Diese Arbeit beschreibt die Untersuchung der Diffusion in dünnen Flüssigkeitsfilmen auf festen Oberflächen mit Methoden der Einzelmoleküldetektion. Anhand von Computersimulationen wird die Spotgrößenanalyse als neue Methode zur Analyse von Diffusionsprozessen vorgestellt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Diffusion von Farbstoffen in ultradünnen Flüssigkeitsfilmen stark verlangsamt ist. In einem ca. 3 nm dicken Film aus Tetrakis(2-ethyl-hexoxy)-silan werden Diffusionsprozesse beobachtet, die durch Sprünge zwischen Bereichen mit diskreten Werten der Diffusionskonstante gekennzeichnet sind. Die Existenz diskreter Werte der Diffusionskonstante kann durch die Ausbildung von Flüssigkeitsschichten molekularer Dicke (Liquid Layering) erklärt werden. Die Spotgrößenanalyse erweist sich als unabhängige Methode zur Bestimmung der Diffusionskonstante diffundierender Moleküle. Gegenüber der etablierten Bestimmung der Diffusionskonstante aus Trajektorien diffundierender Moleküle durch Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung bietet die Spotgrößenanalyse eine höhere statistische Genauigkeit und die Möglichkeit, Änderungen der Diffusionskonstante instantan zu detektieren.

The modification of the radiation pattern and radiative lifetime of dye molecules in three-dimensional colloidal photonic crystals is studied, using high-resolution optical microscopy and spectroscopy. The experimental observations are compared to corresponding calculations of the local optical density of states. It can be concluded, that the fluorescence of the molecules is redistributed spectrally and spatially within the photonic crystal. / Mit Hilfe hochauflösender optischer Mikroskopie und Spektroskopie werden Änderungen der Abstrahlcharakteristik und strahlenden Lebensdauer von Farbstoffmolekülen in dreidimensionalen kolloidalen photonischen Kristallen untersucht. Die experimentellen Beobachtungen werden mit entsprechenden Berechnungen der lokalen optischen Zustandsdichte verglichen. Hieraus kann auf eine spektrale und räumliche Umverteilung der Fluoreszenz der Moleküle im photonischen Kristall geschlossen werden.

Gegenstand der Dissertation sind Untersuchungen zur Photolumineszenz von Silizium-Nanokristallen. Den Schwerpunkt bilden dabei die Messungen an isolierten Partikeln mittels konfokaler Mikroskopie und optischer Spektroskopie. Von einzelnen Silizium-Partikeln konnten relativ schmale, strukturierte Photolumineszenzbanden detektiert werden, die die Aussagen des Quantum-Confinement-Modells bestätigen. Ein weiteres Merkmal der Photolumineszenz von einzelnen Halbleiter-Nanopartikeln ist das so genannte Blinken. Die Erstellung von Blinkstatistiken unter verschiedenen Anregungsbedingungen ermöglichte es, die zum Blinken führenden photophysikalischen Prozesse genauer zu charakterisieren. Es wird unter anderem gezeigt, dass das reversible Bleichen der Lumineszenz von Silizium-Nanokristall-Ensemblen und porösem Silizium auf ein instationäres Blinkverhalten zurückzuführen ist. Abschließend werden Bezüge zu den astrophysikalischen Beobachtungen von der Extended Red Emission hergestellt und verschiedene Tunnel- und Random-Walk-Modelle zur Beschreibung der photophysikalischen Prozesse diskutiert.

Gegenstand dieser Diplomarbeit ist die Untersuchung der Dynamik in dünnen Polymerfilmen anhand von einzelnen Molekülen. Zu diesem Zweck wurden dünne Filme (kleiner 100nm) hergestellt und mittels Einzelmoleküldetektion und zeitaufgelöster Einzelphotonenzählung analysiert, was eine orts- und zeitaufgelöste Untersuchung einzelner Farbstoffmoleküle ermöglicht. Ziel war es, festzustellen ob, und auf welchem Weg, die Dynamik der Umgebung in Fluktuationen der Fluoreszenzlebensdauer einzelner Moleküle sichtbar wird. Neben der Evaluierung der Untersuchungsmethoden wurden in dieser Arbeit zwei Arten von Sensormolekülen - DiD und Malachit Grün - näher untersucht. / The subject of this diploma thesis is the analysis of dynamics in thin polymer films using single molecules. Thin polymer films (less than 100nm) were produced and analysed by Single Molecule Detection (SMD) and Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC). This allows a spatial and time resolved investigation of the single dye molecule. The aim was to ascertain if, and in which way, the dynamics of the environment are reflected by fluctuations of the fluorescence lifetime of the single molecule. In addition to evaluating the investigation methods two kinds of molecules - DiD and Malachite Green - were also analysed.

In dieser Doktorarbeit wird die Hypothese geprüft, ob Osteozyten einen direkten Einfluss auf die Knocheneigenschaften in ihrer unmittelbaren Umgebung haben. Der zentrale Experimentieransatz ist dabei die Korrelation der Organisation des Osteozytennetzwerks mit den Mineraleigenschaften des Knochens auf der Submikrometerebene. Es wird gezeigt, dass bereits die anfängliche Ausrichtung der Osteoblasten entscheidend für die Synthese von hoch ausgerichtetem Knochenmaterial ist. Die dabei entstehenden Osteozytennetzwerke sind so organisiert, dass die Osteozyten und ihre Zellfortsätze jeweils einen möglichst kleinen Abstand zum Knochenmineral haben. Deshalb wird vermutet, dass genau diese Netzwerkorganisation mitentscheidend ist, wie gut die Zellen das Mineral in ih-rer Umgebung beeinflussen können. Messungen der Knochenmineraleigenschaften auf Submikrometerebene mit Röntgenkleinwinkelstreuung bestätigen diese Vermutung. Dabei wird deutlich, dass Knochenmaterial in der Nähe der Osteozyten durch andere Mineraleigenschaften geprägt ist. Um zu klären, wie Osteozyten Mineral in ihrer direkten Umgebung verändern können, werden Mechanismen der passiven Mineralherauslösung aus der mineralisierten Oberfläche des Osteozytennetzwerks untersucht. Es wird gezeigt, dass kalziumarme ionische Lösungen unter physiologischen Bedingungen große Mengen von Kalzium-Ionen aus dem Knochen lösen und diese dann durch die Osteozytennetzwerkstrukturen diffundieren können. Zum Abschluss wurde medullärer Knochen von Hühnern als ein Modellsystem für rasanten Knochenumbau untersucht. Dieser spezielle Knochentyp dient den Hennen als labiles Kalziumreservoir und ermöglicht dadurch die tägliche Eierschalenproduktion. Experimente am medullären Knochen-material zeigen insbesondere die Bedeutung von weniger stabilen Mineralstrukturen die benötigt werden um den Knochen an den schnellen, sich wiederholenden Knochenauf- sowie Abbau optimal anzupassen. / This thesis aims to test the hypothesis whether osteocytes have a direct influence on bone material properties in their vicinity. In this regard, the concomitant ana-lysis of osteocyte network organization and bone ultrastructural properties on the submicron level is the central approach to answer this question. In this work, it is shown that already initial cell-cell alignment during the process of bone formation is crucial for the synthesis of highly organized bone. Furthermore it is proposed that the occurrence of highly ordered osteocyte networks visualized with confocal laser scanning microscopy (CLSM) has a strong impact on the ability of osteocytes to directly influence bone material properties. These highly organized networks are another consequence of initial cell-cell alignment and are found to be arranged such as to feature short mineral cell distances. Examination of sub-micron mineral properties with scanning small angle x-ray scattering (sSAXS) shows that bone material in the direct vicinity of osteocytes and their cell proc-esses shows different mineral properties compared to bone further away in the depth of the tissue. Moreover, mechanisms of passive mineral extraction from the mineralized surface of the osteocyte network, due to the treatment with calcium poor ionic solutions, are investigated. It is shown that this chemical process occurring under physiological conditions leads not only to the dissolution of considerable amounts of calcium, but also to efficient diffusion of these ions through the osteocyte network structures. Finally, medullary bone which is intended as a labile calcium source for daily egg shell formation in hens is used as a model system for rapid bone turnover rates. This bone type in particular indicates the importance of uniquely adapted, less stable mineral structures to fit the requirements for rapid bone resorption as well as reformation.

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In dieser Arbeit wird der Aufbau eines Raumtemperatur-Nahfeldmikroskopes und die Implementation eines neuen nichtoptischen Abstandsregelmechanismus beschrieben und die Ergebnisse verschiedener Abbildungsarten dargestellt. Eine theoretische Modellierung des Scherkraft-Detektionsmechanismus erlaubt ein gezieltes Design fuer eine Nachnutzung. Der Aufbau eines Tieftemperatur-Konfokalmikroskopes, das zum Tieftemperatur-Nahfeldmikroskop erweiterbar ist, wird dargelegt. Die Abhaengigkeit des Photobleichens einzelner Terrylen-Molekuele von der Temperatur wird untersucht. Beobachtungen der spektralen Diffusion von Terrylen-Molekuelen werden dargelegt. Den Hauptteil dieser Arbeit bilden Untersuchungen am N-V Farbzentrum im Diamant. Einzelne Defektzentren wurden bei tiefen Temperaturen abgebildet und mittels Fluoreszenz-Anregungsspektroskopie untersucht, die Fluoreszenz-Emissionsdynamik wurde mit Autokorrelationsmessungen studiert. Das Temperaturverhalten der Fluoreszenzintensitaet, die Autokorrelation der Fluoreszenzintensitaet und die verzoegerte Fluoreszenz beweisen die Existenz eines metastabilen Zustandes. Durch Einstrahlen einer zweiten Wellenlaenge verkuerzt sich die Verweilzeit im metastabilen Zustand und die mittlere Fluoreszenzrate wird erhoeht (Deshelving). Die Tieftemperaturspektren widersprechen in mehreren Punkten den aus der Literatur bekannten Werten, die an hoeherkonzentrierten Proben gemessen wurden. Diese Unterschiede werden diskutiert und sind mit einer in hoeherkonzentrierten Proben verstaerkten Verspannung zu erklaeren. Ein Vergleich mit Diamant-Nanokristalliten, in denen eine erhoehte Verspannung auftritt, bestaetigt den Zusammenhang zwischen schmalen Uebergaengen und wirkender Verspannung durch das Auftreten von schmalen Emissionslinien.

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Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.:ABKÜRZUNGEN 7 1. EINLEITUNG 9 1.1. APYRASEN 9 1.2. APYRASEN IN TIEREN 11 1.2.1. ROLLE DER NTPDASEN BEI DER THROMBOZYTENAGGREGATION 11 1.3. APYRASEN IN PFLANZEN 12 1.3.1. ROLLE EXTRAZELLULÄRER APYRASEN 13 1.3.2. GOLGI LOKALISIERTE APYRASEN 15 1.3.3. KENNTNISSTAND ÜBER APYRASEN IN A. THALIANA 16 1.4. VORARBEITEN 20 1.5. ZIELSTELLUNG 21 2. MATERIAL 22 2.1. GERÄTE 22 2.2. CHEMIKALIEN 23 2.3. HÄUFIG GENUTZTE PUFFER 24 2.4. BESONDERE VERBRAUCHSMATERIALIEN 24 2.5. KITS/STANDARDS 25 2.6. ENZYME 25 2.7. VEKTOREN 26 2.8. ZELLLINIEN 26 2.9. OLIGONUKLEOTIDE 27 2.10. ANTIKÖRPER (AK) 28 2.11. ANTIBIOTIKA/HERBIZIDE 28 2.12. VERWENDETE PFLANZENLINIEN 29 2.13. SCHLÜSSELNUMMERN (ACCESSION CODES) 29 2.14. SPEZIELLE SOFTWARE 30 3. METHODEN 31 3.1. ALLGEMEINE METHODEN 31 3.1.1. PFLANZENKULTIVIERUNG 31 3.1.1.1. Arabidopsis thaliana 31 3.1.1.2. Nicotiana benthamiana 31 3.1.2. KREUZEN VON A. THALIANA 31 3.1.3. TRANSFORMATION 31 3.1.3.1. Bakterien 31 3.1.3.2. Arabidopsis thaliana 32 3.2. MOLEKULARBIOLGISCHE METHODEN 33 3.2.1. PLASMIDPRÄPARATION 33 3.2.2. RNA-EXTRAKTION 33 3.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION 33 3.2.4. NACHWEIS DER INTEGRITÄT VON RNA UND CDNA 34 3.2.5. DNA-EXTRAKTION AUS PFLANZEN 34 3.2.6. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 35 3.2.7. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 35 3.2.8. REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 36 3.2.9. DNA-FÄLLUNG 36 3.2.10. KLONIERUNG DER ATAPY1-HIS UND SNAP-HIS IN E. COLI 36 3.3.1. KOMPLEMENTATION VON APYRASE DOPPELKNOCKOUT MUTANTEN 37 3.3.2. IMMUNFLUORESZENZ 38 3.3.2.1. Probenpräparation 38 3.3.2.2. Konfokale Mikroskopie 39 3.3.3. IN VIVO MIKROSKOPIE VON ATAPY1-GFP EXPRIMIERENDEN KEIMLINGEN 39 3.3.3.1. FM4-64 und Brefeldin A – Behandlung 39 3.3.3.2. Co-Lokalisation mit RabE1d, MEMB12, GOT1P-Homolog, SYP32 40 3.3.4. PROTOPLASTENISOLATION 40 3.3.5. PH-WECHSEL IM APOPLASTEN VON ATAPY1-GFP-KEIMLINGEN 41 3.4. PROTEIN-BIOCHEMISCHE METHODEN 41 3.4.1. PROTEINISOLATION 41 3.4.2. SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN 41 3.4.3. PROTEINBESTIMMUNG 42 3.4.4. SDS-PAGE 42 3.4.5. WESTERN BLOT 43 3.4.6. COOMASSIE-FÄRBUNG 43 3.4.7. KOLLOIDALE COOMASSIE-FÄRBUNG 44 3.4.8. PONCEAU-S-FÄRBUNG 44 3.4.9. IMMUNDETEKTION 44 3.4.10. PROTEINREINIGUNG MITTELS NI-NTA-SÄULENCHROMATOGRAPHIE 45 3.4.11. ISOLATION UND REINIGUNG DER ATAPY1-GFP AUS A. THALIANA 46 3.4.12. IN-VITRO TRANSLATION (IVT) ATAPY1-GFP UND ATAPY1-SNAP 46 3.4.13. QUANTIFIZIERUNG DES ATAPY1-SNAP-PROTEINS (IVT) 47 3.4.14. AKTIVITÄTSMESSUNG DER ATAPY1 48 3.4.14.1. Eisensulfat-Test 48 3.4.14.2. Malachitgrün-Test 49 4. ERGEBNISSE 50 4.1. SUBZELLULÄRE LOKALISATION DER ATAPY1 50 4.1.1. KOMPLEMENTATION DES LETALEN ATAPY1 UND ATAPY2 DOPPELKNOCKOUTS 50 4.1.2. DIE ATAPY1 IST IM GOLGI-APPARAT LOKALISIERT 55 4.1.2.1. Indirekte Immunfluoreszenz von AtAPY1-SNAP in Vesikeln 55 4.1.2.2. AtAPY1-GFP lokalisiert in Vesikeln 56 4.1.2.3. Keine Lokalisation der AtAPY1 in Plasmamembran und Apoplast 58 4.1.3. CO-LOKALISATIONSSTUDIEN DER ATAPY1-GFP 59 4.1.3.1. Keine Co-Lokalisation in sekretorischen Vesikeln 60 4.1.3.2. AtAPY1 ist Brefeldin A-sensitiv 61 4.1.3.3. AtAPY1 co-lokalisiert nicht mit FM4-64 64 4.1.3.4. Co-Lokalisation mit den Golgimarkerproteinen MEMB12, GOT1P-Homolog und SYP32 65 4.1.4. ATAPY1 IST EIN INTEGRALES MEMBRANPROTEIN 67 4.2. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ATAPY1 69 4.2.1. EXPRESSION DER ATAPY1 IN E. COLI 69 4.2.2. IN VITRO TRANSLATION DER ATAPY1 71 4.2.3. REINIGUNG DER ATAPY1 AUS A. THALIANA 74 4.2.4. AKTIVITÄTSBESTIMMUNG DER ATAPY1 75 5. DISKUSSION 77 5.1. BEDEUTUNG DER LOKALISATION DER ATAPY1 FÜR DIE APYRASEFORSCHUNG 77 5.2. FUNKTION DER ATAPY1 IM GOLGI-APPARAT 78 5.2.1. AKKUMULATION VON STÄRKEGRANULA IN CHLOROPLASTEN 79 5.2.2. ROLLE DER APYRASEN BEI DER ZELLDIFFERENZIERUNG 81 6. AUSBLICK 86 7. ZUSAMMENFASSUNG 88 8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 90 9. LITERATURVERZEICHNIS 92 10. ANHANG 106