadas utilizando métodos complexos de biologia molecular, tais como SELEX, ChiP-ChiP, ChIP-Seq, dentre outros. Uma estratégia alternativa aos métodos experimentais é a utilização de metodologias computacionais. Análises computacionais tendem a ser mais rápidas, baratas e flexíveis do que protocolos experimentais, além de poderem ser utilizadas em larga escala. Atualmente, os métodos computacionais disponíveis necessitam de informações experimentais para a definição de padrões globais de preferências de sequências de DNA para a ligação de fatores de transcrição (TFBS, em inglês transcription factor binding sites). Entretanto, esses métodos apresentam uma elevada taxa de falso positivos e, por vezes, apresentam também taxas significativas de falso negativos, além de serem limitados ao estudo de fatores de transcrição de espécies bem conhecidas, o que diminui a área de aplicação dos mesmos. Diante deste cenário, o uso de métodos computacionais que não necessitem da informação referente aos sítios de ligação, bem como os que utilizem parâmetros mais robustos de detecção dos resultados, em detrimento dos escores de pontuação provindos de alinhamentos, podem acrescentar uma sensível melhoria ao processos de predição de regiões regulatórias. Neste projeto, foi desenvolvido um novo modelo computacional (TFBSAnalyzer) para análise e identificação de TFBS em elementos regulatórios, que utiliza técnicas de modelagem molecular para a construção de complexos entre um fator de transcrição ancorado a estruturas de DNA com sequências variáveis de bases e, através de cálculos termodinâmicos de entalpia de ligação, determina uma função de pontuação baseada na energia de ligação e realiza a predição de sítios de ligação ao DNA para o fator de transcrição em análise. Esta abordagem foi testada com três fatores de transcrição como sistemas-modelo, pertencentes à família dos receptores nucleares, a saber: o receptor de estrógeno ER-alfa (Estrogen Receptor Alpha), o receptor de ácido retinoico RAR-beta (Retinoid Acid Receptor Beta) e o receptor X retinóico RXR (Retinoid X Receptor). Os modelos previstos computacionalmente foram comparados aos dados experimentais disponíveis para estes receptores nucleares, os quais apresentaram as seguintes taxas de FP/FN: 10%/0 para RAR-beta e RXR, 21%/6% para ER-alfa. Também simulamos um experimento de ChIP-seq do ER-alfa no genoma humano, cujos genes selecionados foram submetidos a uma análise de enriquecimento de fatores de transcrição curados experimentalmente, que fazem sua regulação, revelando que o receptor de estrógeno está realmente envolvido no processo. Para mostrar a aplicabilidade geral de nosso método, nós modelamos a distribuição de energia de ligação para o receptor NHR-28 isoforma a de Caenorhabditis elegans com DNA . Obtivemos distribuições de energia semelhantes àquelas encontradas para os NRs modelos, portanto seria possível aplicar o método para buscar possíveis TFBSs para este receptor no genoma de C. elegans. Os dados gerados e as metodologias desenvolvidas neste projeto devem acrescentar uma sensível melhoria aos processos de predição de regiões regulatórias e consequentemente auxiliar no entendimento dos mecanismos envolvidos no processo de expressão gênica e de sua regulação. / The genome projects have provided a lot of information about the genetic architecture, as well as on the physical configuration of their flanking regions (FR). These FR have the potential to aid in the elucidation of many biological processes, such as the mechanisms involved in gene expression and its regulation. These mechanisms are extremely important for undeerstanfind the correct functioning of organisms as well as the pathologies that affect them. A significant part of the control mechanisms of gene expression act during transcription. On the basis of this mechanisms is the recruitment of proteins that bind to promoter regions of transcription, which are specific segments of DNA that can be located either near the transcription start site or at hundreds or even thousands of base pairs away. These proteins form the transcription machinery, which can activate or inhibit the transcription process. The regulatory segments can be identified experimentally using complex methods of molecular biology, such as SELEX, ChIP-chip, ChIP-seq, among others. An alternative strategy to these experimental methods is the use of computational methodologies for predicting regulatory regions. Computational analysis tend to be faster, cheaper and more flexible than the experimental protocols, and can be used on a larger scale. Currently, the available computational methods require information previously obtained from experiments in order to define global standards of preference of DNA-Binding sequences for transcription factors (TFBS - Transcription Factor Binding Sites). However, these methods have a high rate of false positives and sometimes also have significant rates of false negatives, besides being limited to the study of transcription factors of well-known species, which decreases their application area. In this scenario, the use of computational methods that do not require previous information concerning the binding sites and use more robust parameters of results detection, instead of alignment scores, may add significant improvement to the processes of predicting regulatory regions. In this project, we developed a new computational model TFBSAnalyzer) for analysis and identification of regulatory elements using molecular modeling techniques for the construction of complexes between a transcription factor bound to specific DNA structures with variable sequences of bases and, by means of thermodynamic calculations of bond enthalpy, provides a scoring function based on the binding energy and predicts the DNA binding sites for the transcription factor in analysis. This approach was tested initially with three transcription factors as models, belonging to the nuclear receptor family, namely estrogen receptor ER-alpha (Estrogen Receptor Alpha), the retinoic acid receptor RAR-beta (Retinoid Acid Receptor Beta) and the retinoic X receptor RXR (Retinoid X Receptor). The computationally predicted models were compared to experimental data available for these nuclear receptors, and presented the following rates of FP/FN: 10%/0 for RAR-beta and RXR, 21%/6% for ER-alpha. We also simulated an experiment of ChIP-seq with ER-alpha with the human genome, where the selected genes were subjected to a transcription factor enrichment analysis, with curated information, revealing that the estrogen receptor is indeed involved in their regulation. To show that our method has a general applicability, we modeled the binding energy distribution for the NHR-28 receptor, isoform a, from Caenorhabditis elegans. The energy distributions obtained were similar to the ones obtained for the model NR, so it would be possible to use the method and search for possible TFBS in the C. elegans genome. The data generated and the methodologies developed in this project should add a significant improvement to the prediction processes of regulatory regions and, consequently, help to understand the mechanisms involved in the gene expression process and its regulation.

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando, sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical, particularmente áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 95% dos acidentes ofídicos, enquanto o segundo gênero apresenta alta taxa de morbidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops contem fosfolipases A2 ácidas que causam uma considerada mionecrose e severas reações anticoagulantes. De outro lado, os venenos das serpentes do gênero Crotalus possuem o complexo crotoxina, o qual é formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (PLA2 catalítica) que possui potente ação neurotóxica. As serpentes peçonhentas, grupo que inclui ambas as famílias citadas, utilizam esse veneno tanto para a captura de sua presa como para sua própria defesa. Inevitavelmente, essas serpentes terão contato com o seu próprio veneno, como por exemplo, na alimentação, pois as presas estarão envenenadas. Por tal fato, as serpentes peçonhentas apresentam alguns mecanismos de defesa, inclusive algumas proteínas encontradas em seu sangue que são chamadas de proteínas inibitórias de PLA2 (PLIs). Para entender melhor o mecanismo de inibição desses compostos plasmáticos, foi desenvolvido neste trabalho um novo protocolo de docking molecular que consiste em analisar as estruturas ao longo dos modos normais, docking molecular, simulação de dinâmica molecula... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, snake envenomation is a public health issue that mostly affects tropical and subtropical regions, particularly rural areas of countries from Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, the Bothrops and Crotalus snake genre are responsible for approximately 95% of all snake bites, and the accidents caused by the latter have a relatively high mortality rate. The venom of Bothrops snakes contains a acid phospholipases A2 that causes drastic local myonecrosis and several anticoagulant reactions. On the other hand, the Crotalus genus snake venom contains the the crotoxin complex, which is formed by crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic PLA2), that have up a strong neurotoxic action. Venomous snakes, including the two afore mentioned genre, use their venoms for capturing their prey and for their own defense. These snakes will inevitably get in contact with their own venom, for example, in alimentation, for the prey itself will be poisoned. For this fact, the poison snakes features in your blood the so-called PLA2 inhibiting proteins (PLIs). In order to understand the inhibition mechanism of these plasmatic components, it has developed in this study a new molecular docking protocol that consists in analyzing the structures using normal modes, molecular docking, molecular dynamics simulation and other bioinformatics tools. The results of this work was the proposition of a new flexible molecular docking protocol between two or more proteins and your... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

Ácidos graxos são moléculas hidrofóbicas essenciais para a composição da estrutura física celular, para o metabolismo energético dos seres vivos e também para os caminhos de sinalização molecular no proteoma celular. No caso de deficiência no ácido graxo docosahexaenóico (DHA) e do ácido eicosapentaenoico (EPA) temos a depressão e a mudança do comportamento. O transporte destas moléculas hidrofóbicas no citosol celular é realizado por uma família de proteínas capazes de se ligar a esses ácidos graxos de maneira seletiva, com alta afinidade e de forma reversível. Esta família de proteína é conhecida como FABP, ou proteínas ligantes de ácido graxo. Para realizar esta função, as FABP possuem características únicas tanto na sua estrutura tridimensional quanto na dinâmica experimentada pelos vários elementos estruturais. Diversos trabalhos identificaram regiões relevantes e, com mutações realizadas em resíduos específicos, caracterizaram o mecanismo como a proteína interage com ligantes e com a bicamada lipídica para a realização da sua função, identificando um processo multi-estágio na interação com a bicamada lipídica. Contudo, a não realização de mutações em todos os resíduos da proteína pode deixar não-identificados regiões ou resíduos da proteína também envolvidos na sua função. Além disso, nunca foi caracterizado o que ocorre com os resíduos e com a estrutura da FABP quando a proteína está complexada com uma bicamada lipídica. No presente trabalho, escolhemos a B-FABP para estudar a interação com ligantes e o complexo proteína-membrana desta família de proteínas. Para isto, as técnicas de ressonância magnética nuclear 15N-HSQC e eletrônica (RMN e RPE) foram utilizadas para acompanhar mudanças estruturais e dinâmicas ocorridas quanto de interações moleculares. Com a técnica de RPE e o uso de derivados de ácidos graxos marcados com radicais nitróxidos, monitoramos o sítio de ligação da molécula de ácido graxo e suas alterações quando na presença do surfactante SDS. No caso de RMN, foi usada em proteínas marcadas isotopicamente com 15N na presença de bicelas isotrópicas de DMPC: DHPC na razão igual a um (q = 1), em uma concentração lipídica (CL) de 4%. Nossos resultados além de identificar os mesmos resíduos já conhecidos na interação da FABP com modelos de membrana, também encontrou novos resíduos nunca antes associados à superfície de contato da FABP com a bicamada lipídica. / Fatty acids are hydrophobic molecules essential to the cell structure, to the energetic metabolism of living organisms and to the molecular signaling pathways in the cell proteome. Depression and behavior alteations are two common consequences of deficiencies in docosahexanoic (DHA) and eicosapentaenoic (EPA) acids. The transport of such hydrophobic molecules in the cytosol is the main function of a family of proteins capable of making a selective, high affinity, and reversible binding of fatty acids. This family of proteins is known as FABPs (fatty acid binding proteins). To perform their function, FABPs have unique features in both their tridimensional structure and in the dynamics experienced by the several structural elements. Many reports have identified regions that are relevant to function and, through point mutations of specific residues, have characterized the mechanism used by the protein to bind its ligand and also to interact with lipid bilayers. However, the point mutation strategy relies heavily on the choice of residues such that missing residues can lead to the lack of identification of important elements involved in protein function. Moreover, the characterization of the protein-bilayer complex still deserves a more detailed investigation. In this work, we study the B-FABP protein in terms of its interaction with ligands as well as a membrane model system. We made use of magnetic resonance techniques, nuclear (NMR) and electronic (EPR), to probe structural and dynamical changes occurring upon intermolecular interaction. EPR and spin labeled fatty acids allowed us to monitor the ligand binding site in the protein structure and also its alterations in the presence of the surfactant SDS. NMR HSQC was used to gain information on the conformational changes of isotopically labeled protein in the presence of biceles made of DMPC:DHPC (q = 1 and lipid concentration CL of 4%). Our results confirmed relevant functional residues that had been previously identified and also pointed to new residues that had not been implicated as part of the contact surface before, thus widening our understanding of FABP-bilayer interaction.

Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) pertencem à superfamília de receptores nucleares que funcionam como fatores transcricionais. Eles exercem um papel fundamental em processos que envolvem, principalmente, o metabolismo lipídico, em resposta à ativação por ligantes naturais e sintéticos como os ácidos graxos e os fibratos, respectivamente. A crescente descoberta de importantes funções fisiológicas, coordenadas pelos PPARs, e a necessidade de se conhecer como os agonistas, atualmente disponíveis, atuam nesses receptores, têm incitado pesquisas que vislumbram sua melhor exploração nos tratamentos de doenças metabólicas e inflamatórias, minimizando os efeitos adversos de ativações suprafisiológicas. Nesse cenário, o presente trabalho buscou compreender melhor as bases estruturais envolvidas nas funções atribuídas aos PPARs e explicar como as interações com seus ligantes ocorrem. Para isso, foram realizadas a subclonagem do domínio de ligação ao ligante do PPARα, sua expressão e purificação, seguidas de ensaios cristalográficos e biofísicos, além da abordagem de testes funcionais. Uma vez que a formação de oligômeros está relacionada à funcionalidade desses receptores, foram abordados estudos de oligomerização dos PPARs α e γ, compreendendo tanto o processo de homo- quanto o de heterodimerização. Os ensaios de cristalização do hPPARα LBD complexado a ligantes naturais e sintéticos, resultaram em estruturas cristalográficas que permitiram a identificação dos resíduos envolvidos no reconhecimento dos ligantes e a caracterização de sítios de ligação nunca antes descritos. A presença de ligantes nessas regiões afeta a conformação da proteína e, consequentemente, a modulação de sua função e o recrutamento da maquinaria transcricional. Adicionalmente, as estruturas cristalográficas da proteína complexada a ácidos graxos auxiliaram na compreensão de como essa importante classe de ligantes naturais possui efeitos farmacológicos similares aos de ligantes sintéticos. Esses resultados têm imediato impacto na procura racional de agonistas para esses receptores e se inserem em uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de endocrinologia molecular. / The peroxisome proliferation-activated receptors (PPARs) belong to the nuclear receptors superfamily, acting as transcriptional factors. They play a key role in processes involving essentially lipid metabolism in response to activation by natural and synthetic ligands such as fatty acids and fibrates, respectively. The rising discovery of important physiological functions coordinated by PPARs and the necessity to know how the currently available agonists act on these receptors, have encouraged researches envisioning a better receptor exploration in the treatment of metabolic and inflammatory diseases, minimizing the adverse effects of supraphysiological activations. In this scenario, the present study aimed to better understand the structural basis involved in PPARs functions and elucidates how the interactions with their ligands takes place. For this, the ligand-binding domain of PPARα was subjected to subcloning, expression and purification steps, followed by crystallographical and biophysical assays, in addition to functional testing approaches. Since the degree of oligomerization is related to the functionality of these receptors, oligomeric studies of PPARs α and γ oligomerization were also achieved, comprising both homo- and hetero-dimerization. The co-crystallization assays of hPPARα LBD complexed with natural and synthetic ligands resulted in crystallographic structures that allowed the identification of residues involved in ligand recognition and the characterization of novel binding sites. The presence of ligands in these regions affects the conformation of the protein and thereby modulates their function and transcriptional machinery recruitment. Additionally, the crystallographic structures of the protein complexed to fatty acids were valuable for the understanding of how this important class of natural ligands has similar pharmacological effects to those of synthetic ligands. These results have direct impact on rational agonists design to these receptors and are inserted in a perspective of scientifical promotion and technological development in the field of molecular endocrinology.

A proteína Cdc42 (Cell Division Cycle 42) é um membro da família das Rho GTPases, sinalizadores intracelulares conhecidos pelo seu papel na regulação do citoesqueleto. Essa proteína e capaz de ciclar entre um estado ativo (ligado à GTP) e um estado inativo (ligado à GDP) e essa ativação é modulada por diversas proteínas, conhecidas como GEFs (guanine nucleotide-exchange factors), GAPs (GTPase-activating proteins) e GDIs (guanine nucleotide-dissociation inhibitors). Trabalhos recentes têm demonstrado um papel de Cdc42 na apoptose e na senescência, respostas relacionadas e comumente desencadeadas por estresse genotóxico. Neste contexto este trabalho procurou identificar interações de Cdc42 com outras proteínas, que podem ou não estar envolvidas nos mecanismos de resposta ao dano do DNA. Para isso foram utilizadas as linhagens celulares HeLa e MRC-5 submetidas a tratamento com radiação ultravioleta tipo C, a fim de provocar danos no DNA. Foram realizados dois diferentes tratamentos em cada uma das linhagens com diferentes tempos de incubação pós radiação UV, visando a busca de proteínas envolvidas em uma resposta rápida ou tardia ao dano causado. Os lisados celulares desses tratamentos foram submetidos ao pull-down com proteínas recombinantes GST, GST-Cdc42WT (Selvagem) e GST-Cdc42V12 (Mutação constitutivamente ativa). As proteínas purificadas foram digeridas e submetidas à análise por espectrometria de massa e os dados obtidos foram utilizados para a construção de redes de interação proteica. Dentre as proteínas identificadas as que despertaram maior atenção foram: Proibitina-2 (PHB2) encontrada nas amostras incubadas por 48 horas pós irradiação e Cullina-4A (CUL4A) e P53, encontradas em amostra incubada por 5 minutos pós radiação. Essas proteínas possuem papéis em apoptose e reparo de DNA e foram observadas em posições muito próximas de Cdc42 nas redes de interação, fazendo delas interessantes alvos para futuras validações de interação proteica por análises experimentais distintas / The Cdc42 protein (Cell Division Cycle 42) is a member of the Rho family of GTPases, intracellular signalling molecules well known for their role in the cytoskeleton regulation. This protein cycles between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound) and this regulation is modulated by proteins known as GEFs, GAPs and GDIs. Recent studies demonstrated roles for Cdc42 in apoptosis and senescence, cellular responses commonly triggered by genotoxic stress. This work sought to identify Cdc42 interactions with other proteins that possibly involved in response to DNA damage mechanisms. To reach this aims we used HeLa and MRC-5 cell lines submitted to treatments with ultraviolet C radiation to induce DNA damage. Two experimental conditions were used in each cell line with different times and doses post UV irradiation in order to search for proteins involved in either rapid or delayed response to the installed DNA damage. Cell lysates obtained from these treatments were subjected to pull-down experiments using recombinant proteins GST, GST-Cdc42-WT (Wild type) and GST-Cdc42-V12 (constitutively active mutant). Purified proteins were digested by trypsin, analyzed by mass spectrometry and th obtained data were used for the construction of protein-protein interaction (PPI) networks. Among the identified proteins those that seem more relevant to the aims of this project were: Prohibitin-2 (PHB2), found in samples incubated 48 hours post irradiation; Cullin-4A (CUL4A) and P53, found in samples incubated 5 minutes after radiation. These proteins have roles in apoptosis and DNA repair and were observed in close proximity to Cdc42 in PPI networks, making them interesting targets for future validation by different experimental approaches

A proteína fosfatase do tipo-1 (PP1) é uma das principais proteínas serina/treonina fosfatases (PSTPs) e desempenha papeis fisiológicos tão diversos quanto importantes, tais como a regulação do metabolismo de carboidratos e do ciclo celular. A holoenzima PP1 é constituída por uma subunidade catalítica conservada (PP1c) que está associada a subunidades não-catalíticas que modulam sua localização subcelular, especificidade de substrato e atividade enzimática. Mais de 100 proteínas que interagem com a PP1c já foram identificadas em distintos organismos eucarióticos. Proteínas que interagem com a PP1c são, portanto, a chave para compreender os diferentes papéis biológicos da PP1. A subunidade catalítica da PP1 da ameba social Dictyostelium discoideum (DdPP1c) é codificada por um gene em cópia única o qual é expresso ao longo de todo o ciclo de vida desse organismo. Algumas proteínas que interagem e possivelmente modulam a atividade da PP1 de D. discoideum já foram identificadas, utilizando-se tanto buscas por similaridades na sequência genômica deste microorganismo como ensaios utilizando o sistema de duplo-híbrido em leveduras, utilizando-se a PP1c como isca. Com esta última abordagem, foram selecionados mais de 25 clones distintos de cDNA que codificam proteínas que potencialmente interagem com a DdPP1c, após varreduras de bibliotecas de cDNA de diferentes estágios de desenvolvimento de D. discoideum. Neste trabalho, nós confirmamos que o produto protéico de 11 destes clones interagem com a isca DdPP1c com base em novos ensaios de duplo-híbrido. Os demais clones codificam proteínas que não interagem com DdPP1c ou promovem auto-ativação do gene repórter. Selecionamos para estudos adicionais um clone do gene DDB_G0269300 cujo produto protéico predito de 423 de aminoácidos não tem função ainda conhecida. A sequência codificadora completa de DDB_G0269300 foi clonada para realização de novos ensaios de duplo-híbrido em leveduras, os quais confirmaram a especificidade de sua interação com DdPP1c. A proteína recombinante rDDB_G0269300 foi obtida com sucesso em bactérias, possibilitando a obtenção de anticorpos policlonais em camundongos. O anti-soro anti-rDDB_G0269300 é aparentemente específico no reconhecimento da proteína correspondente em extratos celulares de D. discoideum coletados em 12h e 16 da fase de desenvolvimento. Estes resultados coincidem com dados obtidos através de RT-qPCR que mostram aumento nos níveis dos transcritos de DDB_G0269300 entre 8h e 12h da fase de desenvolvimento, o que é indicativo da sua importância desta proteína durante esta fase do ciclo de vida de Dictyostelium como uma potencial parceira molecular da DdPP1c / Protein phosphatase type-1 (PP1) is a major protein serine/threonine phosphatase (PSTP) which plays as diverse as important physiological roles, such as regulation of carbohydrate metabolism and of cell cycle. The PP1 holoenzyme comprises a conserved catalytic subunit (PP1c) associated with non-catalytic subunits that modulate its subcellular localization, substrate specificity and enzymatic activity. More than 100 proteins that interact with PP1c have been identified in different eukaryotic organisms. Therefore proteins that interact with PP1c are key to the understanding of PP1 different biological roles. The catalytic subunit of PP1 the social amoeba Dictyostelium discoideum (DdPP1c) is encoded by a single copy gene which is expressed throughout the life cycle of this organism. Some proteins that interact with and possibly modulate the activity of D. discoideum PP1 have been identified, using both similarity searches in the genome sequence of this microorganism as yeast two-hybrid screenings using PP1c as bait. With the latter approach, we have selected more than 25 distinct cDNA clones encoding proteins that potentially interact with DdPP1c after screening D. discoideum cDNA libraries from different developmental stages. In this study, we confirmed that the protein product from 11 of these clones interact with the bait DdPP1c based on two-hybrid assays. The other clones encode proteins that either does not interact or promote self-activation of the reporter gene. The clone related to DDB_G0269300 gene that encodes a predicted protein of 423 amino acids with unknown function was selected for further studies. DDB_G0269300 full-length coding sequence was cloned and new yeast two-hybrid assays were performed confirming the specificity of the interaction with DdPP1c. The recombinant protein rDDB_G0269300 was successfully obtained in bacteria and further used for polyclonal antibodies production in mice. The antiserum anti-rDDB_G0269300 is apparently specific for recognition of the corresponding protein in D. discoideum cell extracts collected after 12h and 16h of development. These results agree with RT-qPCR data showing that the levels of DDB_G0269300 transcripts are increased between 8 h and 12 h during the development, which is indicative of its importance during this phase in Dictyostelium life cycle as a DdPP1c potential molecular partner.

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_BeatrizSantosCapela_D.pdf: 5512305 bytes, checksum: 707ea6299bc24ddc6fb459520d79aeee (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O combate à dengue atualmente está limitado praticamente aos esforços de eliminação do mosquito transmissor, o Aedes aegypti, porém esta estratégia não tem se mostrado eficiente. O desenvolvimento de novos instrumentos de combate à dengue requer, portanto, maior conhecimento sobre a biologia do vírus com relação à sua interação com seus hospedeiros. O genoma do vírus é constituído por um RNA simples-fita de polaridade positiva e possui duas regiões não traduzidas (5¿ e 3¿ UTR). A região 5¿UTR viral possui organização similar à dos mRNAs eucarióticos, diferentemente da região 3¿UTR que é longa e não possui cauda de poli(A). Em vez disso, na região 3¿UTR encontram-se estruturas conservadas entre os diferentes Flavivirus, dentre elas a estrutura 3¿ stem-loop (3¿SL) que é indispensável para a replicação do RNA viral. O objetivo do nosso estudo foi identificar novas proteínas humanas capazes de interagir com a estrutura 3¿SL do RNA do vírus da dengue. Dados da literatura descrevem que a proteína Mov34 de camundongo interage com 3¿SL do vírus da encefalite japonesa. Devido à alta similaridade entre as proteínas ortólogas humana e de camundongo, bem como das respectivas estruturas 3¿SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa, foi testada a interação entre a Mov34 humana com o 3¿SL do vírus da dengue. Porém, em nenhuma das condições testadas foi possível obter evidência de interação da Mov34 humana com 3¿SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa. Para a identificação de novas proteínas que são capazes de interagir com a estrutura 3¿SL do RNA do vírus da dengue foi utilizado o ensaio de triplo-híbrido de levedura. A proteína humana PACT, conhecida como proteína celular ativadora de PKR, foi isolada neste ensaio utilizando 3¿SL como isca. PKR é uma quinase ativada por PACT ou RNA dupla-fita. A ativação de PKR leva a um estado antiviral adquirido pela fosforilação do fator de iniciação da tradução eIF2a e conseqüente inibição da tradução. Além disso, PKR está envolvida em outras vias de transdução de sinal e na resposta celular à proteínas desenoveladas. A ação antiviral de PACT é evidenciada pela ação de proteínas dos vírus influenza A e herpes simplex tipo 1 que inibem a ativação de PKR por PACT e por RNA dupla-fita. A interação direta de PACT com 3¿SL do RNA do vírus da dengue foi confirmada por ensaio de UVcrosslinking PACT possui três domínios de interação com RNA dupla-fita, sendo que os dois domínios N-terminais são responsáveis pela sua interação com o 3¿SL. Foi identificada uma região específica do 3¿SL, o stem-loop superior, onde PACT interage com maior afinidade. Além disso, foi mostrado que PACT endógena de células HEK293 é capaz de interagir com o 3¿SL biotinilado. Para caracterizar a função desta interação durante a infecção viral, foi desenvolvida uma linhagem celular com inibição da expressão de PACT através da técnica de RNA de interferência. Com esta linhagem poderemos analisar a importância da interação entre PACT e o RNA do vírus da dengue quanto à ativação e/ou inibição de PKR durante a infecção viral / Abstract: The combat to the dengue virus is basically limited to the efforts in eliminating the transmitter mosquito, the Aedes aegypti. But this strategy is not very efficient. The development of new instruments of combat to dengue virus requires improved knowledge about the virus biology and its relation to hosts. The dengue virus genome is a single-stranded RNA of positive polarity flanked by a 5¿ untranslated region (UTR) of ~100 bases and a highly structured 3¿ UTR of ~450 bases. As many other viruses, dengue encodes the enzymes required for its genome replication, but relies completely on the host translational machinery to synthesize its proteins. The essential difference between host cellular mRNAs and dengue virus genome RNA involves the 3¿UTR, which instead of a polyadenylate tail contains highly conserved structural elements, including the 3' stem-loop (3¿SL), located at the 3' terminus of the 3'UTR of many flaviviruses that is essential for their replication. The aim of this study is to identify new human proteins capable of interacting with dengue virus RNA 3¿SL structure. Literature data describe that the murine Mov34 protein interacts with Japanese encephalitis virus 3¿SL. Giving the high similarity between the human and murine ortholog proteins, as well as the conservation of the Flavivivirus RNA 3¿SL structure, we tested the interaction between the human Mov34 and the dengue virus 3¿SL. However, no interaction was detected under the conditions used in this work. In addition, the yeast three-hybrid system was used to screen for novel proteins that interact with the dengue virus 3¿SL. Human PACT, known as the cellular protein activator of PKR, was identified as a putative 3¿SL-interacting protein. PKR is an interferon-inducible, PACT or double-stranded RNA activated protein kinase. Activated PKR phosphorylates the translation initiation factor eIF2a, inhibiting translation of cellular and viral RNAs, leading to a cellular antiviral state. PACT and doublestranded RNA activation of PKR is inhibited by influenza A and herpes simplex type 1 virus proteins during viral infection, indicating that PACT plays a role in the cellular antiviral state. Direct interaction between PACT and 3¿SL was confirmed by UV-crosslinking assays. PACT contains three doublestranded RNA interaction motifs, but only the two N-terminal motifs are responsible for 3¿SL interaction. A 3¿SL specific region, the top stem-loop, was identified to interact with PACT with higher affinity. Furthermore, HEK293 cells endogenous PACT interacts with biotin-labeled 3¿SL. To further characterize PACT-3¿SL interaction during dengue virus infection, a cell line with low expression of PACT was developed using the RNA interference technique. This cell line will be used to determine the propagation rate of dengue virus which is expected to reveal the importance of PACT either for the cell antiviral state or for dengue virus proliferation / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mirelle Bb.pdf: 2549462 bytes, checksum: 7f8ae645314de6fb536a8445eb69e03e (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in South America. In humans, infection starts by inhalation of fungal propagules that reach the pulmonary epithelium. The cell wall presents an essential role in the pathobiology of P. brasiliensis, since it is involved in the morphogenetic changes associated with the life cycle of this pathogen. The biosynthesis and remodeling of the cell wall polysaccharide network is required for fungal growth and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins are involved in these processes. The enzymes of the glucan-elongating (GEL) family are GPI-anchored proteins which have beta-1,3-glucanosyltransferase activity and play important role in the cross-linking of cell wall components in fungi. The P. brasiliensis genome possess 3 genes that encode for beta-1,3-glucanosyltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). With the aim of searching for other possible functions for beta-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3p) in P. brasiliensis, the interactions between this protein and others proteins of the fungus were investigated through the Saccharomyces cerevisiae two-hybrid system and pull-down assay. The two-hybrid system enables the study of interactions in vivo and, through this approach, 8 proteins which interact with PbGel3p were identified. The interaction with phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-kinase its3 and protein kinase Dsk1p suggest the participation of PbGel3p in the cell division cycle. The RNA helicase Dbp5p, whose interaction with PbGel3p was in vitro confirmed by coimunoprecipitation, and the 5'-3' exoribonuclease are involved in the mRNA metabolism suggesting a function for PbGel3p in this process. The interaction between PbGel3p and the lipase/serine esterase, which participates on the biosynthesis of the GPI-anchor, was also confirmed by coimunoprecipitation. PbGel3p also interacts with the transcription factor Ctf1Bp and the 3-oxoacyl reductase enzyme, which suggests its involvement in the lipid metabolism. The interaction with the leptomycin B resistance protein Pmd1p suggests a role for PbGel3p in the response to antifungal drugs. The in vitro pull-down assay resulted in the identification of P. brasiliensis 70 kDa heat shock protein. The interaction with this protein suggests that PbGel3p may act in the response to stress conditions, as in the temperature increase. On basis of these data, functional studies may be carried out in order to confirm the Gel3p multifunctionality in P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América do Sul. A infecção em humanos inicia-se com a inalação de propágulos fúngicos que atingem o epitélio pulmonar. A parede celular desempenha um papel importante na patobiologia do P. brasiliensis, pois está envolvida nas mudanças morfogenéticas associadas com o ciclo de vida deste patógeno. A biossíntese e o remodelamento dos polissacarídeos da parede celular são essenciais para o crescimento do fungo e proteínas glicosilfosfatidilinositol (GPI)-ancoradas estão envolvidas nesses processos. As enzimas da família glicanosiltransferase alongando glicana (GEL) são proteínas GPI-ancoradas que possuem atividade de beta-1,3-glicanosiltransferase e desempenham um importante papel nas ligações cruzadas dos componentes da parede celular em fungos. O genoma de P. brasiliensis possui 3 genes codificantes para beta-1,3-glicanosiltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). Com o objetivo de se buscar outras possíveis funções da beta- 1,3-glicanosiltransferase 3 (PbGel3p) em P. brasiliensis, as interações entre essa proteína e outras proteínas do fungo foram investigadas através do sistema de duplohíbrido em Saccharomyces cerevisiae e do ensaio de pull-down. O sistema duplohíbrido permite o estudo das interações in vivo e, através dele, foram identificadas 8 proteínas que interagem com PbGel3p. A interação com a fosfatidilinositol-4-fosfato 5- quinase its3 e com a Dsk1 proteína quinase sugere a participação de PbGel3p no ciclo de divisão celular. A RNA helicase Dbp5p, cuja interação com PbGel3p foi confirmada in vitro através do ensaio de coimunoprecipitação, e a 5'-3' exoribonuclease estão envolvidas no metabolismo de RNAm, sugerindo uma função para PbGel3p nesse processo. A interação entre PbGel3p e a enzima serina esterase/lipase, que participa da via de biossíntese da âncora GPI, também foi confirmada por coimunoprecipitação. PbGel3p interage com o fator de transcrição Ctf1Bp e enzima 3-oxoacil redutase, fato que sugere seu envolvimento no metabolismo de lipídeos de P. brasiliensis. A interação com a proteína de resistência à leptomicina B Pmd1p sugere um papel para PbGel3p na resposta à agentes antifúngicos. O ensaio de pull-down in vitro resultou na identificação da proteína de choque térmico de 70 kDa de P. brasiliensis. A interação com essa proteína sugere que PbGel3p pode atuar na resposta à condições de estresse, como o aumento de temperatura. Com base nesses dados, estudos funcionais devem ser realizados para confirmar a multifuncionalidade de Gel3p em P. brasiliensis.

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No. of bitstreams: 2 Dissertação - Raisa Melo Lima - 2016.pdf: 5394977 bytes, checksum: 7066675bd31ee0e72d9ecd420ea0d1e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-10-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Brazil, where are recorded about 80% of cases worldwide, and has Paracoccidioides sp. as the etiologic agent. Malate synthase (MLS) is an important enzyme related to the fungal metabolism, once it is essential in the glyoxylate cycle, a secondary metabolic pathway of the citric acid cycle exclusive to microorganisms and plants. Its absence in humans makes this enzyme an interesting subject to study, mainly in rational drug design. From recent in vitro studies, several interacting proteins of MLS (receiver) were classified, but the modes of interaction and key regions involved in protein-protein interfaces (PPIs) have not yet been described. In this work, six (6) binding proteins (BPs) were selected to describe the IP's of MLS. Their tridimensonal structures, as well as MLS, were predicted by homology modeling using I-TASSER server, and subsequent molecular dynamics simulations (MD). The most common conformational modes of each protein were obtained by cluster analysis of the trajectories generated by MD. Molecular docking simulations using Gramm-X were then performed for the conformational modes of MLS against the BP's, resulting in a total of 36 complexes. Based on the higher frequency of some small fragments of proteins observed in the IPP's, 57 peptides with sizes between 5 and 20 residues, were initially selected from 5 regions of MLS which are considered more frequent in protein-protein interaction. FlexPepDock simulations were performed to optimize the atomic coordinates of the peptide complexed with MLS, and concomitantly, PepFOLD simulations were performed to evaluate the stability of each peptide in solution. Based on the lower energy score of peptides linked to MLS, and the stability of their structures in solution (MLS-free), 6 peptides were selected as promising ligands to MLS mode 1. The stability and patterns of interactions of these peptides were evaluated in detail. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica no Brasil, onde são registrados cerca de 80% dos casos mundiais, e possui como agente etiológico o fungo Paracoccidioides spp. A Malato sintase (MLS) é uma importante enzima relacionada ao metabolismo fúngico, uma vez que é essencial no ciclo do glioxilato, uma via metabólica importante de produção de glicose para parede celular, sendo exclusiva de micro-organismos e plantas. Sua ausência em humanos a torna um alvo interessante de estudo, principalmente, no desenho racional de fármacos. A partir de recentes estudos in vitro, várias proteínas que interagem com a PbMLS (receptor) foram classificadas, porém os modos de interação e as regiões chaves envolvidas nas interfaces proteína-proteína (IPP’s), não foram ainda descritas. Neste trabalho, 6 (seis) proteínas ligantes (PL) foram selecionadas para verificar suas interações com PbMLS. As estruturas tridimensionais dessas proteínas, bem como de PbMLS, foram preditas por homologia, usando o servidor I-TASSER. Simulações de dinâmica molecular (DM) foram realizadas pelo programa GROMACS, e os modos das conformações mais representativas de cada proteína foram determinados baseando-se nas análises de agrupamentos a partir das trajetórias geradas por DM. Simulações de ancoragem molecular com GRAMM-X foram então realizadas entre os modos conformacionais de PbMLS contra os obtidos de PL’s, resultando num total de 36 complexos. Baseado na frequência maior de alguns pequenos fragmentos de proteínas, observados nas IPP’s, 57 peptídeos de tamanhos entre 5 e 20 resíduos de aminoácidos, foram inicialmente selecionados a partir de 5 regiões da PbMLS consideradas mais frequentes na interação proteína-proteína. Simulações com FlexPepDock foram realizadas para otimizar as coordenadas atômicas dos peptídeos complexados com MLS e, concomitantemente, simulações com PepFOLD foram realizadas para avaliar a estabilidade de cada peptídeo em solução. Com base nos mais baixos scores de energia dos peptídeos ligados a MLS bem como na estabilidade de suas estruturas não ligadas em solução , 5 peptídeos foram selecionados como promissores ligantes ao modo 1 de MLS. A estabilidade e os padrões de interações destes peptídeos são avaliados em detalhes.