Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-29T14:12:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Doutorado -Andresa-Pereira de Oliveira-Mendes- 2015.pdf: 8328092 bytes, checksum: 5171c239f32fd47c0d02f30e0730fd54 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-29T14:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Doutorado -Andresa-Pereira de Oliveira-Mendes- 2015.pdf: 8328092 bytes, checksum: 5171c239f32fd47c0d02f30e0730fd54 (MD5) Previous issue date: 2015-03-05 / FACEPE / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é um problema de saúde pública, que afeta a produtividade e a vitalidade das pessoas. Embora estudos avaliem a resposta humoral na LTA, ainda não está completamente esclarecido o papel de anticorpos específicos na imunidade contra Leishmania. Além dos desafios sócio-econômicos que agravam ainda mais o problema da LTA, o diagnóstico da doença demonstra dificuldades, sendo freqüentemente necessário à correlação de vários elementos para se chegar ao diagnóstico definitivo. Dessa maneira, o objetivo desse estudo, foi avaliar o uso da citometria de fluxo, como uma metodologia alternativa na avaliação diagnóstica em indivíduos com LTA ativa (AT), como critério de cura pós-terapêutica em indivíduos após o tratamento (PT), naqueles com cura clínica espontânea (CE) e em indivíduos com outras doenças (doença de Chagas – DC, leishmaniose visceral–LV, hanseníase e esporotricose). A reatividade relatada pela citometria de fluxo, utilizando promastigotas vivas e fixadas de Leishmania (Viannia) braziliensis foi respectivamente, 86% e 90% de porcentagem de parasitas fluorescentes positivos (PPFP). Por análise comparativa, entre citometria de fluxo e imunofluorescência indireta, utilizando os pacientes AT, 1, 2 e 5 anos PT, verificou-se que a citometria de fluxo mostrou sensibilidade de 86% e especificidade de 77%, enquanto a IFI teve uma sensibilidade de 78% e especificidade de 85%. Contudo esta técnica teve confirmada a sua aplicabilidade no critério de cura da LTA. Analisando os resultados apresentados pelos pacientes CE, obtivemos um desempenho com 100% de especificidade. O diagnóstico diferencial da LTA que utiliza soros de pacientes DC e LV demonstrou reação cruzada, revelando resultados falso-positivos. No entanto, a utilização de soros de pacientes com esporotricose, tuberculose e hanseníase, demonstrou potencial para o uso da citometria de fluxo no diagnóstico diferencial. O estudo mostrou que os ensaios realizados utilizando anticorpos IgG, detectados por Leishmania (V.) braziliensis na citometria de fluxo, representam uma ferramenta alternativa para o diagnóstico da LTA e também abrem perspectivas para a utilização no monitoramento e critério de cura da LTA. / American tegumentar leishmaniasis (ATL) is a public health problem, affecting the productivity and vitality. Although there are studies to assess the humoral response in the ATL, is not yet fully understood the role of specific antibodies in immunity against Leishmania. In addition to the socioeconomic challenges that further aggravate the problem of ATL, the diagnosis shows difficulties and is often necessary to the correlation of various elements to reach a definitive diagnosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the use of flow cytometry as an alternative methodology in the diagnostic evaluation in patients with active ATL before treatment (BT), as post-therapy cure criteria in individuals after treatment (AT), those with spontaneous clinical cure (EC) and in individuals with other diseases (Chagas disease - CD, visceral leishmaniasis-LV, leprosy and sporotrichosis). The reactivity reported by flow cytometry, using live and fixed promastigotes of Leishmania (V.) braziliensis were respectively 86% and 90% percentage of positive fluorescent parasites (PPFP). A comparative analysis of flow cytometry and indirect immunofluorescence using patient AT, 1, PT 2 and 5 years, it has been found that the flow cytometry showed a sensitivity of 86% and specificity of 77% and had a sensitivity IIF of 78% and specificity of 85%. Though this technique has confirmed its applicability in the healing criterion of ATL, analyzing the results presented by the EC patients achieved a performance with 100% specificity. The differential diagnosis of ATL using sera from patients of CD and LV demonstrated cross-reactivity, revealing false-positive results. Moreover, the use of sera from patients with sporotrichosis, tuberculosis and leprosy showed potential for the use of flow cytometry in the differential diagnosis. The study showed that testing performed using IgG antibodies, detected by Leishmania (V.) braziliensis in flow cytometry, are an alternative tool for the diagnosis of ATL and also open up prospects for use in monitoring and in its cure criterion.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-08-11T18:54:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertacao Beatriz Coutinho - PPGIT - 2016.pdf: 2557511 bytes, checksum: cec4295c75245942ea5b334cef899eba (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-11T18:54:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertacao Beatriz Coutinho - PPGIT - 2016.pdf: 2557511 bytes, checksum: cec4295c75245942ea5b334cef899eba (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Capes / O tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) apresenta limitações por ser tóxico, podendo causar efeitos adversos nos pacientes, e também, por não existir um critério de cura efetivo, que atualmente é realizado apenas clinicamente, visualizando a completa cicatrização da lesão. Além dos desafios socioeconômicos que agravam a doença, o seu diagnóstico apresenta dificuldades, pois além de haver a necessidade de realizar associações entre os aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais dos pacientes para se chegar a um resultado definitivo, os testes laboratoriais convencionais apresentam limitações. O objetivo do trabalho foi avaliar a aplicabilidade dos isotipos de imunoglobulinas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) por citometria de fluxo para o diagnóstico e critério de cura na leishmaniose tegumentar americana, e fazer um comparativo da citometria de fluxo em relação às técnicas convencionais: ELISA e Imunofluorescência Indireta. Foram utilizadas amostras de 14 pacientes, sobre as quais foram feitos os ensaios. Com relação aos resultados da comparação da citometria de fluxo, utilizando o anticorpo IgG, com a Imunofluorescência, foi visto que houve uma melhor acurácia do primeiro em relação ao segundo. Em comparação ao ELISA, a citometria também demonstrou ser um teste com melhor desempenho. Para a padronização dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3, foi observado que a melhor diluição do isotipo IgG1 para ser utilizada foi a diluição 1:400, para o isotipo IgG2, 1:100 e para o isotipo IgG3 1:200. Devido a baixa quantidade sérica circulante de IgG4 e pelo fato de ser mais encontrado em amostras de pacientes com a forma cutânea difusa (ausente em nosso Estado), não foi possível padronizar este isotipo. Na avaliação da aplicabilidade do isotipo IgG1, foi observado que antes do tratamento, 36,8% dos pacientes foram negativos; nos pacientes um ano após o tratamento, 82,3%; dois anos após o tratamento, 27,2% e nos pacientes cinco anos após tratamento, 87,5%. Portanto, a análise global dos resultados obtidos sugere que a citometria de fluxo aplica-se ao rastreamento da LTA e que a utilização do isotipo IgG1 tem grandes possibilidades para contribuir como um método de diagnóstico mais específico do que os convencionais. / The treatment for the American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) has limitations due to its toxicity, which can cause adverse effects on the patients; and also for not presenting an effective cure criterion, being currently performed by visualizing the complete healing of the lesion. Besides socio economical challenges which worsen the disease, the diagnosis shows difficulties because beyond the need to associate clinical, epidemiological and laboratorial aspects to achieve the definitive result, the conventional laboratorial tests are limited. Thereby, the objective of the study was to evaluate the applicability of immunoglobulin isotypes (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) by flow cytometry for the diagnosis and cure criterion of the American tegumentary leishmaniasis, comparing this tool with the conventional tests of ELISA and Indirect Immunofluorescence. 14 samples of patients were used for the assays. Regarding the results of the comparison between flow cytometry using anti-IgG antibodies with the indirect immunofluorescence, it was observed that the accuracy of the first test was higher than the second's. The same was observed when compared flow cytometry with ELISA. Regarding the standardization of the IgG isotypes 1, 2 and 3, it was seen that the best dilutions to work with were respectively 1:400, 1:100 and 1:200. Due to the low quantities of the IgG4 isotype in the sera and for the fact that it is found in samples of patients with the diffuse form (absent in the Northeastern Brazil), it was not possible to standardize. Evaluating the applicability of IgG1, we observed that before treatment 36,8% of the patients were negative, one year after treatment, 82,3%; two years after treatment, 27,2% and in patients five years after treatment, 87,5%. The global analysis of the obtained results suggests that flow cytometry can be used to screen ATL and that the use of IgG1 isotype has great chances of contributing as a more specific method than the conventional ones. More studies with IgG2 and IgG3 isotypes are necessary, raising the number of samples. However, this area still has good perspectives on the diagnosis and cure criterion of the disease.

Orientadora: Profa. Dra. Mirela Inês de Sairre / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / As licochalconas estão naturalmente presentes na raiz de Glycyrrhiza inflata (alcaçuz) e apresentam atividades biológicas, como antitumoral, antiparasitária, anti-oxidativa e bactericida. A licochalcona "A" apresentou atividade anti-leishmania, o que despertou o interesse em investigar e testar o uso para tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC), uma zoonose grave que atinge os cães domésticos, os quais são sacrificados em virtude da falta de uma terapia eficiente. O objetivo deste trabalho é realizar a síntese total da Licochalcona "A" a partir de um reagente comercial de baixo custo, empregando uma rota sintética de quatro etapas. A síntese inclui uma reação de rearranjo sigmatrópico e a clássica condensação de Claisen-Schmidt, etapas que foram estudadas para encontrar condições reacionais catalíticas apropriadas e de grande viabilidade de execução. Além da licochalcona A, diferentes análogos poderiam ser obtidos. Este trabalho está vinculado à empresa Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda e, portanto, se insere dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico com vínculos estreitos aos interesses da indústria farmacêutica, da medicina veterinária e do setor produtivo. Realizou-se um estudo detalhado das quatro etapas da rota, testando diferentes condições reacionais. A etapa de reação de prenilação foi realizada empregando diversos substratos para, em seguida, desenvolver um estudo sobre condições reacionais em rearranjos sigmatrópicos-[3,3]. Os produtos das reações de prenilação foram obtidos com sucesso e rendimentos moderados (47- 68%). Na etapa de condensação de Claisen-Schmidt, uma chalcona prenilada desejada foi obtida com sucesso, para a síntese de um análogo da Licochalcona A, mas a etapa final de rearranjo não foi conclusiva. / Licochalcones are naturally present in the root of Glycyrrhiza inflata (licorice) and have many biological activities, such as antitumor, antiparasitic, anti-oxidative and bactericidal. Licochalcone "A" showed anti-leishmania activity, which aroused interest in investigating and testing it for the treatment of canine visceral leishmaniasis (LVC), a serious zoonosis that affects domestic dogs, which are sacrificed due to the lack of an effective therapy. This work aimed to perform the total synthesis of Licochalcone "A" from a low cost commercial reagent using a four step synthetic route. The synthesis includes a sigmatropic rearrangement reaction and the classical Claisen-Schmidt condensation, steps that were studied to find suitable catalytic reaction conditions and viable execution. Besides licochalcone A, different analogues could be obtained. This work is linked to the Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda company and, therefore, falls within a perspective of promoting scientific and technological development with close links to the interests of the pharmaceutical industry, veterinary medicine and the productive sector. A detailed study of the four stages of the route was carried out, testing different reaction conditions. The prenylation reaction step was performed employing several substrates to then develop a study on reaction conditions in sigmatropic rearrangements-[3,3]. The products of the prenylation reactions were obtained with success and moderate yields (47-68%). In the condensation step of Claisen-Schmidt, a desired prenylated chalcone was obtained for the synthesis of an analogue of Licochalcone A, but the final step of rearrangement was not conclusive.

Orientador: Hyun Mo Yang / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica / Made available in DSpace on 2018-08-05T18:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosales_JuanCarlos_M.pdf: 1360240 bytes, checksum: 84fee5e0958180b35a0f098cc5b87f4d (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Neste trabalho fizemos a modelagem da leishmaniose começando com o ciclo doméstico ou urbano com 2-hospedeiros para estender os resultados ao ciclo peridoméstico com n-hospedeiros. No caso urbano, consideramos a população do vetor constante e, após, com capacidade de suporte. Simplificamos o modelo para analisar um dos fatores de risco da leishmaniose, o desmatamento. Derivamos as expressões correspondentes ao número de reprodutibilidade basal em todos os casos por meio de análise de estabilidade. Realizamos simulações com dados de zonas endêmicas. Ao final aplicamos a análise de sensitividade para o número de reprodutibilidade basal para o caso de 2-hospedeiros / Abstract: We are dealing with a modelling of leishmaniasis considering initially the urban cycle with 2-hosts aiming to extend the results to a peridomestic cycle for n-hosts. In the urban case we consider the vector population constant, also, variable. We simplify the model the assess the factor regarded to risk of leishmaniasis analysis, which is the deforestation. We derive the expression for the basic reproduction number from the stability analysis. The model was simulated whit respect to endemics zone. Finally we performed the sensibility analysis of the basic reproduction number to the case of 2-hosts / Mestrado / Epidemiologia Matematica. Biomatematica / Mestre em Matemática Aplicada

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In the present study, the sera levels of soluble CD40 ligand (sCD40L) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) were quantified by Luminex assay in Visceral leishmaniasis patients before and during treatment follow-up and after regular antimony treatment and also in individuals exposed to infection, living in endemic areas. Different from the other molecules present in sera from classic VL patients, sCD40L and MMP-9 are fairly increased, and increase over time during the follow-up of VL patients undergoing antimony treatment. sCD40L and MMP-9 sera levels were also high in individuals living in endemic settings at high risk of infection (endemic controls). On the other hand, sCD40L and MMP-9 were not observed in sera from non-endemic controls, which are not exposed of infection. Additionally, negative correlations were found between spleen sizes and MMP-9 before treatment and sCD40L at day 15 of treatment. Negative correlations were also found between parasite load with both sCD40L and MMP-9. These findings indicate that both molecules can be used in monitoring therapeutic efficacy in VL. Furthermore, these data suggest a protective effect of these molecules, since the individuals exposed to infection without the symptoms of disease have high sera levels of sCD40L and MMP-9. These data were published in BMC Infectious diseases journal [1]. To confirm the protective effect of sCD40L present in sera of VL patients and determine if this molecule had biological activity, the ability of sera from patients containing high levels of this molecule sCD40L to control infection in vitro in Leishmania infantum infected macrophages, and the ability to induce cytokines production. Thereby, macrophages from of healthy donor were infected with Leishmnia infantum, and later incubated in presence of sera from individuals exposed to infection in presence of anti-CD40L. The infection was evaluated by counting of the number of infected macrophages/100 and the number of intracellular amastigotes/100 macrophages. The data showed that serum sCD40L decrease the number of infected macrophages and the number of intracellular amastigotes. The blockage of sCD40L activity with specific antibody, increase the infection. Moreover, the analysis of cytokines in supernatant of these macrophage cultures by Luminex assay demonstrated that sCD40L induces the IL-12, IL-23, IL-27, IL-15 e IL-1 production. The levels of these cytokines is inversely correlated with infection rate and the number of intracellular parasites from infected macrophages. A second manuscript with these data were published in PLOS One [2] . These results demonstrated that serum sCD40L from individuals exposed to VL improve the microbicide effect and the inflammatory cytokine production, suggesting its potential use in VL immunotherapy. Nevertheless, there is still a long way to be approached in future experimental and clinical studies. / No presente estudo, os níveis séricos dos marcadores inflamatórios CD40 ligante solúvel (sCD40L) e da metaloproteinase de matrix-9 (MMP-9) foram quantificados por Luminex nos pacientes com leishmaniose visceral antes, durante e após o tratamento com antimonial, e em indivíduos controles expostos à infecção, residindo em áreas endêmicas. Ao contrário das outras moléculas inflamatórias presentes nos soros de pacientes com LV, as moléculas sCD40L e MMP-9 apresentaram elevação moderada, havendo um aumento significativo de ambas no decorrer do tratamento com antimonial. Níveis séricos elevados de sCD40L e MMP-9 também foram encontrados nos indivíduos controles sem doença, provenientes de áreas endêmicas e expostos a infecção. Entretanto, o sCD40L e a MMP-9 não foram detectados nos soros de indivíduos de áreas não endêmicas, os quais não estão expostos a infecção. Adicionalmente, correlações negativas entre o tamanho do baço com a MMP-9 antes do tratamento e com o sCD40L 15 dias após o início do tratamento foram observadas, bem como correlações negativas entre ambas as moléculas com a carga parasitaria dos pacientes. Estes resultados indicam que estas moléculas podem ser utilizadas no monitoramento da eficácia terapêutica na leishmaniose visceral. Além disso, estes dados nos sugerem um efeito protetor dessas moléculas contra a doença, desde que os indivíduos expostos e sem a doença apresentaram concentrações elevadas dessas moléculas. Estes dados foram publicados no BMC Infectious diseases [1]. Para confirmar o efeito protetor do sCD40L e investigar se a molécula presente nos soros dos pacientes com LV tinha atividade biológica, foi avaliado se o sCD40L presente no soro dos indivíduos infectados teria ação na resposta leishmanicida e na produção de citocinas por macrófagos infectados por Leishmania infantum. Dessa forma, macrófagos de doadores normais foram infectados com L. infantum e posteriormente incubados com soro de indivíduos expostos a infecção na presença de anti-CD40L. A avaliação da infecção através da contagem de células infectadas e do número de parasitas intracelulares demonstrou que a presença do sCD40L sérico diminui o número de macrófagos infectados e o número de amastigotas intracelulares. O bloqueio da atividade do sCD40L com anticorpo específico reverteu este efeito, aumentando a infecção. Além disso, a análise de citocinas no sobrenadante das culturas de macrófagos por Luminex mostrou que a adição de sCD40L induziu a produção de IL-12, IL- 23, IL-27, IL-15 e IL-1. As concentrações destas citocinas correlacionaram-se inversamente com as taxas de infecção e com o número de parasitas intracelulares nos macrófagos infectados. Um segundo artigo com estes resultados foi publicado na PLOS One [2]. Estes resultados demonstram que o sCD40L sérico dos indivíduos expostos à LV melhora a capacidade microbicida e a produção de citocinas inflamatórias, sugerindo seu potencial uso na imunoterapia na LV humana, embora este seja um longo caminho a ser abordado em estudos futuros experimentais e clínicos.

Visceral leishmaniasis constitutes a serious public health problem in the world, demanding effective measures for its control and treatment. The current treatments are far from ideal for the need for prolonged treatment, development of drug resistance and significant side effects. Thus the search for new therapeutic options in addition to evaluating the effectiveness of adjuvant therapy is very important. The aim of this study was to evaluate biomarkers sCD40L and clinical outcome in the adjuvant treatment of human visceral leishmaniasis with N-acetylcysteine. From an intervention study, kind clinical trial, blinded, randomized, were investigated 60 patients from the University Hospital with a positive diagnosis for acute visceral leishmaniasis. These patients were divided into two groups of 30: Study Group - which made use of antimony penta valent standard dose supplemented with N-acetyl-L-cysteine and the control group - which only used the standard dose antimony. The serum levels of soluble ligand sCD40L were significantly higher elevation and steeper over time in SbV + NAC group compared to the Sb group. Furthermore, the distribution of values sCD40L significantly increased in both groups after 15 days of treatment, thereafter no significant change over time. Likewise the size of the spleen, and serum cytokine levels (TNF-α, IL-10, IL-12p40) decreased during treatment in both groups while the number of neutrophils, eosinophils and platelets increased. Several published studies indicate the importance of CD40 / sCD40L interaction for an effective immune response and that this interaction occurs via reciprocal signaling through protein kinase-induced phosphorylation of MAPK p38 and ERK1 / 2 mitogen. Other studies show as a strategy of evading the immune response and the establishment of infection, Leishmania inhibits p38 MAPK signaling triggered by CD40. And the glutathione redox system regulates the production of IL-12 induced by LPS through the activation of p38 MPAK, and furthermore, the effect initiation of IFN-γ and IL-12 is in part a consequence of the equilibrium glutathione redox. NAC was able to increase serum sCD40L concentrations throughout treatment. Treatment with NAC improved the patients´ clinical parameters associated with the prognosis of the patients: reduced spleen size increased number of neutrophils / lymphocytes and eosinophils faster. The results suggest that the addition of NAC to conventional therapy improves the immune response of patients, particularly in the reduction of serum IL-10, IL-12p40 and increase in sDC40L that this response occurs as early as two weeks. It is likely that increased levels of sCD40L the NAC occurs through the activation of p38 MAPK pathway glutathione redox system. / A leishmaniose visceral constitui-se um grave problema de saúde pública no mundo, demandando medidas eficazes no seu controle e tratamento. A terapêutica atual está longe de ser a ideal pela necessidade de tratamentos prolongados, desenvolvimento de resistência aos medicamentos e efeitos colaterais significativos. Desse modo a busca de novas opções terapêuticas além de avaliação da eficácia de terapêutica adjuvante é muito importante. O objetivo deste trabalho foi avaliar biomarcadores de evolução clínica e CD40 ligante solúvel (sCD40L) no tratamento adjuvante da leishmaniose visceral humana com N-acetilcisteína. A partir de um estudo de intervenção, tipo ensaio clínico, cego, aleatorizado, foram investigados 60 pacientes do Hospital Universitário com diagnóstico positivo para leishmaniose visceral aguda. Esses pacientes foram distribuídos em dois grupos de 30: Grupo Estudo que fez uso do antimônio penta valente dose padrão complementado com o N-acetil-L-cisteína e o Grupo Controle - que fez uso apenas do antimônio dose padrão. Os níveis séricos do sCD40L foram significativamente maiores e com elevação ao longo do tempo mais acentuada no grupo SbV + NAC em relação ao grupo SbV. Além disso, a distribuição dos valores de sCD40L aumentaram significativamente em ambos os grupos a partir de 15 dias de tratamento, a partir de então sem variação significativa ao longo do tempo. Do mesmo modo a dimensão de baço e níveis séricos de citocinas (TNF-α, IL-10, IL-12p40) diminuíram ao longo do tratamento nos dois grupos enquanto o número de neutrófilos, eosinófilos e plaquetas aumentaram.Vários estudos da literatura assinalam a importância da interação CD40/sCD40L para uma efetiva resposta imune e que essa interação ocorre por meio de sinalização recíproca através de fosforilação da proteína quinase mitógeno induzida de MAPK p38 e ERK1/2. Outros estudos mostram como uma estratégia de evasão da resposta imune e o estabelecimento de infecção, a Leishmania inibe a sinalização p38MAPK acionada pelo CD40. E que o sistema redox de glutationa regula produção de IL-12 induzida pela LPS através da ativação da p38 MPAK e, além disso, o efeito de iniciação de IFN-γ e a produção de IL-12 é em parte uma conseqüência do equilíbrio redox da glutationa. O NAC foi capaz de aumentar as concentrações séricas de sCD40L ao longo do tratamento. O tratamento com NAC melhorou os parâmetros clínicos dos pacientes associados com o prognóstico dos pacientes: reduziu tamanho do baço, aumento do número de neutrófilos/linfócitos e eosinófilos mais rapidamente. Os resultados sugerem que a adição do NAC ao tratamento convencional melhora a resposta imunológica dos pacientes, sobretudo na diminuição dos níveis séricos de IL-10, IL-12p40 e na elevação da sDC40L que essa resposta ocorre já a partir de duas semanas. É provável que o aumento dos níveis de sCD40L pelo NAC ocorra através da ativação do MAPK p38 via o sistema redox de glutationa.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious infectious disease and is increasing geographical expansion and urbanization. patterns of transmission of the disease are altered due to human actions. The dog is considered the main reservoir of the parasite. The development of the disease depends in part on the host immune system. Neutrophils are considered the first line of defense against pathogens and important agents in the control of LV. These cells have an additional mechanism to eliminate microorganisms that occur with the release of extracellular networks (Neutrophil Extracellular Traps -NETs). This work has two overall objectives, the first being an epidemiological study of LV in Sergipe and the second evaluation of NETs formation in human neutrophils and dogs with LV stimulated with L. infantum, so this thesis was divided into chapters, for better understanding. Epidemiological evaluation were used SINAN data and serosurveys canines Zoonosis Aracaju-SE. A descriptive analysis of the data and construction of distribution maps of disease was performed. Sergipe Aracaju and from 2008 to 2014 the incidence rate in humans with LV increased and the percentage of infected dogs has doubled in the capital. The percentage of cases positive for human VL by sex, according to the age of the patient group, showed that over 15 years the disease affects more males. The spatial distribution analysis allowed to view areas of the city with the highest concentration of human and canine VL. The neighborhoods located in poor areas or growing areas were those with the highest incidence of the disease in humans and dogs. The results show that presents endemicity for human and canine VL. In order to evaluate the formation of NETs were used human groups: Control; LV treated and positive DTH. The dogs were divided into control; Asymptomatic and symptomatic. Neutrophils were isolated from patients with LV University Hospital / UFS and dogs diagnosed with VT by Zoonoses were incubated with and without stimulation of parasite and NETs measures in the supernatant of the cultures after 90 minutes. The parasitic load determined after 24 and 48 hours of interaction with neutrophils treated by the limiting dilution technique. In the evaluation of NETs induction of human neutrophils and release dogs with LV greater amount of NETs when stimulated with L. infantum. When compared between the groups individuals positive DTH release fewer NETs stimulated or not with the parasite. At 24 and 48 hours LV treated subjects have a higher parasite load and showed positive DTH fewer parasite than the other groups tested. Dogs with LV release signals greater amount of NETs when stimulated with L. infantum and have higher parasitic load after 48 hours. It is observed that the release of NETs and control of parasitic load by neutrophils varies according to the clinical form of the LV, in humans and dogs. / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença infecciosa grave e está em crescente expansão geográfica e urbanização. Os padrões de transmissão da doença são alterados devido às ações antrópicas. O cão é considerado o principal reservatório do parasito. O desenvolvimento da doença depende em parte do sistema imune do hospedeiro. Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do organismo contra agentes patogênicos e importantes no controle da LV. Estas células têm um mecanismo adicional para eliminar microorganismos que ocorre com a liberação de redes extracelulares (Neutrophil Extracelular Traps -NETs). Este trabalho teve dois objetivos gerais, sendo o primeiro um estudo epidemiológico da LV em Sergipe e o segundo a avaliação da formação de NETs em neutrófilos de humanos e cães com LV estimulados com L. infantum, assim essa tese foi dividida em capítulos, para melhor compreensão. Na avaliação epidemiológica foram utilizados dados do SINAN e inquéritos sorológicos caninos do Zoonoses de Aracaju-SE. Foi realizada uma análise descritiva dos dados e construção de mapas de distribuição da doença. Em Sergipe e Aracaju de 2008 a 2014 o coeficiente de incidência em humanos com LV aumentou e o percentual de cães infectados dobrou na capital. A porcentagem de casos positivos para LV humana por sexo, de acordo com a faixa etária do paciente, mostrou que acima de 15 anos a doença acomete mais o sexo masculino. A análise de distribuição espacial permitiu visualizar áreas da cidade com maior concentração de LV humana e canina. Os bairros situados em áreas com situação econômica desfavorável ou em zonas de expansão foram os que apresentaram maior incidência da doença em humanos e cães. Os resultados demonstram que apresenta caráter endêmico para a LV humana e canina. Com a finalidade de avaliar a formação de NETs foram utilizados grupos humanos: Controle; Tratados LV e DTH positivos. Os cães foram divididos em: Controle; Assintomáticos e sintomáticos. Foram isolados neutrófilos de pacientes com LV do Hospital Universitário/UFS e de cães diagnosticados com LV pelo Zoonoses foram incubadas, com e sem estímulo do parasito e NETs medidas no sobrenadante das culturas após 90 minutos. A Carga parasitária determinada após 24 e 48 horas de interação com neutrófilos tratados, através da técnica de diluição limitante. Na avaliação da indução de NETs, os neutrófilos de humanos e cães com LV liberam maior quantidade de NETs quando estimulados com L. infantum. Quando comparado entre os grupos indivíduos DTH positivos liberam menor quantidade de NETs estimulados ou não com o parasito. Em 24 e 48 horas indivíduos tratados com LV apresentam maior carga parasitária e os DTH positivos demonstraram menor quantidade do parasito do que os outros grupos testados. Os cães com sinais de LV liberam maior quantidade de NETs quando estimulados com L. infantum e apresentam maior carga parasitária após 48 horas. Observa-se que a liberação de NETs e o controle da carga parasitária através dos neutrófilos variam de acordo com a forma clínica da LV, em humanos e cães.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Search for new therapeutic alternatives for leishmaniasis is considered essential by the World Health Organization, due to the high toxicity of the drugs currently used, its high cost and the risk of resistance. In Brazil, it is used three drugs to treat leishmaniasis: meglumine antimoniate and two formulations of amphotericin B (deoxycholate and liposomal). This study is a piggy-back evaluation linked to a multicentric clinical trial with the objective to perform a decision analysis between the treatment regimens for visceral leishmaniasis, for both adults and children. For this end, it was performed analysis of the data obtained in the state of Sergipe from 62 patients randomized to treatment with meglumine antimoniate (group A), considered the first line treatment in Brazil, amphotericin B deoxycholate (group B), liposomal amphotericin B (group C) and the combined regimen of meglumine antimoniate with liposomal amphotericin B (group D), in order to conduct a decision analysis from among these therapeutic regimens for both adults and children. To this end, two scenarios were considered: scenario 1 is the currently prevailing in Brazil, where patients are always treated as possible on an outpatient basis with meglumine antimoniate, although with a smaller monitoring on its potentially lethal side effects and a possible lower adherence to treatment. In the scenario 2, patients are hospitalized during the treatment period, with a better monitoring of clinical and laboratory parameters of the patient, although with a higher risk of nosocomial infections and increasing treatment costs. In terms of security, there is an emphasis on amphotericin B deoxycholate as the one that presents a greater amount of serious and potentially lethal adverse reactions, with an average of 2 severe reactions per patient. From the viewpoint of cost-efficacy, for scenario 1 the meglumine antimoniate remains the treatment of choice for both adults and children. However, in scenario 2, the combination of drugs (group D) presented itself as the most costeffective for both adults and children. From this study it became clear, from a safety point of view for the patient, the need to evaluate both therapeutic regimens, particularly amphotericin B deoxycholate, such as the treatment scenarios for visceral leishmaniasis. / A busca por novas alternativas terapêuticas para as leishmanioses é considerada essencial pela Organização Mundial da Saúde, em virtude da elevada toxicidade dos medicamentos atualmente utilizados, seu alto custo e o risco de resistência. No Brasil, utilizam-se três drogas para o tratamento da leishmaniose: o antimoniato de meglumina e as formulações de anfotericina B (desoxicolato e lipossomal). Este estudo é uma análise econômica atrelada a um ensaio clínico multicêntrico, com o objetivo de se realizar uma análise de decisão entre os esquemas terapêuticos para a leishmaniose visceral, tanto para adultos como para crianças. Para tal, foram utilizados os dados obtidos do estado de Sergipe, onde foram acompanhados 62 pacientes, randomizados para tratamento com antimoniato de meglumina (grupo A), considerado o esquema de primeira escolha no Brasil, anfotericina B desoxicolato (grupo B), anfotericina B lipossomal (grupo C) e o esquema terapêutico combinado de antimoniato de meglumina com anfotericina B lipossomal (grupo D). Na análise de decisão, foram considerados dois cenários: o cenário 1, atualmente existente no Brasil, no qual os pacientes são tratados sempre que possível ambulatorialmente com o antimoniato de meglumina, porém com um menor acompanhamento de suas reações adversas potencialmente letais e uma possível menor adesão ao tratamento. Já no cenário 2, os pacientes são internados durante todo o período do tratamento, com um melhor monitoramento dos parâmetros clínicos e laboratoriais do paciente, porém com um risco maior de infecções hospitalares e aumento de custos do tratamento. No quesito segurança, há um destaque para a anfotericina B desoxicolato como sendo a que apresenta uma maior quantidade de reações adversas graves e potencialmente letais, com uma média de 2 reações graves/paciente. Já no ponto de vista de custo-eficácia, para o cenário 1 o antimoniato de meglumina continua sendo o tratamento de primeira escolha, tanto para adultos como para crianças. Porém, no cenário 2, a combinação de medicamentos (grupo D) se apresentou como o mais custo-eficaz tanto para adultos como para crianças. Deste estudo evidenciou-se, do ponto de vista de segurança ao paciente, a necessidade de reavaliação tanto dos esquemas terapêuticos, particularmente a anfotericina B desoxicolato, como dos cenários de tratamento para a leishmaniose visceral.

Pênfigo é uma dermatose bolhosa autoimune, endêmica em algumas áreas, como no nordeste do estado de São Paulo, Brasil, caracterizada pela produção de autoanticorpos contra desmogleínas (Dsg) - proteínas de adesão dos queratinócitos. O pênfigo vulgar (PV) acomete mucosas e pele, pela produção de anti-Dsg 3 e 1, respectivamente. O pênfigo foliáceo (PF) apresenta lesões exclusivamente na pele, pela produção de anti-Dgs1. Esta região também é endêmica para a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), cujo principal fator etiológico é Leishmania (Viannia) braziliensis. Objetivos: Relacionar fatores imunogenéticos dos pênfigos com aqueles da LTA, investigando, em pacientes com pênfigos, LTA e em controles: a resposta humoral às Dsg 1 e 3 e contra Chagas; a resposta humoral e celular aos antígenos de leishmania; e a associação dos alelos HLA de classe II -DR e -DQ no grupo LTA com aqueles de suscetibilidade e de resistência descritos nos pênfigos. Métodos: A resposta humoral foi investigada por: (i) ELISA para determinação dos anticorpos anti-Dsg 1 e 3, anti-L. V. braziliensis e contra T. cruzi; (ii) imunoblotting (IB) com extrato proteico de epiderme e com extrato proteico de L. (V.) braziliensis; (iii) imunofluorescência indireta (IFI) com substrato de pele humana e soro de pacientes com LTA. A resposta celular foi realizada por teste intradérmico de Montenegro (TIM). A tipificação dos alelos HLA -DR e -DQ foi realizada por PCR-SSOP. Resultados: A resposta humoral às Dsg confirmou o esperado - anti-Dsg1: 84,6% no grupo PF e 54,8% no grupo PV; e antiDsg3: 83,9% no PV; não havendo diferença significativa entre os grupos LTA e controles - anti-Dsg1: 16% nos familiares de PF (FPF); 5,2% no grupo LTA; 4,2% no grupo FPV; e 2,7% nos controles vizinhos; e anti-Dsg3: 12% no grupo FPF; 6,4% no grupo PF e 5,2% no grupo LTA. Houve reconhecimento dos peptídeos de 130kDa (corresponde ao PM da Dsg3), 145kDa, 150kDa (Dsg2), 160kDa (Dsg1), 230kDa (BP230), 250kDa, 290kDa, 350kDa, 410kDa, 425kDa e 460kDa da epiderme humana por soro de pacientes com LTA. A IFI resultou positiva para anti-IgG em 2/6 pacientes com LTA. Em um deles, houve reconhecimento de peptídeos intercelulares da epiderme, guardando semelhança aos pênfigos; e, no outro, de antígenos da zona da membrana basal, guardando semelhança ao penfigoide bolhoso. A resposta humoral a L. (V.) braziliensis resultou mais elevada no grupo LTA (73% para LTAc e 62% para LTAm) em relação aos demais grupos, sem diferença significativa entre os grupos pênfigos (1,3% no grupo PF e 1,6% no PV) e os controles (10,8% nos controles vizinhos e 4% no grupo FPF, FPV e controles Banco de Sangue). Pacientes com pênfigos apresentaram títulos sorológicos para T. cruzi semelhantes aos controles. Houve reconhecimento de peptídeos de L. (V.) braziliensis pelo soro dos pacientes com pênfigo (45kDa, 95kDa, 100kDa, 120kDa, 125kDa, 145kDa, 150kDa, 305kDa, 330kDa, 410kDa e >500kDa). O TIM foi negativo nos 6 pacientes com PF ou PV avaliados. Os alelos DRB1*01:02 e DQA1*01 mostraram associação de resistência para LTA e suscetibilidade para PF; o alelo DRB1*04:02 de resistência para LTA e suscetibilidade para PV; os alelos DRB1*07:01 e *11:01 de suscetibilidade para LTA e resistência para PF; e o DQA1*01:02 mostrou associação de suscetibilidade a ambos LTA e PF. Conclusões: os pacientes com LTA têm resposta humoral às Dsg 1 e 3, e os pacientes com pênfigo, aos antígenos de L. (V.) braziliensis e de T. cruzi semelhante aos controles. Os soros de pacientes com pênfigos reconhecem peptídeos da epiderme e da zona da membrana basal por IB e IFI. Os demais peptídeos reconhecidos pelos pacientes com LTA ao extrato epidérmico, assim como dos pacientes com pênfigos ao extrato de L. (V.) braziliensis necessitam sequenciamento. As associações de suscetibilidade ou resistência dos alelos HLA de classe II -DR e -DQ são opostas para LTA e pênfigo. Os resultados confirmam a não participação do parasito L. (V.) braziliensis na patogênese dos pênfigos, assim como corroboram a observação clínica da ausência da associação de ambas as doenças na região do estudo / Pemphigus is an autoimmune bullous dermatosis, endemic in some areas, such as in the northeastern of São Paulo state, characterized by the production of autoantibodies against desmoglein (Dsg) - keratinocytes adhesion proteins. Pemphigus vulgaris (PV) affects mucous membranes and skin, by the production of anti-Dsg 3 and 1, respectively. Pemphigus foliaceus (PF) affects only the skin, by the production of anti-Dsg 1. This region is also endemic for American Cutaneous Leishmaniasis (ACL), whose main etiological factor is Leishmania (V.) braziliensis. Objectives: To relate immunogenetic factors of pemphigus with those of ACL, investigating, in patients with pemphigus, ACL and controls: the humoral response to Dsg 1 and 3; the humoral and cellular responses to Leishmania antigens; and the association of class II -DR and -DQ HLA alleles in ACL group with those of susceptibility and resistance described in pemphigus. Methods: The humoral response was investigated by (i) ELISA for determination of anti-Dsg1 and anti-Dsg3 antibodies and anti-antibodies from T. cruzi and L. braziliensis; (ii) immunoblotting (IB) with protein extract of the epidermis and protein extract of L. braziliensis; (iii) indirect immunofluorescence (IIF) with human skin substrate and serum of ACL patients. The cellular response was carried out by intradermal test Montenegro (ITM). The typing of HLA-DQ and -DR alleles was performed by PCR-SSOP. Results: The humoral response to Dsg confirmed expected in groups of PV and PF (anti-Dsg1: 84.6% in the PF group and 54.8% in the PV group, and anti-Dsg3: 83.9% in PV), with no significant difference between the ACL and control groups [anti-Dsg1: 16% in relatives of PF (RPF), 5.2% in the ACL, 4.2% in relatives of PV (RPV) and 2.7% of controls neighbors; anti-Dsg3: 12% in RPF, 6.4% in the PF group and 5.2% in ACL)]. There has been recognition of peptides 130kDa, 145 kDa, 150kDa, 160kDa, 230 kDa, 250 kDa, 290 kDa, 350 kDa, 410 kDa, 425 kDa and 460 kDa of human epidermis by serum of ACL patients. The IFI was positive in 1/6 ACL patients evaluated. The humoral response to L. braziliensis resulted higher in ACL group (73% to ACLc and 62% to ACLm) compared to the other groups, with no significant difference between pemphigus groups (1.3% in the PF group and 1.6% the group PV) and controls (10.8% in neighboring controls and 4% in FPF, in FPV and BS controls). Patients with pemphigus have serological titers to T. cruzi similar to controls. There was L. braziliensis recognition of peptides by the patients with pemphigus (45 kDa, 95 kDa, 100 kDa, 120 kDa, 125 kDa, 145 kDa, 150 kDa, 305 kDa, 330 kDa, 410 kDa and> 500 kDa). The ITM was negative in 06 patients with PF or PV evaluated. The DRB1*01:02 and DQA1*01 showed resistance association for LTA and susceptibility to PF; allele DRB1*04:02 resistance to ACL and susceptibility to PV; the DRB1*07: 01 and *11:01 susceptibility to ACL and resistance to PF; and DQA1*01:02 showed susceptibility association with both ACL and PF. Conclusions: Patients with ACL have humoral response to Dsg 1 and 3, and pemphigus patients to L. braziliensis and T. cruzi antigens similar to controls. The peptides recognized by patients with pemphigus to L. braziliensis extract require sequencing. The susceptibility or resistance associations of class II -DR and -DQ HLA alleles are opposed to ACL and pemphigus. The results confirm the non-participation of the parasite L. (V.) braziliensis in the pathogenesis of pemphigus, as well as support the clinical observation of the absence of both diseases association

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO OSVALDO 2010.pdf: 388813 bytes, checksum: 7524bca9b65d53027197a0e944792085 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / The visceral leishmaniasis (LV) is a very important disease in public health, including zoonosis caused by members of Leishmania gender, occurring in many regions of the world. Several methods are being used to diagnose these diseases; among these methods are the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), indirect immunofluorescence reaction (RIFI) and direct examination by microscope. As none of these techniques allows a fast and sensitive diagnostic, methods of molecular diagnosis based on polymerase chain reaction (PCR) were developed. Recently, many groups have shown that PCR is a sensitive and specific method to Leshmania DNA detection in a variety of samples of humans, dogs and other animals. The protocols developed until these days to the parasite diagnose by PCR, although they be effective in the identification of the genomic DNA target, promote some inespecific amplifications or are inconclusive in the distinction of L.chagasi from other species of the gender. This work`s objective was the construction of speciesspecific iniciadores to detection of L.chagasi, and evaluation of protocols described by other authors, aiming LV diagnosis. The primers were selected from the alignment of 18S rRNA gene sequences and also of the LSU rRNA. Were selected six new pairs of species-specific primers for L. chagasi. Besides these new pairs were assessed seven other pairs of primers described in the literature. The results showed that the new primer pairs LCS2/LCS3 LCS1/LCS3 were efficient for the species-specific amplification of DNA fragments of L. chagasi of 259 bp and 820 bp, respectively. In the other hand the two new PCR assays optimized in this study using the primer pairs and LCS1/LCS3 LCS2/LCS3 were effective for species-specific detection of up to 1 pg / mL of DNA from L. chagasi. The pairs of primers MC1/MC2 as well as the pair of primers PIA-94 were effective for the discrimination of species-specific L. chagasi.Other pairs of primers evaluated didn´t showed a satisfactory results regarding the specificity for L. chagasi. / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença de grande importância em saúde pública, compreendendo zoonoses causadas por membros do gênero Leishmania, sendo de ocorrência em diversas regiões do mundo. Vários métodos já são utilizados para o diagnóstico dessas enfermidades, entre eles o ensaio imunoenzimático (ELISA), a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o exame direto ao microscópio. Como nenhuma destas técnicas permite um diagnóstico sensível e rápido, métodos de diagnóstico molecular baseados na reação em cadeia pela polimerase (PCR) foram desenvolvidos. Recentemente, vários grupos têm mostrado que a PCR é um método sensível e específico para a detecção do DNA da Leishmania em uma variedade de amostras de humanos, cães e outros animais. Os protocolos desenvolvidos até o presente para o diagnóstico deste parasito por PCR, apesar de serem eficazes na identificação do DNA genômico alvo, promovem algumas amplificações inespecíficas ou não são conclusivos na distinção de L. chagasi de outras espécies do gênero. O objetivo deste trabalho foi a construção de iniciadores espécie-específicos para a detecção de L. chagasi, assim como a avaliação de protocolos descritos por outros autores, visando o diagnóstico da LV. Os iniciadores foram selecionados a partir do alinhamento das seqüências do gene 18S rRNA e também do LSU rRNA. Foram selecionados seis novos pares de iniciadores espécie-específicos para L. chagasi. Além desses novos pares, foram avaliados outros sete pares de iniciadores descritos na literatura. Os resultados permitiram concluir que os novos pares de iniciadores LCS1/LCS3 e LCS2/LCS3 foram eficientes para a amplificação espécie específica de fragmentos de DNA de L. chagasi de 259 pb e 820 pb, respectivamente. Já os os dois novos ensaios de PCR otimizados neste estudo, empregando os pares de iniciadores LCS1/LCS3 e LCS2/LCS3, foram efetivos para a detecção espécie-específica de até 1 pg/`L de DNA de L. chagasi. Os pares de iniciadores MC1/MC2 descritos por CORTES et al. (2004) assim como o par de iniciadores publicado por PIARROUX et al., (1994) foram efetivos para a discriminação espécie-específica de L. chagasi. Os outros pares de iniciadores avaliados não apresentaram resultados satisfatórios quanto a especificidade para L. chagasi.