L'ARN interférence est un mécanisme moléculaire conservé chez les Eucaryotes dont les principaux acteurs sont les protéines ARGONAUTE (AGO). Chez les plantes, AGO1 est une protéine essentielle à la croissance et la défense antivirale. Elle utilise des petits ARNs comme sondes pour reconnaître et réguler des ARN messagers. Les virus ont développé des suppresseurs de l'ARN interférence pour surmonter cette défense. L'un d'entre eux, P0 du virus de la mosaïque jaune du navet, est comme une protéine F-box qui détourne le complexe SCF, une ubiquitine ligase E3, et conduit AGO1 vers la protéolyse ubiquitine-dépendante. Cette dégradation utilise la vacuole au lieu du protéasome 26S, généralement associé à la dégradation ubiquitine-dépendante. Ce mécanisme de protéolyse n'est pas compris et est aussi apparent quand AGO1 est déstabilisé de manière endogène, suggérant que P0 utilise une voie déjà existante. Une protéine F-box d'Arabidopsis, FBW2, a été décrite comme impactant l'homéostasie d'AGO1 indépendamment du protéasome. Mon projet de thèse visait à caractériser l'activité F-box de FBW2 et à comprendre la relation entre AGO1 et FBW2 ainsi que ses conséquences sur l'ARN interférence. Les résultats obtenus dans ce manuscrit montrent que le complexe SCFFBW2 interagit avec AGO1 et déclenche sa dégradation via un processus indépendant de l'autophagie ou du protéasome, tout en n'affectant que faiblement l'ARN interférence. FBW2 ciblerait en fait un sous-ensemble de protéines AGO1 qui semble ne pas contenir de petits ARNs. Cette régulation jouerait un rôle de surveillance pour prévenir une activité délétère d'AGO1 en absence de petits ARNs. / RNA silencing is a conserved molecular mechanism in eukaryotes, of which the main effectors are the ARGONAUTE (AGO) proteins. In plants, AGO1 is a protein that is essential for growth and antiviral defence. It uses small RNAs as probe to recognize and regulate messenger RNAs. Viruses have developed suppressors of RNA silencing to overcome this defence. One of these, P0 from the Turnip Yellows Virus, acts as an F-box protein to hijack the SCF complex, an E3 ubiquitin ligase, and guide AGO1 to the ubiquitin-dependent proteolysis. This degradation uses the vacuole instead of the 26S proteasome, generally associated with ubiquitin-dependant proteolysis. This proteolysis mechanism is not understood and is also apparent when AGO1 is endogenously destabilized, suggesting that P0 uses an already existing pathway. An Arabidopsis F-box protein, FBW2, has been shown to impact AGO1 homeostasis independently from the proteasome. My PhD project aimed at characterizing FBW2 F-box activity and understanding the relationship between AGO1 and FBW2, as well as its consequences on the RNA silencing. The results obtained in this manuscript show that the SCFFBW2 interacts with AGO1 and triggers its degradation through an autophagy- and proteasome- independent process, while only weakly affecting the RNA silencing. FBW2 would actually target a subset of AGO1 proteins, which appears not to contain small RNAs. This regulation would play a surveillance role in order to prevent a deleterious activity of AGO1 in absence of small RNAs.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l'action conjuguée d'un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l'oxygène. Dans le cadre d'un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l'effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d'un corécepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d'ARN interférence visant à éteindre l'expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur dépendante du conjugué. In vivo, l'accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l'endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l'accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d'augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide Aψ[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse.

La grande surface développée du silicium poreux fait de lui un hôte potentiel pour l'incorporation de molécules organiques. Les nanocomposites hybrides à base de molécules conjuguées luminescentes pourraient se prêter à des applications en optoélectronique.<br />L'étude comprend deux parties : la première est consacrée à l'étude morphologique et optique des couches minces et des membranes auto-supportées de silicium poreux fabriquées au laboratoire en utilisant la microscopie électronique, l'ellipsométrie spectroscopique et l'absorption. L'analyse microstructurale des couches poreuses par diffusion Raman nous a permis d'estimer la distribution de tailles des nanocristallites via le modèle de confinement des phonons et de confirmer l'absence de porteurs de charges libres. Une étude de Raman polarisé sur des membranes poreuses libres permet de sonder les inhomogénéités de propagation de la lumière dans ce milieu.<br />La seconde partie présente les études concernant l'imprégnation de molécules fluorescentes dans les pores. La photoluminescence donne un moyen de vérifier l'efficacité de l'incorporation de molécule de Rodhamine R6G et son homogénéité. L'excitation sélective permet une approche des transferts d'énergie entre les deux matériaux. La photoluminescence résolue en temps montre que la présence de la R6G crée de nouveaux canaux de désexcitation non radiative.<br />Le THD est incorporé dans des membranes libres rendues organophiles, puis polymérise spontanément in situ en son poly-Diacétylène. La variation angulaire de la photoluminescence et du Raman témoignent de la présence de chaînes de polymères dont le degré d'orientation est compatible avec une croissance le long des pores.

La réduction des dimensions des composants en microélectronique impose d'améliorer constamment la résolution ultime des dispositifs de lithographie. Cependant, ces évolutions deviennent de plus en plus difficiles et coûteuses à mettre en oeuvre et pourraient favoriser l'apparition de techniques de lithographie alternatives, comme la lithographie assistée par plasmons de surface. L'objectif de cette thèse a consisté à évaluer les performances, les contraintes et par conséquent les applications possibles et les conditions d'utilisation de cette nouvelle technique. En se focalisant sur les propriétés intrinsèques des films minces métalliques, deux approches complémentaires ont ainsi été développées. La génération d'un champ d'interférences plasmonique a tout d'abord conduit à l'impression, dans une couche de résine photosensible, de motifs relativement complexes mais de résolution limitée; La réalisation d'une lithographie haute résolution assistée par plasmons de surface a ensuite été abordée à travers la conception d'une nanosource optique compacte et efficace, la géométrie obtenue pouvant également être adaptée pour générer des motifs arbitraires ou réaliser une source accordable en longueur d'onde. Les différents résultats indiquent que cette technique de champ proche bas coût serait particulièrement bien appropriée à des besoins de lithographie ponctuels et/ou spécifiques, mais que les systèmes étudiés pourraient aussi être utilisés pour d'autres applications, comme le stockage optique par exemple.

Les travaux présentés dans ce document retracent mes activités de Recherche dans le domaine de la Biologie Cellulaire et Moléculaire, qui m'ont conduit de la Toxicologie Génétique à la Radiobiologie. L'action des génotoxiques sur le patrimoine héréditaire a toujours constitué le fil conducteur de mes activités. A chaque étape de mon parcours, j'ai développé des modèles biologiques destinés à répondre à des thématiques bien précises. <br />Mon travail de recherche a commencé pendant deux ans à Rhône Poulenc (1985 1986) par le test de la réparation de l'ADN in vitro et in vivo (UDS ou unscheduled DNA synthesis) sur hépatocytes de rats Sprague Dawley et Fischer 344. Ce test de « dommages primaires » permet de prédire l'activité génotoxique des xénobiotiques. Dans l'approche in vivo, mon étude mettait en évidence l'importance du métabolisme intestinal dans l'activation métabolique de certains agents génotoxiques indirects (dérivés dinitrotoluène). J'ai ensuite débutée une approche plus fondamentale au CNRS (1988 1992). En utilisant les outils de la Génétique Moléculaire, j'ai créé un nouveau modèle cellulaire exprimant un système de régulation génique qui permet de détecter rapidement les agents modifiant le profil de méthylation de l'ADN au niveau des sites 5'CpG3'. Ces xénobiotiques, à l'origine des « épimutations » et de la dérégulation de l'expression de certains gènes, ont une contribution importante et souvent sous estimée dans la progression tumorale.<br />En 1992, je me suis orienté vers la Radiobiologie au DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum ; Heidelberg, Allemagne) puis au CEA (LRA). Il s'agissait d'adapter à la Radiobiologie le modèle de culture de la peau humaine reconstituée in vitro, destiné auparavant à étudier la physiologie des kératinocytes normaux ou pathologiques. L'objectif était (i) d'irradier les spécimens de peau et d'étudier les effets d'une irradiation sur les kératinocytes et les fibroblastes), et (ii) de mimer in vitro la fibrose radioinduite. Ce modèle de culture alternatif prend en compte les interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Au cours de ce travail, je me suis intéressé à la protéine humaine HSAkin17. Mon activité s'est alors recentrée sur cette protéine. Le développement de nombreuses approches cellulaires et moléculaires au laboratoire (LGR) nous a permis de mettre en évidence l'implication de cette protéine dans la réplication de l'ADN, notamment lorsque la progression des fourches de réplication est bloquée par des dommages non réparés de l'ADN. Nous avons démontré que cette protéine était un composant nécessaire au complexe de réplication de l'ADN et qu'elle avait une activité de reconnaissance des origines de réplication endogènes.<br />Depuis la fin 2003, j'ai développé et valider les vecteurs pEBVsiRNA pour une interférence ARN (RNAi) à très long terme (> 500 jours). Ce travail a été mené sur de nombreux gènes (110 gènes ciblés), essentiellement des gènes de la réparation de l'ADN. Un brevet a été déposé en 2005. Cette approche nous permet maintenant de travailler sur les interconnexions entre les mécanismes de réparation de l'ADN dans des lignées isogèniques. A ce jour, je suis le seul à proposer un tel modèle cellulaire cohérent avec un aussi grand nombre de clones stables, maintenus en culture aussi longtemps. La création de clones silencieux, stables à très long terme, m'a permis de participer à l'élaboration de nouveaux projets de Recherche dans le cadre de nombreuses collaborations, dont certaines seront énoncées dans ce rapport. Par ailleurs, ma démarche a aboutit à une valorisation industrielle.

La Spectrométrie de Masse à source Plasma à Couplage Inductif s'impose, de par ses multiples avantages, dont sa sensibilité et ses temps d'analyse réduits, comme la technique de spectrométrie de masse la plus répandue en analyse inorganique pour déterminer la concentration d'un isotope donné ou mesurer des rapports isotopiques. Le problème des interférences spectroscopiques, inhérent à cette technique, trouve une solution dans l'utilisation de dispositifs de collision-réaction. Une résolution in situ des interférences est en effet rendue possible par l'injection, dans la cellule de collision-réaction, d'un gaz judicieusement choisi. Les étapes de séparation chimiques, habituellement réalisées en amont de la mesure, et très pénalisantes dès lors que les échantillons manipulés sont radioactifs, peuvent ainsi être supprimées. La compréhension de la chimie des interactions « ions-molécules » en phase gazeuse est cependant primordiale pour optimiser l'efficacité de tels dispositifs. Pour cela, une connaissance précise des conditions expérimentales dans la zone de réaction s'avère cruciale, afin de pouvoir interpréter les réactivités observées.<br /><br />Deux ICP-MS de conception différente, l'ICP-MS Quadripolaire X7 (Thermo-Fisher Scientific) et l'ICP-MS Multi-Collection Isoprobe (GV Instruments), sont utilisés dans cette étude. Les conditions expérimentales, existant dans la cellule de collision-réaction de chacun de ces deux instruments, sont déterminées en fonction des paramètres instrumentaux. Cette étude préliminaire est ensuite mise à profit dans le cadre de la résolution de deux interférences, caractéristiques au domaine du nucléaire. Une approche théorique par calculs de chimie quantique permet d'interpréter la formation des oxydes de zirconium, responsable de la suppression de l'ion interférent 90Zr+, suite à l'utilisation d'O2 dans la cellule de collision-réaction pour permettre la mesure du radionucélide 90Sr. Le cas de la réactivité de cinq cations lanthanides (Nd, Sm, Eu, Gd, Dy) avec plusieurs gaz (O2, N2O, CO2, NH3) est par ailleurs étudié expérimentalement. L'efficacité de l'ammoniaque pour résoudre les interférences isobariques Eu/Gd est mise en évidence. Une périodicité de la réactivité sur la série des lanthanides, due à la configuration électronique de l'état fondamental des cations Ln+, est proposée pour expliquer les différences de comportements observées.

Les CRISPRs constituent une famille particulière d'éléments génétiques, retrouvés dans de nombreux génomes de procaryotes (la moitié des bactéries et presque toutes les archées). Des études récentes suggèrent que cette structure représente un système de défense contre les ADNs étrangers fonctionnant grâce à un mécanisme d'interférence ARN. Les CRISPRs consistent en la succession de régions très bien conservées (DR) dont la taille varie de 23 à 47 pb, séparées par des séquences uniques d'une taille similaire et ayant en général une origine virale. Le polymorphisme observé entre différentes souches de la même espèce fait du CRISPR un marqueur génétique intéressant pour des analyses comparatives de souches bactériennes très proches et pour des études phylogénétiques. Cette thèse décrira trois outils bioinformatiques accessibles à l'adresse (http://crispr.u-psud.fr) et leurs applications dans l'investigation et le typage des CRISPRs. Le premier outil est CRISPRFinder qui est un programme d'identification des CRISPRs à partir des séquences génomiques. Le deuxième est la base de données CRISPRdb et ses utilitaires qui fournissent un accès aux CRISPRs de tous les génomes procaryotes séquencés. le troisième outil est CRISPRcompar qui sert à identifier et comparer les CRISPRs dans des génomes proches pour faciliter la procédure de typage.

Les cellules épithéliales sont à la base de nombreuses fonctions vitales chez les mammifères, en particulier grâce à leurs propriétés de polarisation et de cohésion dynamiques regroupées sous le terme de « Plasticité Epithéliale ». Une manifestation originale de cette plasticité est la Transition Epithélio-Mésenchymateuse (EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition), un processus complexe qui permet à une cellule épithéliale (ou un groupe de cellules) de modifier sa composition et l'organisation de ses protéines pour se détacher de la masse cellulaire à laquelle elle appartient, et ainsi acquérir une organisation de type fibroblastique propice à la motilité cellulaire. Ce phénomène, initialement mis en évidence pour son rôle dans le développement embryonnaire, met en jeu une régulation fine, sous le contrôle de facteurs de transcription dont certains semblent également jouer un rôle au cours de la progression tumorale. Le facteur SNAIL1 (ou SNAIL), dont le rôle est déterminant au cours de la mise en place de nombreux organes, est également fortement exprimé au niveau du front invasif de certains carcinomes et pourrait participer à la dissémination des cellules cancéreuses au sein de l'organisme. Au cours de l'EMT, son expression, sa localisation et son activité sont soumises à une régulation complexe qui implique plusieurs modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes de régulation de SNAIL1 par la protéine-kinase CK2 au cours de l'EMT. Ce travail a été réalisé en deux étapes dont la première fût une caractérisation biochimique de la phosphorylation de SNAIL1 par CK2 et sa régulation par la sous-unité régulatrice CK2β. Dans un deuxième temps, je me suis penché sur l'étude des conséquences de l'inhibition du complexe CK2 par ARN interférence dans les cellules épithéliales mammaires MCF10A. Ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle déterminant de CK2β dans le maintien de l'expression d'un phénotype épithélial et d'une architecture cohésive au sein des cellules MCF10A en culture in vitro. L'ensemble de ces résultats suggère en effet que la protéine-kinase CK2, sous le contrôle de sa sous-unité régulatrice CK2β, exerce une régulation négative sur le niveau d'expression transcriptionnelle et la stabilité protéique de SNAIL1 visant à s'opposer à l'induction de l'EMT.

L'interférence est un phénomène présent dans de nombreux systèmes de communication et est souvent un sérieux frein à leur développement. Une gestion intelligente de ce phénomène est alors nécessaire, afin de limiter son impact négatif. Dans cette thèse, nous avons abordé trois sujets liés à sa présence. Dans la première partie, de façon à augmenter le débit de transmission dans les systèmes à ultra large bande basés sur des impulsions brèves, nous proposons d'attribuer plusieurs codes à saut temporel au même utilisateur. Ceci génère un nouveau type d'interférence associée aux codes supplémentaires alloués à l'utilisateur d'intérêt. Le bénéfice de ce type de stratégie n'étant pas immédiat, nous étudions l'impact de notre proposition sur les performances du système. Dans la deuxième partie, nous traitons le problème de l'optimisation de la probabilité de coupure dans un système multi-antennaire, soumis à un canal de Rice à évanouissement lent. Nous proposons d'optimiser cette probabilité dans le contexte à N antennes de transmission et une antenne de réception, lorsque le rapport signal-à-bruit est grand, et de l'améliorer dans le contexte à plusieurs antennes de transmission et plusieurs antennes de réception. Dans la dernière partie, nous étudions le problème de l'allocation de puissance dans un canal à interférence gaussien. En nous basant sur une nouvelle expression approchée de la capacité de ce canal et moyennant une modulation OFDM, nous proposons de développer un nouvel algorithme d'allocation de puissance qui améliore la région de débits atteignables, en comparaison avec une allocation uniforme et des schémas classiques de gestion dynamique du spectre.

Nous examinons les propriétés de sécurité du lambda-calcul au travers du prisme du lambda-calcul étiqueté. Les étiquettes expriment dynamiquement la dépendance des termes présents vis-à-vis des réductions passées. Nous montrons que le lambda-calcul étiqueté vérifie la propriété d'irréversibilité des contextes: une fois qu'un contexte est intervenu dans une réduction, il disparaît irréversiblement dans la suite de cette réduction. Nous examinons les propriétés fondamentales de variantes du lambda-calcul étiqueté. Pour cela, nous introduisons une preuve élégante du théorème des développements finis dans la cadre du lambda-calcul par valeur étiqueté. Puis nous prouvons que les étiquettes du lambda-calcul faible expriment le partage. Les étiquettes du lam! bda-calcul permettent d'exprimer des politiques de sécurité telles que l'inspection de pile et la Muraille de Chine. Nous définissons la notion de réduction indépendante de deux principaux A et B: une telle réduction peut se décomposer en deux réductions: une réduction qui ignore A et une réduction qui ignore B. Nous prouvons que la Muraille de Chine garantit cette propriété d'indépendance. Les étiquettes du lambda-calcul permettent aussi d'exprimer la propriété d'interférence: il s'agit ici d'identifier les sous-termes d'un terme M qui influencent le résultat de la réduction de M. Dans le lambda-calcul muni de références, en plus de l'interférence fonctionnelle déjà présente dans le lambda-calcul pur, on identifie l'interférence de mémoire due à l'utilisation des référe! nces. Les étiquettes permettent d'identifier les int! ervalles de temps pendant lesquels une référence influence le résultat d'une réduction.