Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-04-22T16:09:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Final Dissertção.pdf: 2617689 bytes, checksum: c147bcfc357fc3a4030f61766ed9bad5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-22T16:09:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Final Dissertção.pdf: 2617689 bytes, checksum: c147bcfc357fc3a4030f61766ed9bad5 (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / CNPq / A abordagem mais promissora para um diagnóstico eficaz da Leishmaniose Visceral (LV) utiliza ensaios sorológicos com proteínas recombinantes, pois apresentam grande sensibilidade e especificidade, associados a baixo custo e fácil execução. Misturas de alguns antígenos geram resultados mais promissores, contudo, a produção destas aumenta os custos e dificulta a padronização. É ideal a produção de uma única proteína quimérica que apresente boa sensibilidade e seja eficiente no diagnóstico das formas humana e canina da LV. Este estudo objetivou avaliar as condições para expressão em Escherichia coli de genes sintéticos codificando proteínas quiméricas compostas por regiões selecionadas de antígenos previamente identificados de Leishmania infantum. Quatro genes, contendo os mesmos antígenos em diferentes combinações, foram otimizados para expressão em procariotos e sintetizados. Sítios internos de restrição foram incluídos nas sequências de forma a permitir a eliminação seletiva de segmentos específicos e se avaliar o efeito na expressão bacteriana da presença de diferentes regiões antigênicas, bem como de um peptídeo estimulador da tradução. A expressão das proteínas geradas foi então avaliada através de ensaios de Western Blot. Os resultados obtidos mostraram uma expressão equivalente, porém limitada, das diferentes proteínas quiméricas, independente da sua composição antigênica. Proteínas menores tiveram resultados mais promissores na expressão e o peptídeo estimulador da tradução foi essencial para otimizar essa expressão, porem ainda faz-se necessário mais estudos avaliando a sensibilidade e especificidade dessas proteínas para o diagnóstico da LV. / The most promising approach for effective diagnosis of Visceral Leishmaniasis (VL) uses serological assays with recombinant proteins, since they have high sensitivity and specificity associated with low cost and easy implementation. Mixtures of some antigens generate the most promising results, however, these increase production costs and impairs its standardization. The best option would be the production of a single chimeric protein showing good sensitivity and being effective for the diagnosis of the human and canine forms of VL. This study aimed to evaluate the conditions for expression in Escherichia coli of synthetic genes encoding chimeric proteins composed of selected regions of previously identified antigens of Leishmania infantum. Four genes, containing the same antigens in different combinations, were optimized for expression in prokaryotes and synthesized. Internal restriction sites were included in the sequences to allow selective removal of specific segments and to evaluate the effect on the bacterial expression of the presence of different antigenic regions, as well as a translational enhancer peptide. The expression of proteins generated was then evaluated by Western blot assays. The results showed equivalent expression, however limited, of the different chimeric proteins, regardless of their antigenic composition. Smaller proteins produced more promising results in the expression and the translation enhancer peptide was important to optimize this expression, however further studies are still necessary to evaluate the sensitivity and specificity of these proteins for the diagnosis of VL.

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Resumo: A leishmaniose é uma doença antropozoonótica causada pelo protozoário do gênero Leishmania. Ele apresenta três formas clínicas, conhecidas como leishmaniose visceral, leishmaniose cutânea e leishmaniose mucocutânea. A leishmaniose visceral afeta dois milhões de indivíduos anualmente no mundo. Os fato res genéticos envolvidos na interação hospedeiro - parasita foram associados ao desfecho clínico da doença. Este estudo investigou pela primeira vez a associação de polimorfismos nos genes candidatos IL10, NOD2 e TLR1 com leishmaniose visceral na população b rasileira. Para isso, escolhemos três marcadores anteriormente associados a infecções causadas por parasitas intracelulares na população brasileira. Nós genotipificamos 135 pacientes e 380 controles saudáveis. A presença do alelo G do rs4833095 no gene TLR 1 foi fortemente associada à susceptibilidade a esta doença: análise do alelo G (OR 2.04; IC 1.22 - 3.39; p - value 0.0061); Análise do genótipo GG (OR 3,87; 95 %IC 1,85 - 8,08, p - valor 0,0003); Análise de portadores de G (OR 2,5; 95 %IC 1,33 - 5,00; valor p 0,0047) . Para o gene NOD2, também encontramos uma associação para o genótipo AA (OR 2.07 95 %IC 1.05 - 4.05, p - value 0.0335) do polimorfismo rs8057341. Finalmente, poderíamos confirmar a associação do marcador rs1800871 na região promotora do gene IL10 com susceptib ilidade à leishmaniose visceral, para o genótipo TT (OR 2,34; CI 95 %IC 1,11 - 4,94 p - value 0,0245). Conclusão. Nossos dados demonstram pela primeira... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Renata de Britto Mari / Resumo: A leishmaniose visceral é considerada a forma clínica mais grave das leishmanioses. É causada pelo parasita da espécie Leishmania chagasi que pode ser transmitida para animais silvestres, animais domésticos e também para o homem e que vem expandindo seu território. A infecção atinge principalmente o baço, o fígado e a medula óssea, porém, a infecção também atinge outros sistemas do organismo, como o trato gastrointestinal (TGI). O TGI é controlado pelo sistema nervoso entérico (SNE) que tem como função controlar o fluxo sanguíneo, relaxamento e contração da musculatura lisa local, agindo de maneira independente do sistema nervoso central, mas mantendo contato através do eixo cérebro-intestinal. Além disso, tem relação com o sistema imunológico, visto que o intestino é considerado o maior órgão imune do corpo. Os neurônios mioentéricos do SNE são responsáveis por toda motilidade do TGI sofrendo alterações sempre que sofrem algum tipo de estresse, como por envelhecimento, dietas e até mesmo doenças. Essas alterações mostram a plasticidade neuronal para que seja mantida sempre a homeostase do intestino. Portanto, visto a importância do SNE para o funcionamento adequado do organismo, o objeivo desse trabalho foi observar como o parasitismo causado por L. chagasi atinge o intestino delgado de hamsters em diferentes períodos, avaliando a plasticidade neuronal ao decorrer da infecção parasitária. Para isso foram utilizados hamsters dourados que foram divididos em grupo controle e ex... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral leishmaniasis is considered the most severe clinical form of leishmaniasis. It is caused by the parasite of the species Leishmania chagasi that can be transmitted to wild animals, domestic animals and also to the human and, it has been expanding its territory. The infection mainly affects the spleen, liver and bone marrow, but the infection can also affect other systems of the body, such as the gastrointestinal (GI) tract. GI tract is controlled by the enteric nervous system (ENS), whose function is to control blood flow, relaxation and contraction of the local smooth muscle, acting independently of the central nervous system, but maintaining contact through the cerebellar-intestinal axis. In addition, it is related to the immune system, since the intestine is considered the largest immune organ in the body. The myenteric neurons of the ENS are responsible for all the motility of the GI tract undergoing changes whenever they suffer some type of stress, such as by aging, diets and even illnesses. These changes show the neuronal plasticity so that intestinal homeostasis is always maintained. The objective of this work was to observe how the parasitism caused by L. chagasi reaches the small intestine of hamsters in different periods, evaluating the neuronal plasticity during the parasitic infection. For this purpose, golden hamsters were used, which were divided into control and experimental groups. The animals were euthanized after 30, 60 and 90 days of infection and f... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A leishmaniose visceral ou calazar é uma doença negligenciada, fatal que afeta a população pobre nos países em desenvolvimento. Há falha no controle da transmissão da doença devido à demora no diagnóstico, tratamento e toxicidade das drogas utilizadas, necessitando de novas estratégias. Dentre as estratégias seria de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina a fim de minimizar a frequência dos casos e eliminar a doença. Nesse estudo, avaliamos a resposta imune celular a 10 antígenos recombinantes (SMT, CPB, NH, A2, KMP11, VIZ92, NS, A2MAT, 8NSA e NSA) bem assim ao antígeno solúvel de Leishmania (SLA), dosando as seguintes citocinas: IL-1ß, IL-12p70, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-27, TNF-α. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 37 indivíduos: LV ativa, LV curado, DTH+ e controles sadios foi estimulado com os antígenos acima por 72 horas a 37ºC/5% de CO2. Ressaltamos que não houve alteração significativa de outras citocinas, além do INF-γ, TNF-α e IL-10, em resposta aos demais antígenos recombinantes não destacados nos resultados deste estudo. Assim, observamos concentração elevada de INF-γ e/ou TNF-α acompanhados de resposta ao IL-10 em indivíduos mais protegidos em resposta ao estímulo dos antígenos: CPB, VIZ92 e 8NSA; destacamos que em relação ao antígeno CPB tem-se concentração significativa de INF-γ no grupo DTH+ se comparado ao grupo LV ativa e correlação direta entre as concentrações de INF-γ e TNF-α entre estes dois grupos. Sugerimos que os antígenos CPB, VIZ92 e 8NSA possam estar associados à indução de resposta protetora e ser promissores para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia. / A leishmaniose visceral ou calazar é uma doença negligenciada, fatal que afeta a população pobre nos países em desenvolvimento. Há falha no controle da transmissão da doença devido à demora no diagnóstico, tratamento e toxicidade das drogas utilizadas, necessitando de novas estratégias. Dentre as estratégias seria de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina a fim de minimizar a frequência dos casos e eliminar a doença. Nesse estudo, avaliamos a resposta imune celular a 10 antígenos recombinantes (SMT, CPB, NH, A2, KMP11, VIZ92, NS, A2MAT, 8NSA e NSA) bem assim ao antígeno solúvel de Leishmania (SLA), dosando as seguintes citocinas: IL-1ß, IL-12p70, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-27, TNF-α. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 37 indivíduos: LV ativa, LV curado, DTH+ e controles sadios foi estimulado com os antígenos acima por 72 horas a 37ºC/5% de CO2. Ressaltamos que não houve alteração significativa de outras citocinas, além do INF-γ, TNF-α e IL-10, em resposta aos demais antígenos recombinantes não destacados nos resultados deste estudo. Assim, observamos concentração elevada de INF-γ e/ou TNF-α acompanhados de resposta ao IL-10 em indivíduos mais protegidos em resposta ao estímulo dos antígenos: CPB, VIZ92 e 8NSA; destacamos que em relação ao antígeno CPB tem-se concentração significativa de INF-γ no grupo DTH+ se comparado ao grupo LV ativa e correlação direta entre as concentrações de INF-γ e TNF-α entre estes dois grupos. Sugerimos que os antígenos CPB, VIZ92 e 8NSA possam estar associados à indução de resposta protetora e ser promissores para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia.

Orientador: Maria Rita Donalisio Cordeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T19:12:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VonZuben_AndreaPaulaBruno_D.pdf: 2257124 bytes, checksum: c8df8e57198bfa7318ad86e3de4af6f3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma zoonose causada pelo protozoário Leishmania (L.) infantum e transmitida predominantemente pelo flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. No meio urbano, o cão doméstico atua como reservatório e fonte de infecção para o homem. A LVA é uma zoonose de caráter reemergente e um grave problema de saúde pública. As estratégias de controle de LVA estão contidas no Programa Brasileiro de Vigilância e Controle (PCLV) e estão centradas no controle do reservatório e vetores e na educação em saúde. Em Campinas, no final do ano de 2009, foi confirmado o primeiro caso de LVA canino autóctone em área de proteção ambiental na região leste da cidade. Após as investigações de foco foram diagnosticados casos adicionais de LVA em cães e identificada a presença do vetor. Com esta ocorrência, passou a ser considerado município com transmissão canina. O objetivo deste trabalho foi descrever a organização espacial do primeiro foco de LVA de Campinas sob as perspectivas ecológica, geográfica e social a fim de obter uma melhor compreensão das interações entre meio ambiente, sociedade, os riscos em saúde pública e as dificuldades na execução do preconizado pelo PCLV. Para avaliar tais dificuldades foi realizado também estudo qualitativo através de entrevistas semi-estruturadas com coordenadores de municípios de grande porte com transmissão canina e/ou humana (Bauru, Belo Horizonte, Campo Grande, Goiânia e Fortaleza) de LVA. Por fim, foi avaliado uso de coleiras impregnadas com deltametrina a 4% como medida para diminuição da prevalência canina e consequentemente evitar casos humanos em Campinas. Os achados neste trabalho mostram que no Brasil as intervenções de saúde pública não têm apresentado resultados positivos na prática uma vez que há descontinuidade das atividades de controle devido a recursos insuficientes para sustentabilidade das ações e há resistência dos sujeitos implicados pela doença, particularmente associados ao reservatório canino e ao controle químico. Avaliou-se também que, embora sejam consideradas estratégicas, as ações de comunicação relacionadas a esse agravo não têm conseguido alcançar os objetivos de estimular a adesão ao programa e evitar desconfortos nas comunidades atingidas. Por fim, o uso de coleiras inseticidas foi considerado positivo como medida auxiliar na diminuição da prevalência canina com boa aceitação da comunidade. E em conclusão, ficou clara a necessidade de reavaliação da política brasileira de controle de LVA para garantia de maior efetividade na prevenção e controle da doença / Abstract: American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a zoonosis caused by Leishmania (L.) infantum protozoa and transmitted by the Lutzomyia longipalpis phlebotomus as the main vector. In urban environment, dogs act as a reservoir and source of infection for vectors. American visceral leishmaniasis is a reemerging zoonosis and a serious public health problem. The guidelines of the Brazilian Program of Surveillance and Disease Control (PCLV) have their bases in control of the reservoir, vector and in health education. Campinas was added to the list of municipalities with established canine transmission kept by the state's AVL Surveillance and Control Program in 2009, with the confirmation of the first autochthonous case of canine AVL. Disease notification occurred in a residential lot with good infrastructure and resident population with high socioeconomic status, situated in an environmental protection area of the east part of the city. The present study aims at describing the process of investigation of reservoirs, vectors and environment associated with the outbreak of canine AVL in a grand scale municipality and the difficulties in implementing the measures proposed by PCLV. In order to evaluate these difficulties a qualitative study was also performed through semi-structured interviews with coordinators of large municipalities with canine and / or human transmission (Bauru (SP), Goiania (GO), Campo Grande (MT), Fortaleza (EC) and Belo Horizonte (MG)). Finally was evaluated the use of deltamethrin impregnated collars as a measure to decrease the prevalence of canine AVL and thus avoid human cases in Campinas. The findings in this study show that in Brazil the interventions have not produced positive results in the municipal level. The main problems referred were: discontinuity of the activities and strength of subjects involved by the disease, particularly associated with canine reservoir and housing fumigation. It was evaluated also that, although considered strategic, communication actions have not been able to achieve the goals of encouraging adherence to the program and to avoid discomfort in the affected communities. In conclusion, there is a clear need for reassessment of Brazilian policy for the control and prevention of LV to ensure effectiveness of actions / Doutorado / Epidemiologia / Doutora em Saúde Coletiva

Made available in DSpace on 2016-05-19T12:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) 2016barbosa-junior-wl.pdf: 2215174 bytes, checksum: ec8edd1a6fc480050cdd6db05c9631f6 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Orientador: Raul Borges Guimarães / Banca: José Eduardo Tolezano / Banca: Edilson Ferreira Flores / Banca: João Osvaldo Rodrigues Nunes / Banca: Jorge Amancio Pickenhayn / Resumo: Na presente tese desenvolvemos um modo de pensar geográfico a respeito da leishmaniose visceral (LV), uma doença com grande relevância mundial que afeta seres humanos e animais. Para isso, discutimos a LV no Brasil enquanto um problema de saúde pública a partir da distribuição de casos no Planalto Ocidental Paulista. O objetivo desta tese é definir e analisar os padrões espaciais e epidemiológicos da LV na escala regional e local, tendo como recorte empírico os municípios de Araçatuba, Presidente Prudente e Votuporanga, no estado de São Paulo, Brasil. Partimos da leitura da paisagem epidemiológica da LV e da descrição da narrativa geográfica dos serviços de saúde para a elaboração de um raciocínio geográfico de maior complexidade, com base em diferentes conceitos da Geografia, tais como: paisagem, espaço, sítio-situação e escala. Utilizamos a análise espacial, com ferramentas dos Sistemas de Informação Geográfica (SIG) e modelagem espacial, os quais permitiram delinear dois padrões distintos da LV no estado de São Paulo: a região do Planalto Ocidental Paulista e a região Inerte, onde a primeira possui maior intensidade de casos da doença e é definida, inicialmente, por variáveis ambientais, embora ações humanas influenciem em sua dispersão. Na escala local, variáveis socioeconômicas, modos de viver a vida, políticas de saúde e características ambientais definem e são definidas no espaço, estabelecendo um padrão periférico dos casos da doença nas cidades. Os resultados apontam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this thesis, we developed a geographic way of thinking about visceral leishmaniasis (VL), a disease with a huge worldwide relevance that affects human beings and animals. We discussed VL as a public health problem in Brazil, analyzing the distribution of cases in the Paulista Western Plateau region. This thesis aims to define and analyze the spatial and epidemiological patterns of VL at the regional and local scale, focusing on the municipalities of Araçatuba, Presidente Prudente, and Votuporanga, all of which are located in the Brazilian state of São Paulo, Brazil. We present the epidemiological landscape of VL and the description of the geographical narrative of public health services aiming to achieve a more complex geographic reasoning based on different concepts of Geography, such as landscape, site-situation, and scale. We employed spatial analysis, for instance Geographic Information System (GIS) and spatial modeling tools, which allowed us to identify two VL patterns in the state of São Paulo: the region of the Paulista Western Plateau and the Inert region, where the first has the highest intensity of cases, and it is, initially, defined by environmental factors, although human actions influence the disease cases spreading. At the local scale, socioeconomic variables, lifestyle, health policies, and environmental characteristics define and are defined in space, establishing a peripheral pattern of disease cases in the cities. The results highlight that VL needs to ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A Leishmaniose visceral é uma doença parasitária crônica em homens e cães, causada por protozoários da espécie L. (Leishmania) chagasi. O diagnóstico parasitológico é confirmado pelo achado do agente em aspirados de medula óssea, linfonodo, baço e fígado, enquanto que a sorologia IgG especifica é usada em geral para estudos epidemiológicos, apesar dos altos níveis séricos de anticorpos IgG anti-Leishmania. Existem relatos anedóticos de resultados sorológicos negativos em doença ativa, atribuído à formação de imunocomplexos. Dado que imunocomplexos podem ser dissociados por tratamento ácido, nós buscamos a padronização de um teste simples de dissociação ácida dos imunocomplexos de amostras de soro, por tratamento ácido e neutralização em poços adsorvidos com antígenos de Leishmania, seguida de ELISA (ELISA dissociativo). A confirmação da presença de antígenos foi realizada pela detecção após adsorção ácida por DOT-ELISA, usando soro de coelho hiperimune anti-Leishmania. Amostras de hamsteres infectados experimentalmente com L. (L.) chagasi mostraram a presença e interferência de imunocomplexos na sorologia principalmente nas fases iniciais da infecção, por ELISA dissociativo e DOT-ELISA. Em amostras maiores de áreas endêmicas, o ELISA dissociativo aumentou a soropositividade em 10% em amostras de cães negativas e 3,5% de amostras humanas negativas, com confirmação por DOT-ELISA. Os resultados mostram que este teste poderia ser usado no diagnóstico da LV, como abordagem alternativa para a identificação sorológica de casos assintomáticos e para indicação de métodos parasitológicos invasivos confirmatórios. / Visceral leishmaniasis, caused by Leishmania (Leishmania) chagasi, is a chronic parasitic disease of humans and dogs. Confirmation of the protozoal agent in bone marrow, lymph node or spleen aspirate is diagnostic, while specific-IgG serology is used mainly for epidemiology despite the general presence of high levels of serum immunoglobulins. Anecdotal reports of false-negative serology in active disease cases are known and are ascribed to the formation of immune complexes. Because dissociation of immune complexes can be accomplished by acid treatment, we devised a simple, routine enzyme immunoassay (ELISA) for the dissociation of immune complexes in serum samples using acid treatment and neutralization in wells adsorbed with Leishmania antigen (dELISA). Confirmatory acid DOT-ELISA was also developed for antigen detection by anti-Leishmania rabbit antiserum. In experimental L. (L.) chagasi hamster models, immune complexes interfered with ELISA mostly in the early stages of infection, according to both dELISA and antigen DOT-ELISA results. In larger samples from endemic areas, dELISA increased seropositivity by 10% in negative dog samples (7/70) and 3.5% in negative human samples (3/85), showing that dELISA could be used in the serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Moreover, dELISA could be used as an alternative approach to screening asymptomatic visceral leishmaniasis patients, instead of invasive confirmatory testing.

A leishmaniose visceral é uma doença parasitária caracterizada por altos níveis de anticorpos IgG, importantes para o diagnóstico da infecção, mas sem discriminar doença ativa. Sem papel efetivo durante a resposta imune, estes anticorpos participam na formação de imunocomplexos circulantes, indicando a presença de antígenos circulantes. Apesar da alta especificidade diagnóstica, a detecção de antígenos em soro é pouco explorada na leishmaniose visceral. A detecção de antígenos e imunocomplexos dependem tanto da especificidade de anticorpos como das características dos antígenos, que podem ser desde grandes proteínas ou pequenos polissacarídeos. Neste estudo, avaliamos a detecção de antígenos circulantes livres ou em imunocomplexos, e as características e especificidade antigênica de anticorpos IgG a proteínas ou carboidratos de L. (L) infantum chagasi em leishmaniose visceral experimental. Amostras de hamster com infecção experimental por L. (L.) infantum chagasi foram avaliadas aos 15, 30, 45, 60 e 90 dias de infecção. Altas concentrações de anticorpos IgG específicos foram detectadas em amostras com leishmaniose visceral experimental e natural, sempre com alta avidez, mesmo em períodos iniciais da infecção. A purificação por imunoafinidade de IgG de baixa avidez também confirmou esta alta concentração. Proteínas e carboidratos foram isolados do extrato antigênico total de promastigotas por cromatografia de exclusão molecular ou precipitação com etanol e marcadas com biotina para aminas ou açucares. Para uso em ELISA, carboidratos foram conjugados a BSA, o que permitiu a detecção de altos níveis de anticorpos IgG específicos para carboidratos. A presença de carboidratos antigênicos também foi demonstrada através da detecção de incremento de IgG em amostras com infecção experimental, o que confirmou a presença de imunocomplexos circulantes específicos a carboidratos. Nossos dados sugerem, que a participação da resposta imune humoral na leishmaniose visceral deve ter o envolvimento de carboidratos do parasita. O desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas para a detecção de carboidratos antigênicos pode permitir a identificação de imunocomplexos e antígenos circulantes na leishmaniose visceral. / Visceral leishmaniasis is a parasitic disease characterized by high levels of IgG antibodies, important for the diagnosis of the infection, but without discriminating active disease. Without effective role during the immune response, these antibodies participate in the formation of circulating immune complexes, indicating the presence of circulating antigens. Despite the high diagnostic specificity, the detection of antigens in serum is poorly explored in visceral leishmaniasis. The detection of antigens and immunocomplexes depend on both the specificity of antibodies and the characteristics of the antigens, which may be from large proteins or small polysaccharides. In this study, we evaluated the detection of free circulating antigens or immunocomplexes, the characteristics and antigenic specificity of IgG antibodies to proteins or carbohydrates of L. (l) infantum in experimental visceral leishmaniasis. Hamster samples with experimental infection by L. (L.) infantum chagasi was evaluated at 15, 30, 45, 60 and 90 days of infection. High concentrations of specific IgG antibodies were detected in samples with experimental and natural visceral leishmaniasis, always with high avidity, even in initial periods of infection. Immunoaffinity purification of low avidity IgG also confirmed this high concentration. Proteins and carbohydrates were isolated from the total antigenic extract of promastigotes by molecular exclusion chromatography or ethanol precipitation and labeled with biotin for amines or sugars. For use in ELISA, carbohydrates were conjugated to BSA, which allowed the detection of high levels of carbohydrate-specific IgG antibodies. The presence of antigenic carbohydrates was also demonstrated by the detection of IgG increase in samples with experimental infection, which confirmed the presence of circulating immunocomplexes specific to carbohydrates. Our data suggest that the involvement of the humoral immune response in visceral leishmaniasis should have the involvement of carbohydrates of the parasite. The development of new diagnostic tools for the detection of antigenic carbohydrates may allow the identification of immunocomplexes and circulating antigens in visceral leishmaniasis.

Dentre as doenças parasitárias tropicais, as causadas por protozoários se apresentam como um grande desafio para a saúde pública, sendo representadas pela leishmaniose e doença de Chagas. Afetam grandes populações marginais ao processo econômico globalizado, e desta forma, não são vistas como mercados potenciais. O presente projeto visou o isolamento de novos compostos naturais de venenos animais com atividade anti-Leishmania e anti-T. cruzi. O presente estudo fracionou por diferentes técnicas cromatográficas, os venenos dos anfíbios Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi e Phyllomedusa hypochondrialis, visando o isolamento de peptídeos e metabólitos secundários através de ensaios biomonitorados. Utilizando-se a espectrometria de massas e seqüenciamento por degradação química de Edman, foi possível a caracterização bioquímica de cinco peptídeos ativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis, sendo estes a bradicinina, as dermaseptinas 1 e 4 e as filoseptinas 7 e 8. Os peptídeos apresentaram uma Concentração Efetiva 50% (CE50) variando entre 0,7 a 20 ?g/mL em L. (L.) infantum chagasi e T. cruzi, com baixa ou nenhuma citotoxicidade para células de mamíferos nas concentrações testadas. Além disso, a separação química da secreção do anfíbio Siphonops annulatus forneceu uma fração altamente ativa em promastigotas de L. (L.) infantum chagasi, com CE50 0,065 ?g/mL, porém com toxicidade bastante elevada para macrófagos peritoneais e nenhuma seletividade nas formas intracelulares. Estudos ultraestruturais de Leishmania demonstraram severos danos mitocondriais, além da formação de grande vacúolos citoplasmáticos, levando o parasita a morte em poucas horas. O presente estudo demonstrou o potencial de peptídeos e metabólitos secundários de venenos de anfíbios, que se adequadamente estudados, poderão contribuir como novos protótipos de fármacos para a doenças negligenciadas. / Among the tropical parasitic diseases, those caused by protozoa present a major challenge to public health, being represented by leishmaniasis and Chagas disease. Affect large populations marginal to the global economic process, and thus are not seen as potential markets. This project aimed the isolation of new natural compounds in animal venoms with anti-Leishmania activity and anti-T. cruzi. The present study fractionated by different chromatographic techniques, the poisons of the amphibians Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi and Phyllomedusa hypochondrialis, aiming the isolation of peptides and secondary metabolites through bioguided assays. By using mass spectrometry and sequencing by Edman degradation, it was possible to do the biochemical characterization of five active peptides from the poison of Phyllomedusa hypochondrialis, as bradykinin, dermaseptins 1 and 4 and phylloseptins 7 and 8. The peptides showed a 50% Effective Concentration (EC50) ranging from 0.7 to 20 ?g/mL in L. (L.) infantum chagasi and T. cruzi, with little or no cytotoxicity to mammalian cells at the tested concentrations. In addition, the chemical separation of the poison of the amphibian Siphonops annulatus provided a highly active fraction against promastigotes of L. (L.) infantum chagasi, with an EC50 of 0.065 ?g/mL, but highly toxicity to peritoneal macrophages and without selectivity against the intracellular forms of Leishmania. Ultrastructural studies of Leishmania showed severe mitochondrial damages and the formation of large cytoplasmic vacuoles, leading to parasite death within few hours. The present study demonstrated the potential of peptides and secondary metabolites of amphibian poisons, and if adequately studied, may contribute as prototypes of new drugs for neglected diseases.