Gama-decanolactona (GD) é um composto monoterpeno com estrutura semelhante às lactonas naturais, que estão presentes em diferentes espécies e são usadas como terapia farmacológica na região amazônica. GD mostrou um efeito anticonvulsivo em ambos os modelos de pentilenotetrazol (PTZ) agudo e crônico e atua como um antagonista de glutamato não-competitivo. Considerando estudos anteriores sobre atividades biológicas de GD, o presente estudo teve como objetivo explorar o seu perfil anticonvulsivante em diferentes modelos de epilepsia em camundongos e sobre parâmetros de estresse oxidativo, neuroinflamação e genotoxicidade em células microgliais N9. A atividade anticonvulsiva de GD (100 e 300 mg/kg) foi investigada em convulsões induzidas por aminofilina, isoniazida, picrotoxina, 4-aminopiridina (4-AP) e pilocarpina em camundongos machos. Os animais receberam uma administração de solução salina (SAL), GD ou diazepam (DZP 2 mg/kg), de controle positivo e após 30 min receberam os seguintes agentes convulsivos: aminofilina, isoniazida, picrotoxina, 4-AP ou pilocarpina. Os parâmetros avaliados durante 1h foram a latência para a primeira convulsão, a porcentagem de convulsões e a taxa de mortalidade. A fim de avaliar a neurotoxicidade de GD 100 e 300 mg/kg, foi realizado o teste de desempenho de rotarod. O tempo para cair do rotarod foi gravado em diferentes momentos após a administração GD. E por último foi avaliado o desempenho de GD 100 e 300 mg/kg no teste de sono induzido por DZP (17 mg/kg). Os resultados demonstraram que GD foi capaz de aumentar a latência para a primeira convulsão induzida pela aminofilina, isoniazida, 4-AP e pilocarpina, mas não para picrotoxina. No teste de rotarod, GD 300 mg/kg reduziu o tempo de latência para cair da barra após 30 min de administração, mas não após 60, 90 ou 120 min. GD 300 mg/kg aumentou a latência do sono induzido pro DZP. Os resultados acima revelaram que GD apresentou um efeito anticonvulsivo nos modelos de epilepsia utilizados neste estudo, principalmente na dose de 300 mg/kg, bem como o tempo de latência para a primeira convulsão, sugerindo que GD pode modular as vias da adenosina e afetar os canais de potássio, direta ou indiretamente. O papel de GD sobre o estresse oxidativo em status epilepticus (SE) foi investigado medindo a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), teor de nitrito, e os danos do DNA induzidos por pilocarpina no córtex cerebral de camundongos. GD foi capaz de aumentar as atividades de SOD e CAT, diminuir a produção de EROS, NO e danos no DNA durante o estabelecimento de SE no córtex cerebral. Estes dados sugerem que as enzimas SOD e CAT são o principal sistema de eliminação de radicais livres, e GD fornece neuroproteção contra o aumento do estresse oxidativo no cérebro. Um modelo clássico para investigar se uma droga atua modulando a neuroinflamação é utilizar a linhagem celular N9 (célula neuronal da microglia murina) ativada com o químico lipopolissacárideo (LPS), que sabidamente, provoca inflamação. Assim, investigou-se o efeito da GD sobre parâmetros inflamatórios e apoptóticos nesse sistema. Avaliou-se a expressão protéica por western blotting das seguintes proteínas: óxido nítrico sintetase induzível (iNOS) e fator de necrose tumoral-alpha (TNF-α), p-38 fosforilada e não fosforilada. Avaliou-se também a atividade da caspase 9-clivada e a formação de EROS por citometria de fluxo bem como o dano ao DNA pelo ensaio cometa alcalino. Nos resultados in vitro, GD atenuou a ativação de células N9 microglias, inibiu a formação de EROS intracelular e a expressão de iNOS e TNF-α induzidas por LPS nas células. Além disso, GD bloqueou a fosforilação da p38, inibiu a caspase-9 clivada e o dano ao DNA. Estes dados indicam que GD tem um potencial terapêutico neuroprotetor e que exerce os seus efeitos através da inibição da inflamação. / Gamma-decanolactone (GD) is a monoterpene compound similar to natural lactones in structure, which are present in different species and are used as remedy in the Amazonian region. GD shows an anticonvulsant effect in both the acute and chronic pentileneterazole (PTZ) models and acts as a non-competitive glutamate antagonist. Considering previous studies on biological activities of GD, the present study aimed to explore its anticonvulsant profile in different epilepsy models in mice and on oxidative stress parameters in N9 cell. The anticonvulsant activity of GD (100 and 300 mg/kg) was investigated on seizures induced by aminophylline (AMPH), isoniazid (INH), picrotoxin (PCT), 4-aminopyridine (4-AP) an pilocarpine (PIL) in male mice. The animals received one administration of saline (SAL), GD or the positive control diazepam (DZP 2 mg/kg), and after 30 min they received the following convulsant agents: AMPH, INH, PCT, 4-AP or PIL The parameters evaluated during 1h were the latency to first seizure, the occurrence of seizure and the mortality rate. In order to evaluate the neurotoxicity of GD 100 and 300 mg/kg, the rotarod performance test was performed. The time to fall of the rotarod was recorded at different times after the GD administration. The results demonstrated that GD was able to extend the latency to first seizure induced by AMPH, INH, 4-AP and PIL, but not PCT. In the rotarod test GD 300mg/kg reduced the latency to fall of the bar just at 30 min after the administration, but not at 60, 90 or 120 min. The above results revealed that GD presented an anticonvulsant effect in the epilepsy models used in this study, especially at the dosage of 300mg/kg, as well as the latency to the first seizure, suggesting that the GD could modulate the adenosine and GABA pathways and affect potassium channels directly or indirectly. The role of gamma-decanolactone (GD) on oxidative stress in pilocarpine-induced SE was investigated by measuring ROS production, superoxide dismutase and catalase activities, nitrite content, and DNA damage in the mice cerebral cortex. GD was able to increase the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities, decreased the ROS, NO production, and DNA damage during the SE establishment in the cerebral cortex. These data suggest that the cortex use SOD and CAT enzymes as the major free-radicals scavenging system, and GD provides neuroprotection against the increase of oxidative stress in the brain. Because previous works have consistently demonstrated the N9 microglial-neuronal system for neuroinflammation investigations, these cells are considered appropriate for this kind of research. To investigate the inhibitory effect of GD on the production of ROS and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS) - stimulated N9 murine microglial cells through the p38 MAPK signaling pathway. The results in vitro the GD attenuated the activation of N9 cells and inhibited intracellular ROS and the expression of iNOS and TNF-α induced by LPS in the cells. In addition, GD blocked the phosphorylation of p38 and inhibited cleaved caspase-9 and DNA damage. These data indicate that GD has therapeutic potential for the treatment of neurodegenerative diseases, and that it exerts its effects by inhibiting inflammation.

Orientador: Ronaldo Aloise Pilli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-21T18:25:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CarlosKleberZago_D.pdf: 16814926 bytes, checksum: 7ec846f38be437dc64f0c4d206c56860 (MD5) Previous issue date: 1996 / Doutorado

Esta tese de doutorado aborda alguns aspectos do estudo de plantas medicinais e de princípios ativos naturais. Os procedimentos experimentais incluíram o estudo fitoquímico de uma planta medicinal da família Asteraceae, o desenvolvimento de um método analítico com validação das análises empregadas e o estudo de atividades biológicas relativas ao processo inflamatório. A primeira etapa compreendeu o estudo fitoquímico da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (Asteraceae), envolvendo o isolamento de metabólitos secundários da classe dos terpenóides. Do extrato de lavagem foliar foram isoladas as seguintes lactonas sesquiterpênicas (LSTs): enidrina, uvedalina, sonchifolina, fluctuanina, polimatina B, (1Z,4E)-8β-metacriloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila, (1Z,4E)-8β-angeloilóxi-14-oxo-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido, (1Z,4E)-8β-metacriloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila, ácido (1Z,4E)-8β-angeloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-óico e (1Z)-3α,4β-epóxi-8β-[(1Z,4E)-(2S,3R)-2-hidróxi-3-óxi-(8β-angeloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido)]-9α-acetoilóxi-germacra-1(10),11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato de metila. A segunda etapa tratou do desenvolvimento de método e validação das análises para controle de qualidade químico de S. sonchifolius em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Além disso, foi realizada a quantificação do principal metabólito secundário isolado nos extratos glandulares e de lavagem foliar, a LST enidrina. Esta substância compõe 0,97 % do peso seco das folhas de S. sonchifolius. A terceira etapa refere-se às atividades biológicas, as quais foram avaliadas empregando-se diversos ensaios. Também foi realizada a otimização de método para avaliação da secreção de elastase por neutrófilos humanos e o estudo da estimulação basal de neutrófilos. Ainda foram investigados os efeitos de produtos fitoterápicos, como gel de Arnica montana e extrato de Harpagophytum procumbens, e de metabólitos secundários, como LSTs e alcalóides, na atividade enzimática de elastase, na secreção de elastase por neutrófilos, na ativação do fator de transcrição NF-κB via EMSA, na produção de luciferase por meio de reporter gen assay e de interleucina-8 via ELISA. Com exceção de dois alcalóides, todas as substâncias e produtos testados apresentaram atividades de inibição dos processos inflamatórios investigados. / This Ph.D. thesis deals with some aspects of the study of medicinal plants and their biologically active natural compounds. The experimental procedures comprised the phytochemical study of a plant from the family Asteraceae, the development of an analytical method with validation of the employed analysis and the study of the biological activities related to the inflammatory process. The first step comprised the phytochemical study of the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (Asteraceae) and the isolation of secondary metabolites. From the leaf rinse extract were isolated the sesquiterpene lactones (STLs) enhydrin, uvedalin, sonchifolin, fluctuanin, polymatin B, methyl (1Z,4E)-8β-metacryloyloxy-9α-acetoyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-ate, (1Z,4E)-8β-angeloyloxy-14-oxo-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide, methyl (1Z,4E)-8β-metacryloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-ate, (1Z,4E)-8β-angeloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-oic acid, methyl (1Z)-3α,4β-epoxy-8β-[(1Z,4E)-(2S,3R)-2-hydroxy-3-oxy-(8β-angeloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide)]-9α-acetoyloxy-germacra-1(10),11(13)-dien-6α,12-olide-14-ate. The second part was related to the development and validation of a chromatographic method for the chemical quality control of S. sonchifolius using high performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore, the quantification of the main secondary metabolite, the STL enhydrin on glandular and leaf rinse extracts was also performed. This compound comprises 0,97 % of dried leaves weight of the plant. The third part deals with biological activities, which were investigated through different assays. One method for the study of the elastase release from human neutrophils was evaluated and the basal stimulation of neutrophils was studied. The effects of phytoterapeutic agents, like Arnica montana gel and Harpagophytum procumbens extract, and of the secondary metabolites, like LSTs and alkaloids, on the enzymatic activity of elastase, on elastase release from neutrophils, on the activation of the transcription factor NF-κB through EMSA, on luciferase production through reporter gene assay and on interleucina-8 production through ELISA were also carried out. Both phytoterapeutic agents as well as the great majority of the tested compounds showed some inhibitory activity over the investigated inflammatory processes.

As lignanas naturais possuem vários tipos de estruturas que exibem uma vasta gama de atividades biológicas. As lignano-lactonas naturais, tais como a arctigenina (1) e os derivados da podofilotoxina (2), representadas nas estruturas abaixo, são conhecidas por apresentarem atividades citotóxicas e, há várias décadas, vêm despertando enorme interesse em virtude de suas propriedades anti-cancerígenas e anti-HIV. Apesar de haver numerosos tipos de síntese racêmica e vários exemplos de síntese assimétrica desses compostos, os métodos sintéticos tradicionais geralmente empregados não são convenientes para a preparação em larga escala desses compostos opticamente puros, em virtude da necessidade de utilizar quantidades estequiométricas de fontes quirais e/ou grande seqüência de etapas sintéticas. Em vista disso, um método mais eficiente para realizar a síntese enantiosseletiva desses produtos naturais é através da catálise assimétrica utilizando materiais de partida proquirais. Trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório serviram para testar alguns métodos sintéticos descritos na literatura. Entretanto, como esses métodos são relativamente longos e produzem baixos rendimentos, optamos por testar um método alternativo para a obtenção de lignano-lactonas naturais biologicamente ativas, tais como a parabenzlactona (51) e a oxoparabenzlactona (52), cujas estruturas são mostradas a seguir. Esses dois compostos, além de apresentarem propriedades biológicas úteis, podem ser transformados em outros produtos naturais de interesse, tais como as lignanas do tipo dibenzilbutirolactonas, ariltetralinas e furofurânicas. Os materiais de partida utilizados nessa nova metodologia sintética foram os derivados protegidos de 3-hidroximetil--butirolactona (50), os quais, neste trabalho, foram sintetizados através da hidrogenação enantiosseletiva de derivados insaturados produzidos a partir do ácido 3,3-dimetilacrílico (81). Os estudos de hidrogenação enantiosseletiva foram realizados utilizando catalisadores quirais de ródio e rutênio. Diversos derivados de butenolidas foram estudados com intuito de se obter o intermediário 50 de maneira enantiosseletiva e com rendimentos satisfatórios. Os resultados obtidos nas reações de hidrogenação catalítica dessas butenolidas com complexos quirais de ródio e rutênio mostraram que a quelação do substrato com o centro metálico do catalisador assimétrico é fortemente afetada pelo tipo de substituinte ligado no esqueleto da butenolida. De maneira geral, os produtos de hidrogenação foram obtidos com larga faixa de pureza óptica (2-100% ee) dependendo do tipo de substituinte. Esses resultados indicam uma importante influência dos grupos protetores da função hidroxila alilíca nas reações de hidrogenação assimétrica dos derivados das butenolidas estudados. A fim de se investigar o mecanismo de complexação dos substratos com os catalisadores quirais, simulações computacionais foram realizadas com o catalisador quiral cloreto de [(S)-(?)-2,2?-bis-(difenilfosfino)-1,1-binaftil]cloro(p-cimeno) rutênio e os substratos derivados da 3-hidroximetilbutenolida. Os resultados dos estudos computacionais realizados até o momento mostraram que a ocorrência de mais de um ponto de complexação entre o substrato e o centro metálico do catalisador quiral diminui a energia de ativação do intermediário-chave, aumentando a atividade catalítica e resultando em alta estereosseletividade. Uma vez concluídos os estudos de hidrogenação enantiosseletiva, prosseguiu-se os estudos para a obtenção dos produtos naturais de interesse, a partir de um dos intermediários racêmicos derivados da 3-hidroximetilbutenolida, contendo o metoximetil-éter como grupo protetor. O aldeído intermediário 87, obtido em baixo rendimento, deverá ser transformado nos diversos produtos naturais de interesse. Por causa de sua grande instabilidade, já descrita na literatura, novas metodologias estão sendo testadas para a obtenção do aldeído 87 com melhor rendimento. As lignanas naturais possuem vários tipos de estruturas que exibem uma vasta gama de atividades biológicas. As lignano-lactonas naturais, tais como a arctigenina (1) e os derivados da podofilotoxina (2), representadas nas estruturas abaixo, são conhecidas por apresentarem atividades citotóxicas e, há várias décadas, vêm despertando enorme interesse em virtude de suas propriedades anti-cancerígenas e anti-HIV. Apesar de haver numerosos tipos de síntese racêmica e vários exemplos de síntese assimétrica desses compostos, os métodos sintéticos tradicionais geralmente empregados não são convenientes para a preparação em larga escala desses compostos opticamente puros, em virtude da necessidade de utilizar quantidades estequiométricas de fontes quirais e/ou grande seqüência de etapas sintéticas. Em vista disso, um método mais eficiente para realizar a síntese enantiosseletiva desses produtos naturais é através da catálise assimétrica utilizando materiais de partida proquirais. Trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório serviram para testar alguns métodos sintéticos descritos na literatura. Entretanto, como esses métodos são relativamente longos e produzem baixos rendimentos, optamos por testar um método alternativo para a obtenção de lignano-lactonas naturais biologicamente ativas, tais como a parabenzlactona (51) e a oxoparabenzlactona (52), cujas estruturas são mostradas a seguir. Esses dois compostos, além de apresentarem propriedades biológicas úteis, podem ser transformados em outros produtos naturais de interesse, tais como as lignanas do tipo dibenzilbutirolactonas, ariltetralinas e furofurânicas. Os materiais de partida utilizados nessa nova metodologia sintética foram os derivados protegidos de 3-hidroximetil-?-butirolactona (50), os quais, neste trabalho, foram sintetizados através da hidrogenação enantiosseletiva de derivados insaturados produzidos a partir do ácido 3,3-dimetilacrílico (81). Os estudos de hidrogenação enantiosseletiva foram realizados utilizando catalisadores quirais de ródio e rutênio. Diversos derivados de butenolidas foram estudados com intuito de se obter o intermediário 50 de maneira enantiosseletiva e com rendimentos satisfatórios. Os resultados obtidos nas reações de hidrogenação catalítica dessas butenolidas com complexos quirais de ródio e rutênio mostraram que a quelação do substrato com o centro metálico do catalisador assimétrico é fortemente afetada pelo tipo de substituinte ligado no esqueleto da butenolida. De maneira geral, os produtos de hidrogenação foram obtidos com larga faixa de pureza óptica (2-100% ee) dependendo do tipo de substituinte. Esses resultados indicam uma importante influência dos grupos protetores da função hidroxila alilíca nas reações de hidrogenação assimétrica dos derivados das butenolidas estudados. A fim de se investigar o mecanismo de complexação dos substratos com os catalisadores quirais, simulações computacionais foram realizadas com o catalisador quiral cloreto de [(S)-(?)-2,2?-bis-(difenilfosfino)-1,1?-binaftil]cloro(p-cimeno) rutênio e os substratos derivados da 3-hidroximetilbutenolida. Os resultados dos estudos computacionais realizados até o momento mostraram que a ocorrência de mais de um ponto de complexação entre o substrato e o centro metálico do catalisador quiral diminui a energia de ativação do intermediário-chave, aumentando a atividade catalítica e resultando em alta estereosseletividade. Uma vez concluídos os estudos de hidrogenação enantiosseletiva, prosseguiu-se os estudos para a obtenção dos produtos naturais de interesse, a partir de um dos intermediários racêmicos derivados da 3-hidroximetilbutenolida, contendo o metoximetil-éter como grupo protetor. O aldeído intermediário 87, obtido em baixo rendimento, deverá ser transformado nos diversos produtos naturais de interesse. Por causa de sua grande instabilidade, já descrita na literatura, novas metodologias estão sendo testadas para a obtenção do aldeído 87 com melhor rendimento. Estudos sobre a síntese enantiosseletiva de lignano-lactonas naturais contendo importantes atividades biológicas. Os estudos foram realizados utilizando catalisadores quirais de ródio e rutênio e foram avaliados a influência de grupos protetores da função hidroxila da butenolida estudada, frente ao catalisador analisado. / Natural lignans have several types of structures exhibiting a wide variety of biological activities. Natural lignan-lactones, such as arctigenin (1) and the podofilotoxin derivatives (2), are well known for their cytotoxic activities, and both their anti-cancer and anti-HIV properties have attracted much research interest in the last decades. Although numerous racemic syntheses and several examples of the asymmetric synthesis of these compounds have been largely employed, they are not useful for the large-scale preparation of optically pure compounds because stoichiometric amounts of chiral sources and/or la long sequence of synthetic reaction steps are necessary for their accomplishment. A more efficient method for the enantioselective synthesis of these natural products uses asymmetric catalysis with prochiral substances as starting materials. Previous works developed at our laboratory have employed some synthetic methods described in the literature to investigate the synthesis of some natural products. However, these methods involve several synthetic steps and lead to low yields. These facts have thus stimulated us to develop an alternative method for the obtention of biologically active natural lignan-lactones such as parabenzlactone (51) and oxo-parabenzlactone (52). Besides their useful biological properties, these compounds can also be transformed into other interesting natural products, such as aryltetralin, dibenzylbutyrolactone, and furofuran lignans. Protected derivatives of 3-hydroxymethyl-?-butyrolactone (50) were used as the starting materials of this new methodology. These derivatives were synthesized using the enantioselective hydrogenation of the unsaturated material produced from 3,3-dimethylacrylic acid (81). Enantioselective hydrogenation studies were performed using rhodium and ruthenium chiral catalysts Several butenolides derivatives were studied aiming at the obtention of a satisfactory yield of the enantioselective intermediate (50). The catalytic hydrogenation of these butenolide derivatives with rhodium and ruthenium chiral complexes showed that chelation of the substrate with the metallic center of the asymmetric catalyst strongly depends on the substituent attached to the butenolide skeleton. The hydrogenation products were obtained with a large range of optical purity (2-100% ee), depending on the substituent type. These results indicate that the presence of protective groups in the allylic hydroxyl function has a strong effect on the asymmetric hydrogenation reaction of the studied butenolides. Some computer simulations were performed in order to investigate the mechanism of substrate complexation with the chiral catalyst. [(S)-(?)-2,2?-bis-(diphenylphosphino)-1,1?-binaphtyl]chloro(p-cymene) chloride ruthenium was the chiral catalyst and 3-hydroxymethylbutenolide derivatives were used as substrates. The computer simulation results obtained to date have shown that when there is more than one point of complexation between the metallic center of the chiral catalyst and the unsaturated substrate, the activation energy of the key intermediate is lowered, thus enhancing the catalytic activity and resulting in high stereoselectivity. Once the enantioselective hydrogenation studies were concluded, we pursued the synthesis of natural products from one of the racemic derivatives, the one containing a methoxymethylether as protective group. Once the intermediate aldehyde 87 is obtained, a large number of interesting natural products could be synthesized. New methodologies are now under investigation in order to obtain aldehyde 87, which is difficult to achieve due to its low stability, as described in the literature.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:06:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341828.pdf: 10018081 bytes, checksum: 57e0bb1b94ee6d52c61632de233e80c5 (MD5) Previous issue date: 2016 / O gênero Calea L. (Heliantheae, Asteraceae) contém aproximadamente 125 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do Novo Mundo. Esse gênero tem sido descrito na literatura por apresentar várias propriedades biológicas, tais como atividade anti-inflamatória, citotóxica, leishmanicida, antifúngica, antihipertensiva e hipoglicemiante. A espécie Calea uniflora Less., conhecida popularmente como ?arnica-da-praia?, é empregada na medicina popular devido às suas propriedades anti-inflamatórias; e a espécie C. pinnatifida (R. Br.) Less., conhecida vulgarmente como ?quebra-tudo? e ?olina?, é utilizada popularmente no tratamento de desordens estomacais, e como amebicida e giardicida. Tendo em vista o potencial terapêutico do táxon Calea, o presente trabalho teve como objetivos isolar e identificar os principais constituintes químicos presentes nas folhas de C. uniflora e C. pinnatifida, bem como avaliar o potencial leishmanicida e tripanocida dos compostos isolados. Os compostos foram obtidos através de sucessivos procedimentos cromatográficos (Cromatografia Líquida a Vácuo, Cromatografia em Coluna, Cromatografia em Camada Delgada Preparativa, Cromatografia Líquida de Média Pressão e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência); e a elucidação estrutural foi realizada com base em técnicas espectroscópicas (Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, Infravermelho) e espectrométricas (Espectrometria de Massas de Alta Resolução), determinação do ponto de fusão e comparação com dados publicados na literatura. Da espécie C. pinnatifida foram isolados e identificados cinco cromenos (eupatoriocromeno, metileupatoriocromeno, encecalinol, etil encecalol e 12-hidroxi-encecalina), um aldeído fenólico (vanilina), quatro derivados do ácido hidroxi-cinâmico (cafeato de etila, ácido 3,4-di-O-E-cafeoilquínico, ácido 3,5-di-O-E-cafeoilquínico e ácido 4,5-di-O-E-cafeoilquínico), um diterpeno (fitol) e uma lactona sesquiterpênica inédita na literatura (11,13-diidroxi-calaxina). Da espécie C. uniflora foram isolados e caracterizados treze metabólitos secundários: noreugenina, ácido cafeico, cafeato de etila, uma mistura de buteína+orobol, a-hidroxi-buteína, buteína-4?-O-ß-glicopiranosídeo, quercetina-3-O-ß-glicopiranosídeo, ácido 3,5-di-O-E-cafeoilquínico, desacetileupaserrina, 2a-hidroxi-8ß-2?,3?,5?-trihidroxi-angeloiloxi-costunolídeo, 2a-hidroxi-8ß-3?-hidroxi-2?,5?-epoxi-angeloiloxi-costunolídeo e ovatifolina. Adicionalmente, os compostos isolados foram avaliados frente às formas amastigotas intracelulares de Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi. A lactona 11,13-diidroxi-calaxina foi o composto mais bioativo contra L. amazonensis (CI50 = 8,3 µM) e T. cruzi (CI50 = 5,3 µM). O cafeato de etila e a mistura de buteína+orobol também demonstraram interessante efeito tripanocida, com valores de CI50 de 18,3 e 26,5 µM, respectivamente. O teste de citotoxicidade foi realizado frente à linhagem celular TPH-1, e os valores de CC50 foram calculados para aqueles compostos que apresentaram percentagem de inibição sobre o crescimento dos parasitas > 50%. Os valores de CC50 variaram de 15,6 a 236,7 µM, sendo que o cafeato de etila foi o composto mais seletivo, com índice de seletividade (IS) igual a 12,95.<br> / Abstract : The genus Calea L. (Heliantheae, Asteraceae) contains about 125 species and is distributed essentially in tropical and subtropical regions of the New World. This genus has been reported in the literature to possess several biological properties, including anti-inflammatory, cytotoxic, leishmanicidal, antifungal, antihypertensive and hypoglicemiant activities. Calea uniflora Less., popularly known as "arnica-da-praia", is used in folk medicine due to its anti-inflammatory properties; and C. pinnatifida (R. Br.) Less., commonly known as "quebra-tudo" and ?olina?, is popularly used for treatment of stomach disorders and as amebicidal and giardicidal. In view of the therapeutic potential of taxon Calea, this study aimed to isolate and identify the main chemical constituents present in the leaves from C. uniflora and C. pinnatifida, as well as to evaluate the leishmanicidal and trypanocidal potential of isolated compounds. Compounds were obtained by successive chromatographic methods (Vacuum Liquid Chromatography, Column Chromatography, Preparative Thin-Layer Chromatography, Medium Pressure Liquid Chromatography and High Performance Liquid Chromatography); and structural elucidation was based on spectroscopic (Nuclear Magnetic Resonance 1H and 13C, infrared) and spectrometric techniques (High Resolution Mass Spectrometry), physical data and comparison with published data. From the C. pinnatifida species were isolated and identified five chromenes (eupatoriochromene, methyleupatoriochromene, encecalinol, ethyl encecalol and 12-hydroxy-encecalin), one phenolic aldehyde (vanillin), four hydroxycinnamic acid derivatives (ethyl caffeate, 3,4-O-E-dicaffeoylquinic acid, 3,5-O-E-dicaffeoylquinic acid and 4,5-O-E-dicaffeoylquinic acid), one diterpene (phytol) and one new sesquiterpene lactone (11,13-dihydroxy-calaxin). From C. uniflora were isolated and characterized thirteen secondary metabolites: noreugenin, caffeic acid, ethyl caffeate, a mixture of butein+orobol, a-hydroxy-butein, butein-4'-O-ß-glucopyranoside, quercetin-3-O-ß-glucopyranoside, 3,5-O-E-dicaffeoylquinic acid, desacetyleupaserrin, 2a-hydroxy-8ß-2',3',5'-trihydroxy-angeloyloxycostunolide, 2a-hydroxy-8ß-3'-hydroxy-2',5'-epoxy-angeloyloxycostunolide and ovatifolin. Additionally, isolated compounds were tested against intracellular amastigotes of Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi. The sesquiterpene lactone 11,13-dihydroxy-calaxin was the most bioactive compound against L. amazonensis (IC50 = 8.3 µM) and T. cruzi (IC50 = 5.3 µM). Ethyl caffeate and the mixture butein+orobol also demonstrated interesting trypanocidal effect, exhibiting IC50 values of 18.3 and 26.5 µM, respectively. The cytotoxicity test was performed against macrophage-like THP-1 cells and the CC50 values were calculated for those compounds which showed percentage of parasite growth inhibition > 50%. The CC50 values ranged from 15.6 to 236.7 µM, and ethyl caffeate was the most selective compound, with a selectivity index (SI) of 12.95.

Neste trabalho foram realizados estudos conformacionais de algumas lactonas sesquiterpenicas e cálculos teóricos de deslocamento químico. O estudo conformacional é dividido em tres etapas distintas. A primeira etapa se dá pela busca conformacional em mecânica molecular, onde foram encontradas as possíveis conformações assumidas pelo sistema em estudo. Na segunda etapa, as conformações encontradas foram otimizadas em mecânica quântica. O último passo neste estudo foi o cálculode deslocamento químico e a posterior correlação com os dados experimentais. / This work is aimed on the theoretical calculation of chemical shifts of sesquiterpene lactones, based on the conformational preferences of the compounds. This conformational study is set up in three stages. The first one is a conformational search using molecular mechanics, to assess the relevant conformations of the system under study. In the second stage, the conformations are optimized by quantum mechanics, for the refinement of both the structural assignment and energy calculation of the most stable conformers found in the previous step. The last step is the theoretical calculation of chemical shifts. Finally the weighted average of calculated values is compared to experimental data.

A busca por moléculas de origem natural que ocupem um espaço químico diferente daquelas já existentes tornou-se uma necessidade para atender às novas demandas das indústrias farmacêuticas. A pesquisa envolvendo transformações microbianas de metabólitos secundários de origem vegetal pode ser utilizada como uma nova ferramenta na biosíntese destas novas substâncias, favorecendo a criação de bibliotecas ricas em estruturas com o emprego em diversos alvos biológicos. A tagitinina C é uma lactona sesquiterpênica isolada da Tithonia diversifolia (Asteraceae). Essa substância possui diversas atividades biológicas descritas na literatura. Contudo, há certa ressalva no uso de lactonas sesquiterpênicas para fins terapêuticos devido à elevada toxicidade apresentada por essas substâncias. A biotransformação de substâncias naturais de elevado interesse farmacológico pode ser utilizada com o intuito de diminuir seus efeitos tóxicos ou ampliar sua capacidade terapêutica. Assim, esse trabalho teve como objetivo a utilização de fungos para a biotranformação da tagitinina C. Os resultados obtidos mostraram que os fungos de solo Aspergillus terreus e Mucor rouxii possuem a capacidade de biotransformar tagitinina C. O fungo Aspergillus terreus levou a formação de um produto biotransformado através de uma reação não usual de epoxidação entres os C4-C5 e ainda metoxilação do C1, formando então 1-metóxi-3-hidróxi-3,10-4,5-diepóxi-8-isobutiroilóxi-germacra-11(13)-en-6,12-olido. Os resultados obtidos nesse trabalho demostram que é possível a utilização de fungos na biotransformação da tagitinina C, levando a alterações na molécula que podem influenciar no seu potencial tóxico ou terapêutico. / The search for molecules of natural origin that place a chemical space which is different from the already existing has become that a need in process of discovery new chemical entities with pharmacological interest that support the demand of the pharmaceutical industries. Research involving microbial transformations the secondary metabolites from plants can be used as an alternative for the biosynthesis of such new compounds, thus facilitating the creation of libraries which are rich in structures to be screened against diverse biological targets. Tagitin C is a sesquiterpene lactone isolated from Tithonia diversifolia (Asteraceae) that displays several biological activities already described in the literature. Howeever, due to several reports describing toxic effects of sesquiterpenes lactones, there is a concern in its oral use. Thus, the biotransformation of pharmacologically interesting substances can be carried out with the aim to decrease their toxic effects or amplify their therapeutic properties. Therefore, this work aimed at using of fungi to perform biotransformations of tagitin C. The results showed that the soil fungi Aspergillus terreus and Mucor rouxii have the ability to carry out biological transformations of tagitinin C. The fungus A. terreus led to the formation of a different product through an unusual reaction of epoxidation between C4-C5 and metoxilation of C1 of tagitinin C, the derivative 1-methoxy-3-hydroxy-3,10-4,5-diepoxy-8-isobutiroyloxygermacr- 11 (13)-en-6 ,12-olide. The results of this work show that it is possible to use soil fungi in the biotransformation of tagitinin C, leading to changes in the chemical structure that may influence its toxic or therapeutic potential.

Foi estudado o mecanismo da reação de alguns ésteres do áci¬do alilacético com reagentes electrófilicos. 1 - Foram preparados os seguintes ésteres para o estudo do fatôr estérico: alilacetato de fenila, alilfenilacetato de fenila e alildifenilacetato de fenila. A susceptibilidade da reação ao fatôr estérico (&#948;) foi (-0.5). 2 - Foram preparadas as seguintes séries de compostos para o estudo do efeito do fatôr polar sôbre a velocidade de reação: alil p-x-fenilacetato de fenila, onde x = NO2, Cl, F, H, CH3 e CH3O. A velocidade de reação aumenta para grupos que cedem elétrons e diminui para grupos que atraem elétrons. O valôr de p da equação de Hammett foi (-0.5). O significado dêste resultado foi discutido. 3 - Foi proposto o mecanismo da reação considerando-se as seguintes observações: a) a lactona formada é um anel de cinco membros. b) a reação global é de segunda ordem; de primeira ordem com relação ao éster e de primeira ordem com relação co cloreto de mercúrio II. c) a reação se dá com a participação do grupo carboxifenila vizinho e de água. d) a etapa lenta da reação é aquela em que ocorre a saída da molécula de fenol. / Abstract not available

O processo de transformação microbiana de metabólitos secundários é uma técnica emergente no Brasil e que apresenta enorme potencial para obtenção de substâncias biotransformadas com novas e diferentes moléculas, as quais podem apresentar melhor desempenho de suas atividades biológicas. O objetivo do presente projeto foi efetuar transformações microbianas de metabólitos secundários oriundos da espécie vegetal Viguiera robusta Gardn. (família Asteraceae), com ênfase nas lactonas sesquiterpênicas (LSTs), para posterior avaliação de sua citotoxicidade frente a linhagens celulares. As etapas de isolamento e purificação de LSTs foram realizadas através de métodos cromatográficos e a elucidação estrutural através de métodos espectroscópicos. A avaliação da atividade citotóxica dos metabólitos biotransformados foi proposta em virtude de estudos iniciais indicarem potencial citotóxico da LST budleína A frente às linhagens SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama) e células leucêmicas JURKAT. / The microbial transformation of secondary metabolites is an emerging technique in Brazil with high potential to obtain biotransformed compounds with new and different molecules which can show enhanced biological activities. Herein, microbial transformations of secondary metabolites from Viguiera robusta Gardn. (family Asteraceae), with emphasis in sesquiterpene lactones (STLs), were proposed with the aim to evaluate their cytotoxic activity against tumor cells lines. Isolation and purification of STLs were carried out through chromatographic methods and structural elucidation by spectroscopic methods. The evaluation of cytotoxic activity of the biotransformed metabolites was proposed due to the fact that previous studies indicated potential cytotoxic activity of the STLs budlein A against SK-BR-3 and JURKAT cells lines.

Orientadores: João Ernesto de Carvalho, Ronaldo Aloise Pilli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-28T18:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_DeboraBarbosaVendramini_D.pdf: 5920460 bytes, checksum: d6638ad4d3d0a96e4bbcdb55823f3254 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A carcinogênese é um processo longo, multi-etapas, onde células normais progressivamente adquirem um fenótipo neoplásico. Sua origem é favorecida por fatores genéticos, exposição à carcinógenos químicos, infecções crônicas e incorporação de mutações em genes envolvidos com a regulação da homeostase celular. O crescente entendimento da biologia tumoral tem fornecido alvos moleculares para a triagem orientada de quimioterápicos e de agentes quimiopreventivos, geralmente de origem natural ou sintetizados com base em produtos naturais. A evolução da química orgânica permitiu que compostos naturais fossem sintetizados de forma econômica e aperfeiçoados quanto às suas propriedades físico-químicas, favorecendo sua disponibilidade. Esse trabalho teve como foco a goniotalamina, uma estiril-lactona naturalmente encontrada na forma enantiomérica (R) em plantas do gênero Goniothalamus (Annonaceae). Foram sintetizadas as formas (R), (S) e racêmica, que em painel de nove linhagens tumorais humanas levaram à inibição de crescimento e morte celular com elevada potência. Apesar da potência sobre a MCF-7 (carcinoma mamário responsivo ao estrógeno), estudos com estimulação estrogênica revelaram que a atividade da goniotalamina é independente da via hormonal. De qualquer maneira, a goniotalamina racêmica inibiu em 65% a proliferação da MCF-7 implantada em fibras semipermeáveis (hollow fiber) em camundongos. A citometria de fluxo revelou que o racemato de goniotalamina induz apoptose na linhagem tumoral de cólon HT-29 em baixa concentração (10 ?g/mL), com participação das caspases 8 e 9, sugerindo ativação das vias extrínseca e intrínseca. Houve também indução de apoptose na linhagem de melanoma humano SK-MEL-2, mas esse efeito diminuiu quando essa linhagem foi transfectada com Bcl-XL, inibidor apoptótico ligado à mitocôndria, sugerindo ativação principalmente da via apoptótica extrínseca, com ativação da via intrínseca para amplificação do sinal. A goniotalamina em suas três formas comprovou in vivo a atividade apresentada in vitro, pela inibição do desenvolvimento tumoral em modelo de tumor sólido e ascítico de Ehrlich, sem sinais de toxicidade nas doses efetivas. Esses resultados, aliados aos bons rendimentos na rota sintética, favoreceram a continuidade dos estudos com a forma racêmica. Considerando que aproximadamente 25% dos tumores estão relacionados com inflamações crônicas, a goniotalamina racêmica foi avaliada em modelos de edema de pata induzido por carragenina e por diversos mediadores (fosfolipase A2, histamina/serotonina, prostaglandina E2 e bradicinina), apresentando atividade anti-edematogênica em todos os modelos. Corroborando com esses resultados, a goniotalamina apresentou efeito antinociceptivo em modelos de algesia induzidos por processos inflamatórios. A goniotalamina inibiu o desenvolvimento de colite induzida por TNBS e o tratamento oral (30 mg/kg, três vezes por semana/três meses) preveniu o desenvolvimento de inflamação e câncer em animais deficientes em interleucina 10, sem apresentar sinais de toxicidade. Tais dados foram revelados após análise de dano macroscópico e microscópico (histologia) do cólon, havendo diminuição da expressão relativa dos genes para TNF? e MMP9, importantes no processo inflamatório e de invasão e metástase. Além disso, a goniotalamina diminuiu a incidência de metástase pulmonar em modelo de melanoma metastático. Os resultados obtidos e o perfil multi-alvos apresentado pela goniotalamina sugerem sua avaliação em terapias combinatórias para tratamento de processos inflamatórios crônicos e de câncer / Abstract: Carcinogenesis is a long process involving several steps, in which normal cells progressively acquire a neoplastic phenotype. Its origin is favored by genetic factors, exposure to chemical carcinogens, chronic infections and incorporation of mutations into genes involved in regulation of cellular homeostasis. The increasing understanding of tumor biology has provided molecular targets for screening of targeted chemotherapeutic and chemopreventive agents, usually from natural sources or synthesized based on natural products. The improvement of organic chemistry allowed the synthesis of natural products in an economic and refined way, with improvement on their physicochemical properties and availability. This work focuses on goniothalamin, a styryl-lactone naturally found on its enantiomeric form (R), in plants of Goniothalamus (Annonaceae) genus. The (R), (S) and racemic forms were synthesized and led to growth inhibition and cell death in a panel of nine human tumor cell lines, with high potency. Despite the potency against MCF-7 (breast carcinoma responsive to estrogen), estrogen stimulation studies revealed that the goniothalamin activity is independent of the hormone pathway. Anyway, racemic goniothalamin inhibited on 65% the proliferation of MCF-7 implanted into semi permeable fibers (hollow fiber) in mice. Flow cytometry analysis showed that low concentration of racemic goniothalamin (10 ?g/mL) leads colon tumor cell line (HT-29) to apoptosis with involvement of caspase 8 and 9, suggesting the activation of the extrinsic and intrinsic pathways. Apoptosis was also induced in human melanoma cell line SK-MEL-2, but the activity was decreased in SK-MEL-2 transfected with Bcl-XL, a mitochondrial related apoptotic inhibitor, suggesting mainly activation of the extrinsic apoptotic pathway, with activation of the intrinsic pathway to amplify the signal. Goniothalamin on its three forms comproved in vivo the in vitro activity by inhibiting tumor development in models of Ehrlich solid and ascitic tumor in mice, without signals of toxicity at the effective doses. These results, combined with good yields in the synthetic rout favored the racemic form to continue the in vivo studies. Considering that about 25% of tumors are related to chronic inflammation, racemic goniothalamin was evaluated in models of paw edema induced by carrageenan and various mediators (phospholipase A2, histamine/serotonin, prostaglandin E2 and bradykinin) displaying anti-edematogenic activity in all models. Corroborating these results, goniothalamin showed antinociceptive effect in models of algesia induced by inflammatory processes. It also inhibited the development of TNBS-induced colitis and oral treatment (30mg/kg, three times/week, three months) prevented the development of inflammation and cancer in interleukin-10 deficient mice, without signals of toxicity. These data were revealed after macroscopic and microscopic (histology) colon damage analysis, with decreased expression of TNF? and MMP9, which are important in inflammation, invasion and metastasis process. Furthermore, goniothalamin reduced the incidence of lung metastasis in a metastatic melanoma model. These results and the multitarget profile presented by goniothalamin suggest its evaluation in combinatory therapies for treatment of chronic inflammation and cancer / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural