Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-09-19T16:13:35Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Maria Elisa Alves Rosa.pdf: 3316589 bytes, checksum: 97596f3066b2982c655ce211d84132f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Flávia Ferreira(flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-09-22T16:47:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Maria Elisa Alves Rosa.pdf: 3316589 bytes, checksum: 97596f3066b2982c655ce211d84132f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-22T16:47:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Maria Elisa Alves Rosa.pdf: 3316589 bytes, checksum: 97596f3066b2982c655ce211d84132f9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPESB);National Institutes of Health (NIH). / A Leishmaniose Disseminada (LD) é forma grave de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), caracterizada pelo aparecimento de múltiplas lesões pleiomórficas, em mais de 2 segmentos corporais não contíguos. Ainda pouco compreendida, importante pelo caráter emergente, gravidade das lesões e dificuldade de tratamento. Objetivo: descrição dos aspectos clínicos, epidemiológicos, imunológicos e terapêuticos da LD. Desenho do Estudo: Série de casos, Corte Transversal e Coorte. Casuística, Material e Métodos: acompanhamento clínico de 121 pacientes de LD. Sangue periférico e tecido de 64 pacientes de LD e de Leishmaniose Cutânea (LC) foram avaliados quanto à produção in vitro e expressão tecidual de INFγ, TNFα, IL5, IL10, CCL2, CCL3, CCL11, CXCL9 e CXCL10. Resultados: apresentam maior risco de desenvolverem LD indivíduos adultos, do gênero masculino e lavradores. Envolvimento mucoso foi observado em 50% dos casos, 64% apresentaram entre 10 e 50 lesões, a reação de Montenegro foi positiva em 65% e Leishmania braziliensis foi identificada em 97% dos pacientes. Cura clínica foi observada em 36,8% dos pacientes com o uso de 1 a 4 séries de antimonial pentavalente (SbV); anfotericina B foi utilizada como medicação de resgate em 29% dos casos, com cura clínica em 100%. Pacientes adultos apresentaram um risco 9 vezes maior de falha terapêutica com o SbV que os menores de 18 anos. A produção in vitro de IFNγ e de TNFα foi mais baixa em pacientes com LD. A produção de CXCL9 foi mais elevado nos portadores de LD. A expressão tecidual das citocinas e quimiocinas foi equivalente nas 2 formas. Conclusões: adultos apresentam maior risco de falha terapêutica com o SbV. A avaliação imunológica sugere que os pacientes de LD apresentam resposta Th1 deslocada para os tecidos. / Salvador

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-04-24T19:50:20Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_ Maria Teixeira.pdf: 2708323 bytes, checksum: 1ed381eedc13288f43ff7b4dbfeb7222 (MD5) / Approved for entry into archive by Flávia Ferreira(flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-04-25T16:46:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_ Maria Teixeira.pdf: 2708323 bytes, checksum: 1ed381eedc13288f43ff7b4dbfeb7222 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-25T16:46:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_ Maria Teixeira.pdf: 2708323 bytes, checksum: 1ed381eedc13288f43ff7b4dbfeb7222 (MD5) / CNPq, CAPES, PROCAD – 0018/01-5, FAPESB / Dois artigos científicos resumem o presente estudo. No primeiro, é mostrado que duas cepas de L. braziliensis, isoladas de pacientes de diferentes Estados (Ceará e Bahia), são geneticamente diferentes e apresentam processos patológicos distintos em camundongos BALB/c. No segundo trabalho é demonstrada uma correlação entre padrões de expressão de quimiocinas, induzidas por estas duas cepas de L braziliensis, com a formação de lesão e a atração de leucócitos para o sítio inflamatório. O terceiro trabalho é uma revisão sobre o papel das quimiocinas e receptores de quimiocinas nas interações parasito-hospedeiro em leishmaniose. Em particular, a revisão focaliza os estudos que contribuíram para a compreensão sobre quimiocinas na infecção por leishmania. Os principais achados desses estudos são: 1. A L. braziliensis H3227 do Ceará apresentou genótipo diferente da L. braziliensis BA788 da Bahia, demonstrado por RAPD. 2. A cepa H3227 levou ao desenvolvimento de lesões pequenas que se resolveram, enquanto BA788 não causou lesões em camundongos BALB/c. 3. Em ambos os grupos de camundongos, a carga parasitária não diferiu significativamente no sítio de infecção e começou a reduzir com 30 dias de infecção. Nos linfonodos drenantes, entretanto, o número de parasitos aumentou durante o decorrer do estudo. 4. Após a inoculação do parasito, a cepa BA788 pareceu ativar mais precocemente uma reposta mais intensa tipo Th1. Camundongos infectados com BA788 produziram níveis mais altos de IFN-γ, o que se correlacionou com um maior número de células NK nas lesões destes animais. 5. Numa fase mais tardia, camundongos infectados com H3227 produziram mais IL-12p70 e IL-10 no sobrenadante de células recuperadas dos linfonodos. Esta regulação da produção de IL-10 coincidiu com o pico máximo do desenvolvimento da lesão e da carga parasitária nestes animais. 6. As maiores lesões causadas por H3227, em camundongos BALB/c, foi diretamente correlacionada com o aumento progressivo da reação inflamatória, mas não com a carga parasitária. 7. A expressão mais precoce e intensa das quimiocinas CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CXCL1/KC, CCL11/eotaxina, XCL1/linfotactina e dos seus respectivos receptores correlacionou-se com o maior influxo de leucócitos para as lesões induzidas por H3227 e com o aumento do processo inflamatório observado nos camundongos infectados com esta cepa, após 15 dias de infecção. 8. As diferenças observadas no processo inflamatório estavam correlacionadas com a virulência do parasito, uma vez que a cepa mais patogênica H3227 mostrou-se um recrutador mais potente de todas as células observadas no sistema do bolsão inflamatório, do que a menos patogênica BA788. Em conclusão, os achados apresentados aqui indicam que duas cepas de L. braziliensis geneticamente diferentes, embora apresentem carga parasitária semelhante no sítio de inoculação, podem estabelecer processos patológicos distintos e induzir expressão de quimiocinas em diferentes tempos e/ou intensidades, levando ao recrutamento diverso de células e respostas inflamatórias diferenciadas que poderiam finalmente estar envolvidas em diferentes apresentações da doença. / Salvador

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os antimoniais, drogas de escolha no tratamento da leishmaniose, apresentam bons resultados, porÃm com vÃrios efeitos colaterais e registros de resistÃncia. Nos Ãltimos anos, vem ocorrendo um aumento na busca por novas drogas antiparasitÃrias a partir de extraÃÃes de plantas. Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito leishmanicida in vitro e in vivo, de duas substÃncias isoladas de plantas medicinais, timol e lapachol, em relaÃÃo aos antimoniais. Bem como comparar os resultados obtidos in vitro com a resposta terapÃutica in vivo. As drogas, em concentraÃÃes que variaram de 0,008 a 4,0mg/ml, foram avaliadas contra amastigotas intracelulares de Leishmania (Viannia) braziliensis (LVb) in vitro e, em seguida, testadas em um modelo animal susceptÃvel (hamster) para confirmar a aÃÃo leishmanicida. In vitro, ambos, timol e lapachol, apresentaram efeito anti-amastigota, entretanto, in vivo, nÃo foram capazes de conter o desenvolvimento de lesÃes por LVb, nas concentraÃÃes de 14mg/kg/dia/i.m e 300mg/kg/dia/v.o, respectivamente. Tais resultados sugerem que possam ser convertidas em metabÃlitos inativos ou neutralizadas, perdendo sua aÃÃo leishmanicida. Os antimoniais apresentaram significante efeito anti-amastigota para LVb in vitro, entretanto, in vivo, apesar da aparente cura clÃnica, estas drogas (60mg/kg/dia) nÃo foram capazes de erradicar os parasitas dos tecidos. Na histopatologia, foi visto que lapachol induziu intensa necrose e apoptose no linfonodo, no entanto, nÃo reduziu a carga parasitÃria neste sÃtio. Encontramos ainda que, baÃo e linfonodo respondem de maneira diferente à infecÃÃo por Leishmania, uma vez que no baÃo ocorreu hipoplasia da polpa branca e no linfonodo, hiperplasia folicular. A leishmaniose tegumentar por LVb, no hamster, apresentou um padrÃo de infecÃÃo nÃo resolutivo, com linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, perda de peso e ausÃncia de granulomas no linfonodo e baÃo. Como a aÃÃo das drogas nÃo foi semelhante nos modelos in vitro e in vivo utilizados, o modelo in vivo parece refletir melhor o potencial terapÃutico das drogas, sendo, portanto, mais adequado à triagem de novas substÃncias para o tratamento da leishmaniose. / Antimonials, drugs of choice for the treatment of leishmaniasis, provide good results but have side effects and cases of resistance have been reported. In recent years, there has been an increase in the search for new antiparasitic drugs developed from plants extracts. This study aims to evaluate the leishmanicidal effects, both in vitro and in vivo, of two chemicals isolated from medicinal plants, tymol and lapachol, and compare that effect with the one obtained by antimonials. As well as to compare the results obtained in vitro with the therapeutical response in vivo. These compounds (0,008 to 4,0mg/ml) were evaluated in vitro against intracellular amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis (LVb), then tested in an animal model (hamster) to confirm the leishmanicidal activity. In vitro, both tymol and lapachol, exhibited an anti-amastigote effect whereas in vivo these substances were not able to stop the development of LVb-induced lesions in the concentrations of 14mg/kg/day/i.m and 300mg/kg/day/p.o, respectively. These results suggest that they might be getting transformed into non-active metabolite(s) or is neutralized, losing their leishmanicidal activity. The antimonials demonstrated efficacy in vitro as well in vivo. But, in spite of presenting a significant anti-amastigote effect in vitro for LVb and apparent clinical cure in vivo, these drugs (60mg/kg/day/i.m) could not completely eradicate the parasites from the tissues of LVb-infected animals. In the histopathological findings disclosed that, lapachol induced a severe lymph node necrosis and apoptosis, although it didnât reduce the parasitic load in that site. We also found out the spleen and lymph node respond differently to Leishmania infection, since in the spleen an intense withe pulp hypoplasia occurred whereas in the lymph node a remarkable follicular hyperplasia was the rule. LVb-induced tegumentary leishmaniasis in the hamster showed an unresolved pattern of infection, characterized by lymphadenopathy, hepatosplenomegaly, weight loss and absence of granulomas in the lymph node and spleen. Since the substance effects were not similar in the two models studied, in vitro and in vivo, the in vivo model appears to better reflect the therapeutic potencial of the drugs, therefore being more adequate for the screening of new substances for the treatment of leishmaniasis.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-29T13:16:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Josiane Silva Martins Carvalho.pdf: 768971 bytes, checksum: 1b2302804a368fa23b8330cae55b6d4a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T13:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Josiane Silva Martins Carvalho.pdf: 768971 bytes, checksum: 1b2302804a368fa23b8330cae55b6d4a (MD5) / Leishmania braziliensis é um dos principais causadores da leishmaniose tegumentar americana (LTA), doença endêmica na região de Corte de Pedra - Bahia, Brasil e em aproximadamente 88 países em todo o mundo, com maior concentração em áreas tropicais e subtropicais. Diversos estudos foram realizados empregando antígeno solúvel de leishmania (SLA), porém poucos relatam sobre antígenos de L. braziliensis, nativos ou recombinantes. São descritos na literatura antígenos de elevado peso molecular, o lipofosfoglicano (LPG) de membrana, moléculas de 72, 63, 46, 30, 20 e 11 KDa, além de histonas e heat-shock proteins (HSP). O presente trabalho teve como objetivos fracionar SLA de promastigotas de L. braziliensis e caracterizar as respostas imunológicas humoral e celular induzidas. Foram utilizados promastigotas cultivados em meio Schneider. O extrato total após sonicação, foi submetido à cromatografia em coluna de Bio-Gel P-60 e as frações obtidas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% e revelado com nitrato de prata. A reatividade humoral foi determinada por immunoblotting empregando plasma de pacientes com leishmaniose cutânea. A partir dos resultados obtidos, foram selecionadas duas fracões: F-VI: 64 KDa e F-V: 64, 47, 32 e 19 KDa, com as quais foi realizado o estudo da resposta celular. A medida da produção de citocinas (IFN-, TNF- e IL-10) por células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 15 pacientes com leishmaniose cutânea (LC) e 5 pacientes com leishmaniose mucosa (LM) foi determinada pelo método de ELISA. Foram obtidos os seguintes resultados: para LC: IFN-: 180,0233,2 pg/mL (F-VI) e 611,6 603,4 pg/mL (F-V) (p=0,0164); TNF-: 793,9555,6pg/mL (F-VI) e 780,3739,7 pg/mL (F-V) (p>0,05) e IL-10: 54,663,5 pg/mL (F-VI) e 35,938,8 pg/mL (F-V) (p>0,05). Para os pacientes com LM: IFN-: 69,2  64,9 pg/mL (F-VI) e 389,0612,6 pg/mL (F-V) (p>0,05); TNF-: 583,1637,4 pg/mL (F-VI) e 552,2589,2 pg/mL (F-V) (p>0,05) e IL-10: 22,324,0 pg/mL (F-VI) e 30,950,6 pg/mL (F-V) (p>0,05). CMSP de pacientes com LC foram estimuladas a produzir altos níveis de IFN- e TNF- e baixos níveis de IL-10, especialmente pela FÇ-V. Nas CMSP dos pacientes com LM, houve alta produção das citocinas de resposta Th1, porém sem diferença estatisticamente significativa, além de uma discreta produção de IL-10. A avaliação da correlação mostrou que nas CMSP dos pacientes LM estimuladas pela FÇ-V, o IFN- produzido favoreceu significativamente a produção de TNF- (p=0,037). A reação sorológica revelou que apenas os plasmas dos pacientes com LC reconheceram as moléculas de 64, 32 e, mais fracamente, 19 KDa. Esses dados sugerem uma provável participação ativa destas moléculas na indução da resposta à leishmaniose e que, em LM a associação destes antígenos pode contribuir para o aumento da lesão, enquanto que nos pacientes LC esta associação pode ter um efeito imunoprotetor.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-02-20T18:16:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Jacilara Alexandrino Conceição.pdf: 856676 bytes, checksum: 479a49d19cc6988235dc9071b5950c30 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-20T18:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Jacilara Alexandrino Conceição.pdf: 856676 bytes, checksum: 479a49d19cc6988235dc9071b5950c30 (MD5) / Introdução: Pacientes com leishmaniose cutânea (LC) desenvolvem uma resposta inflamatória, caracterizada por alta produção de TNF-α e IFN-γ, que são essenciais na morte do parasito, mas contribuem com o desenvolvimento das lesões. Como a resposta imune adaptativa não está associada à proteção na leishmaniose tegumentar, é importante compreender o papel da resposta imune inata na patogênese da LC. Embora os macrófagos sejam as principais células hospedeiras da Leishmania, os neutrófilos (PMN) são as primeiras células a migrarem para o sítio de infecção e podem promover a morte do parasito. Diversos estudos têm demonstrado a participação dos PMN na resposta inicial à infecção em modelos experimentais de leishmaniose cutânea. No entanto, o papel dos PMN na leishmaniose cutânea humana causada por L. braziliensis ainda não é conhecido. Objetivo: Avaliar o papel dos neutrófilos na leishmaniose tegumentar humana causada por L. braziliensis. Materiais e Métodos: Neutrófilos de pacientes com LC (n=21) e de controles sadios (CS) (n=17) foram infectados com L. braziliensis na proporção de 5 parasitos por célula. A frequência de neutrófilos infectados e a carga parasitária foram quantificadas por microscopia óptica após coloração pelo método de Panótico, das lâminas preparadas por citocentrifugação. Marcadores de ativação e de migração (CD66b,CD11b e CD62L) bem como a produção de burst oxidativo mensurada pela fluorescência de DHR-123 foram avaliadas por citometria de fluxo. A produção de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9), CXCL9 e CXCL10 (quimiocinas envolvidas na ativação e recrutamento de células Th1) foi avaliada através do teste imunoenzimático (ELISA). Resultados: Após 180 minutos de infecção com L. braziliensis, os neutrófilos de pacientes com LC foram mais infectados do que os neutrófilos de controles sadios. Baseado na expressão de CD66b e de CD11b, os neutrófilos de pacientes foram menos ativados após infecção, quando comparados com os CS. A freqüência de neutrófilos de pacientes expressando CD62L não reduziu após a infecção, possivelmente indicando capacidade migratória reduzida. O parasito induziu maior produção de burst oxidativo nos neutrófilos de pacientes do que nos de controles sadios e aumentou a produção de MMP-9 em ambos os grupos. Após a infecção com o parasito, os neutrófilos de pacientes com LC produziram maior concentração de CXCL9 do que os de controles sadios, indicando que estas células de pacientes com LC podem participar do recrutamento de outras células envolvidas com a progressão da doença. Conclusão: Nossos dados demonstraram, pela primeira vez, que os neutrófilos de pacientes com leishmaniose cutânea apresentam um perfil de ativação diferente dos neutrófilos de controles sadios. Esses dados sugerem que os neutrófilos podem contribuir com a patogênese da doença através do recrutamento e ativação das células Th1.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-11T13:35:46Z No. of bitstreams: 1 fabriciaaparecidarezendesoares.pdf: 1857440 bytes, checksum: f25c08dc77a5f4ef171b000924735ca2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-14T17:09:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fabriciaaparecidarezendesoares.pdf: 1857440 bytes, checksum: f25c08dc77a5f4ef171b000924735ca2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T17:09:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabriciaaparecidarezendesoares.pdf: 1857440 bytes, checksum: f25c08dc77a5f4ef171b000924735ca2 (MD5) Previous issue date: 2007-12-11 / Uma ATP difosfohidrolase foi identificada em promastigotas de Leishmania braziliensis, e resultado similar foi encontrado em outra cepa de Leishmania, pertencente ao Complexo Leishmania braziliensis. Hidrólise de nucleosídeos di- e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes, associada à inibição por azida sódica, sugeriram que atividade ATP difosfohidrolásica está presente em promastigotas. Western blots desenvolvidos com anticorpos anti-apirase de batata produzidos em coelho revelaram bandas de 48 e 43 kDa, possivelmente sub-unidades da mesma proteína. Estes anticorpos imobilizados em Proteína A-Sepharose depletaram aproximadamente 85% da atividade ATPásica ou ADPásica da ATP difosfohidrolase solubilizada em C12E9. O complexo imunoprecipitado (resina-anticorpo-antígeno) foi separado por SDS-PAGE. Através de western blots desenvolvidos com anticorpos anti-apirase de batata produzidos em camundongos, a mesma banda de 48 kDa foi identificada nas duas cepas, confirmando que as proteínas do parasito e da batata compartilham epítopos. Além disso, o peso molecular coincidente sugeriu que esta ATP difosfohidrolase corresponde a um nucleosídeo difosfatase identificada no genoma de L. braziliensis como pertencente à família das NTPDases. Estreita relação estrutural e evolucionária foram então demonstradas entre a apirase de batata e a NDPase de L. braziliensis por cladograma, alinhamento de seqüências de aminoácidos, predição de epítopos e modelagem molecular. Domínios específicos parecem estar potencialmente envolvidos na resposta imune do hospedeiro, conservados entre estes diferentes organismos. Devido a esta imunoreatividade cruzada observada entre a apirase de batata e a ATP difosfohidrolase de L. braziliensis, também sugerido por análises in silico, western blots foram desenvolvidos com soros de pacientes com LTA, e os resultados sugeriram que estes epítopos compartilhados são antigênicos para o humano. Os níveis de anticorpos contra a proteína vegetal ou contra o homogeneizado de L. braziliensis foram então analisados em 21 amostras de soros de pacientes com LTA. Aproximadamente 84% deles têm soropositividade de IgG para Lb ou apirase de batata. Correlação positiva foi observada entre os níveis de IgG e os níveis elevados dos subtipos IgG1 e IgG3 contra Lb, ambos com 76% de soropositividade em pacientes com LTA. Interessantemente, aumentos significativos dos níveis de IgG1 (71% de soropositividade) e IgG3 (43% soropositividade) contra a apirase de batata foram também observados. Elevada soropositividade de IgG4 para Lb (62%) e apirase de batata (48%), mas não de IgG2 (<24%), evidenciaram que a ATP difosfohidrolase do parasito é também capaz de estimular este subtipo de IgG. Soropositividade de IgA para Lb ou apirase de batata foi de 62% e 14%, respectivamente, enquanto para IgM ou IgE foi baixa em ambas preparações (<14%). Estes resultados sugerem que os domínios compartilhados entre a apirase de batata e a ATP difosfohidrolase de L. braziliensis contribuem com a elevação de IgG contra antígenos de promastigota, associada a maior produção de IgG1, IgG3 e IgG4. Esta é a primeira demonstração de uma ATP difosfohidrolase ativa em promastigotas de L. braziliensis, de sua imunoreatividade cruzada com anticorpos anti-apirase de batata, e de propriedades antigênicas dos domínios conservados entre elas em pacientes com LTA. Estudos destes domínios compartilhados poderão levar ao desenvolvimento de novas drogas, marcadores moleculares ou vacinas. / ATP diphosphohydrolase was identified in Leishmania braziliensis promastigote, and similar result was found in other Leishmania strain, typified as belonging to the Leishmania braziliensis Complex. The significant hydrolysis of di- or triphosphate nucleosides upon bivalent metal ion stimulus, associated to the inhibition promoted by sodium azide, suggested strongly that ATP diphosphohydrolase activity is present in promastigote preparations. Western blots developed with rabbit polyclonal anti-potato apyrase revealed bands of 48 and 43 kDa, possibly subunits of the same protein. These antibodies immobilized on Protein A-Sepharose depleted about 85% of the ATPase or ADPase activity from C12E9-solubilized ATP diphosphohydrolase. The immunoprecipitated resin-rabbit antibody-antigen complex was separated by SDS-PAGE, and Western blots developed with mouse polyclonal anti-potato apyrase antibodies identify the same 48 kDa band in the two promastigote strains, confirming that parasite and vegetable proteins share epitopes. Furthermore, the coincident molecular weigh suggested that this active ATP diphosphohydrolase corresponds to the putative nucleoside diphosphatase identified in L. braziliensis genome as belonging to NTPDase family, whose amino acid sequence was recently deposited in GeneBank database from NCBI. Evolutionary and closer structural relationships were then demonstrated between potato apyrase and Leishmania braziliensis NDPase by phylogenetic analysis, alignment of amino acid sequences, peptides prediction and molecular modeling. Specific protein domains are suggested to be potentially involved in the immune response. They also seem to be conserved during host and parasites co-evolution. Due to this cross-immunoreactivity between potato apyrase and ATP diphosphohydrolase from Leishmania (V.) braziliensis promastigotes, also suggested by in silico analyses, Western blots were developed with antibody present in sera from patients with American cutaneous leishmaniasis (ACL), and the results suggested that these shared epitopes are antigenic for host human. The antibody levels against the vegetable protein or against Leishmania braziliensis promastigote antigens preparation were then analyzed in 21 serum samples from patients with ACL. About 84% of them have IgG seropositivity for L. braziliensis promastigote antigens (Lb) or potato apyrase. Positive correlation was observed between IgG and the elevated IgG1 or IgG3 subtypes levels against Lb, both subtypes com 76% seropositivity in ACL patients. Interestingly, significant elevations of the IgG1 (71% seropositivity) and IgG3 (43% seropositivity) levels against potato apyrase were also observed. High IgG4 seropositivity for both Lb (62%) and potato apyrase (48%), but not of IgG2 (<24%), evidenced that parasite ATP diphosphohydrolase is also capable to stimulate this IgG subtype. IgA seropositivity for Lb or potato apyrase was 62% and 14%, respectively, while IgM or IgE antibody seropositivity was low for both preparations (<14%). These results suggest that the domains shared between potato apyrase and Leishmania braziliensis ATP diphosphohydrolase contribute with IgG antibody level elevation against promastigote antigens, associated to higher IgG1, IgG3 and IgG4 subtype production. It is the first demonstration of an active ATP diphosphohydrolase in Leishmania braziliensis promastigote form, of its cross-immunoreactivity with anti-potato apyrase antibody, and antigenic properties of conserved domains in ACL patients. Further studies of these shared domains could lead to the development of new drugs targets, molecular markers or implementation of vaccines.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-08-11T13:08:29Z No. of bitstreams: 1 Marcia Weber Carneiro. Expressão... 2014.pdf: 2460839 bytes, checksum: d1f20b5216588e233b534015a0642dd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-11T13:08:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia Weber Carneiro. Expressão... 2014.pdf: 2460839 bytes, checksum: d1f20b5216588e233b534015a0642dd8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Células de voluntários saudáveis, expostas in vitro a Leishmania, podem produzir altos níveis de IFNG na primeira exposição ao parasita, caracterizando os indivíduos como alto respondedores (AR), ou baixos níveis de IFNG, caracterizando os indivíduos baixo respondedores (BR). O objetivo deste estudo foi estudar o perfil de expressão gênica associado ao padrão de produção de IFNG de indivíduos AR e BR. Também avaliamos se as assinaturas gênicas identificadas nos indivíduos AR e BR se associam com o padrão de resposta imune observado em indivíduos de área endêmica identificada como subclínicos (SC) ou portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada (LC). Inicialmente, Células Mononucleares do Sangue Periférico (CMSP) de voluntários saudáveis foram estimuladas in vitro com Leishmania braziliensis e identificamos indivíduos AR (com produção de IFNG acima de 330 pg/ml) e indivíduos BR (com produção abaixo de 215 pg/ml). Em seguida, analisamos a expressão gênica desses indivíduos utilizando microarranjos e validamos a expressão de alguns genes por PCR em tempo real. Indivíduos AR apresentaram 32 moléculas moduladas significativamente, sendo que 27 foram moduladas positivamente e apenas 5 negativamente. Por outro lado, nos indivíduos BR, 28 moléculas foram moduladas significativamente, sendo 18 positivamente e 10 negativamente. Utilizando o programa IPA, as moléculas moduladas nos indivíduos AR foram associadas a uma rede envolvendo resposta antimicrobiana, resposta imune humoral e síntese de proteínas. Nestes indivíduos, a via de sinalização canônica mais significativa está associada com a comunicação entre o sistema imune inato e adaptativo. Em indivíduos BR, os genes significativamente modulados foram associados a uma rede envolvendo a resposta imune humoral, síntese de proteína e sinalização celular. Nestes indivíduos, a via canônica mais significativa está associada com a resposta de receptores do tipo Toll. Selecionamos um grupo de genes (IFNG, IFI27, IL6, IRF1, TNF, IL10, CXLC10 e, JAK2), entre os diferencialmente modulados, e a expressão desses foi validada por PCR em tempo real, tanto nos indivíduos AR quanto nos BR. Por fim, a expressão desses genes foi avaliada em CMSP de pacientes com LC e em indivíduos SC, após o estímulo com L. braziliensis. Assim, foi possível determinar uma assinatura no qual os indivíduos SC apresentam maior expressão (p<0.01) de CXCL10, IFI27 e IL6, como nos indivíduos AR, enquanto os pacientes com LC apresentam menor expressão dessas moléculas, como nos indivíduos BR. Deste modo, outras moléculas, que não as citocinas clássicas IFNG e IL10, podem ter seu perfil de expressão associado ao desenvolvimento ou não da LC. / Naïve volunteers exposed to Leishmania in vitro can be high IFNG producers, characterizing a high-responder (HR), or low IFNG producers, characterizing a low-responder (LR). The purpose of this work is to characterize the gene expression profile associated to IFNG production in HR and LR individuals. Formerly, we analyzed if the gene signature identified could be associated with the pattern of immune response in individuals from endemic areas identified as subclinical (SC), or patients with Localized Cutaneous Leishmaniasis (LC). Initially, we stimulated Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) from healthy volunteers in vitro with Leishmania braziliensis where we identified HR (IFNG production above 330 pg/ml) and LR (IFNG production below 215 pg/ml). Next, we analyzed the expression of 314 genes using real time PCR arrays. HR presented 32 significantly modulated molecules, being 27 positively modulated and only 5 negatively modulated. Still, LR presented 28 significantly modulated molecules, and that 18 were positively modulated and 10 negatively. Employing Ingenuity software, we associated molecules detected in HR with network involving antimicrobial response, humoral immune response and protein synthesis. In these individuals, the most significant canonical pathway associated was the communication between innate and adaptive immune cells. In LR, there was an association of identified genes with humoral immune response, protein synthesis and cellular signaling network. In these individuals, the most significant canonical pathway associated was role of pattern recognition receptors. We selected a group of genes, between the most modulated genes (IFNG, IFI27, IL6, IRF1, TNF, IL10, CXLC10 and JAK2), and their expression were validated by real time PCR, in both HR and LR individuals. At last, we analyzed the expression of this selected genes in PBMCs from patients with LC and in SC individual. In this manner, we were able to determine a signature that SC individual express more (p<0.01) CXCL10, IFI27 and IL6, as in HR, while LC patients express less, as in LR. This way, there are molecules, other than the classical IFNG and IL10, which correlates with disease progression or not

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T17:10:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Walker Oliveira.pdf: 646440 bytes, checksum: 715267f8e674a7d1a347adde1fef2b75 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-12T17:10:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Walker Oliveira.pdf: 646440 bytes, checksum: 715267f8e674a7d1a347adde1fef2b75 (MD5) / NIH Grant; CAPES / Introdução: A forte resposta do tipo Th1, com produção exagerada de IFN- e TNF-α, observada na leishmaniose tegumentar humana causada por Leishmania braziliensis está associada com a destruição tecidual e desenvolvimento de lesão observada em pacientes com leishmaniose cutânea (LC) e em pacientes com leishmaniose mucosa (LM). Em contraste com essas formas clínicas, 10% dos indivíduos residentes em área endêmica, apesar de apresentarem reação de hipersensibilidade tardia para o antígeno de Leishmania, não apresentam evidências de doença clínica e são considerados como tendo a forma subclínica (SC) da doença. A produção de IFN-γ e TNF-α nestes indivíduos é menor quando comparada com pacientes com LC. Existem várias evidencias que a forte resposta inflamatória não modulada está associada com a patogênese da LC e da LM. Embora os indivíduos SC apresentem uma resposta inflamatória mais fraca, ainda não é bem conhecido como eles controlam a infecção. Uma resposta Th1 eficiente e modulada pode estar envolvida na proteção da infecção por L. braziliensis. A modulação da resposta imune é feita principalmente por citocinas moduladoras como IL-10, TGF-β e mais recentemente por IL-27. Objetivo: Avaliar o papel de citocinas regulatórias e de antagonistas de citocinas na modulação da resposta imune na infecção por L. braziliensis. Metodologia: Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de 40 pacientes com LC, 18 com LM e 13 indivíduos com infecção subclínica foram estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania (SLA) na presença e ausência de citocinas regulatórias (IL-10, IL-27 e TGF-β) ou antagonistas de citocinas (α-TNF-α e α-IFN-γ). A produção de citocinas (IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-γ) foi mensurada através da técnica de ELISA e de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Resultados: IL-10 e TGF-β apresentaram atividade moduladora da produção de TNF-α e IL-17, sobretudo na LC, enquanto IL-27 não apresentou efeito modulador na produção de TNF-α, IFN-γ e IL-17 em nenhuma das formas clínicas da leishmaniose tegumentar. A neutralização de TNF-α diminuiu a produção de IFN-γ, mas não alterou a produção de IL-10, enquanto a neutralização de IFN-γ diminuiu a produção de TNF-α e aumentou a produção de IL-10 nesses pacientes. A produção de IL-17 foi maior nos indivíduos SC, embora sem significância estatística e a neutralização de IL-10 não alterou a produção de IFN-γ nesses indivíduos. Entretanto a expressão de IL-27 foi maior em pacientes com LC quando comparado com os indivíduos SC. Conclusões: IL-10 e TGF-β parecem ser as citocinas mais envolvidas na modulação da resposta imune em pacientes com LC e LM, principalmente IL-10, desde que a neutralização de IFN-γ diminui a produção de TNF-α de uma forma dependente de IL-10. A produção de IL-17 nos indivíduos SC sugere que essa citocina pode estar envolvida na proteção contra a infecção por L. braziliensis. / Salvador

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-25T15:21:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Ludmila Porto Mendes Polari.pdf: 1622619 bytes, checksum: 95b9c669923025a1b43b0a5623e3ab64 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-25T15:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Ludmila Porto Mendes Polari.pdf: 1622619 bytes, checksum: 95b9c669923025a1b43b0a5623e3ab64 (MD5) / Introdução. A leishmaniose cutânea (LC) causada por Leishmania braziliensis é caracterizada por forte resposta imune do tipo Th1, importante para a eliminação do parasito, mas associada com o desenvolvimento das lesões. Apesar dos vários estudos sobre a imunologia da LC, vários aspectos sobre os estágios iniciais da infecção permanecem desconhecidos. Os receptores toll-like (TLR) são expressos em diversos tipos celulares, como monócitos, e a ativação desses receptores está associada à síntese de citocinas pró-inflamatórias, que iniciam a resposta imune inata. Entretanto, ainda não se tem certeza do papel dos TLRs na LC humana. Objetivo: Caracterizar a expressão dos TLRs 2 e 4 nas subpopulações de monócitos de pacientes com leishmaniose cutânea. Materiais e métodos: As expressões dos TLRs 2 e 4 e de TNF e de IL-10 foram avaliadas por citometria de fluxo nas subpopulações de monócitos de 37 pacientes com LC e 21 indivíduos sadios (CS), ex-vivo e após infecção in vitro com L. braziliensis marcados com CFSE. Resultados: A expressão dos TLRs 2 e 4, ex-vivo e após infecção com L. braziliensis, foi maior nos pacientes com LC quando comparada com CS. A expressão desses receptores é maior nos monócitos infectados com L. braziliensis em relação aos não infectados, e também é maior nas células CD14highCD16+ (monócitos intermediários) quando comparado com células CD14highCD16- (monócitos clássicos) e CD14lowCD16+ (monócitos não-clássicos). A expressão intracelular de TNF e de IL-10 foi maior nos monócitos CD14high (clássicos e intermediários) infectados com L. braziliensis que expressam os TLRs 2 e 4. Conclusão: O aumento na expressão dos TLRs 2 e 4 em monócitos de pacientes com LC, após infecção com L. braziliensis, está associado ao aumento intracelular de TNF, sugerindo que a ativação desses receptores pode contribuir para a forte resposta inflamatória observada na leishmaniose tegumentar.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde (pos.saude@ufba.br) on 2017-09-28T13:14:20Z No. of bitstreams: 1 TESE Aline Muniz.pdf: 4528280 bytes, checksum: 1946bc2b7d10cc438a4d5f012ee6f207 (MD5) / Approved for entry into archive by Uillis de Assis Santos (uillis.assis@ufba.br) on 2017-09-28T13:20:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE Aline Muniz.pdf: 4528280 bytes, checksum: 1946bc2b7d10cc438a4d5f012ee6f207 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-28T13:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Aline Muniz.pdf: 4528280 bytes, checksum: 1946bc2b7d10cc438a4d5f012ee6f207 (MD5) / INTRODUÇÃO: Leishmaniose cutânea (LC) é a forma clínica mais comum causada por Leishmania braziliensis. Dez a 15% de indivíduos sadios residentes em uma área endêmica de Leishmania sem história prévia de LC apresentam um teste intradérmico para o antígeno solúvel de leishmania (SLA) positivo e são considerados como tendo a forma subclínica (SC) da doença. Os mecanismos envolvidos no controle da infecção SC por L. braziliensis são desconhecidos. OBJETIVO: Determinar fatores imunológicos associados com o desenvolvimento da infecção subclínica ou da leishmaniose cutânea (LC) em indivíduos expostos à infecção por Leishmania braziliensis. METODOLOGIA: Uma coorte de 308 contatos familiares (CF) de pacientes com LC, sem história de doença foi estabelecido em 2010 em uma área endêmica de leishmaniose tegumentar. Os indivíduos foram acompanhados por cinco anos e participaram de avaliações clínicas e estudos imunológicos. A avaliação da produção de IFN-γ e quimiocinas em culturas de sangue total estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania (SLA) e o teste de intradermo reação de Montenegro (RM) foram realizados no início do estudo (ano zero), ano dois e no ano quatro. A identificação das células produtoras de IFN-γ foi realizada por citometria de fluxo e foi determinada a capacidade dos monócitos em controlar a infecção por Leishmania. Durante todo o período os indivíduos foram monitorados para identificar o aparecimento de LC. RESULTADOS: A infecção por L. braziliensis foi evidenciada em 118 (38,3%) indivíduos. LC foi documentada em 45 (14,6%) indivíduos, 101 (32,8%) apresentaram infecção SC e 162 (52,6%) não tinham indícios de exposição à L. braziliensis. A razão de infecção para a doença foi de 3,2:1 e apenas 3% dos indivíduos que apresentaram apenas produção de IFN-γ adoeceram. Houve uma correlação direta e uma concordância razoável entre a RM e a produção de IFN-γ [κ: 0,23 (95% IC: 0.12-0.35)]. Enquanto a produção de IFN-γ por células NK foi associada com proteção, uma RM positiva não impediu o desenvolvimento da doença. Monócitos de indivíduos SC controlaram mais a infecção do que monócitos de indivíduo com LC. Pode haver negativação tanto da RM quanto da produção de IFN-γ. CONCLUSÕES: Proteção contra a LC foi associada com a produção de IFN-γ por células NK, resultados do teste intradérmico negativos e maior capacidade dos monócitos dos indivíduos SC em impedir e controlar o crescimento do parasito na infecção por L.braziliensis.