Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-14Bitstream added on 2014-06-13T18:59:03Z : No. of bitstreams: 1 000760003.pdf: 3284436 bytes, checksum: eb7831cb9642442476baebeb6fa5a800 (MD5) / Leishmania infantum (syn. L. chagasi) é o agente causador da Leishmaniose Visceral (LV) no Novo Mundo, com áreas endêmicas que se estendem do Sul dos EUA ao norte da Argentina. As leishmanioses assumem grande importância em saúde pública por sua natureza zoonótica e, atualmente, vêm apresentando crescente disseminação nas diferentes regiões do Brasil, em especial no Estado de São Paulo. No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar (LT) tem sido assinalada em praticamente todos os Estados e vem crescendo progressivamente nos últimos 20 anos, ocorrendo surtos em todas as regiões do país. Apesar dos registros de ocorrências de infecções esporádicas de leishmaniose felina (LF), são necessários mais estudos para se considerar os felinos como reservatórios importantes nas leishmanioses. Estes animais quase não apresentam sinais clínicos, mesmo estando infectados, constituindo-se em importantes fontes de infecção para outros animais domésticos, o homem ou vice-versa. Coletaram-se amostras de sangue de 50 gatos procedentes do Bosque Municipal de Marília, área de grande concentração de transeuntes e já detectado flebotomíneos no local. Armadilhas do tipo CDC luminosas foram instaladas em dez diferentes pontos do bosque, nos meses de julho a dezembro/2012, tendo-se capturado um total de quatro espécies de Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) sendo dois machos e duas fêmeas e quatro espécies fêmeas do gênero Brumptomyia spp. A análise parasitológica do conteúdo intestinal das duas fêmeas da espécie Lu. longipalpis foi negativa. Realizou-se a prova de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum, tendo-se quatro (8%) animais reagentes. Todos os animais foram não reagentes à prova de RIFI para Leishmania(Viannia) braziliensis. Em relação ao teste de ELISA indireto para Leishmania infantum, 42% dos animais (21/50) foram reagentes. Para L. braziliensis, 18% dos animais (9/50) foram reagentes... / Leishmania infantum (syn. L. chagasi) is the causative agent of visceral leishmaniasis (VL) in the New World, with endemic areas that spreads from the south of United States until the north of Argentina. Leishmaniasis represents a great importance in public health due to the zoonotic nature, and currently have been presented a great dissemination in different regions of Brazil, specially in Sao Paulo State. In Brazil, cutaneous leishmaniasis has been occurred in almost all States, and have been growing up progressively in the last twenty years, occurring outbreaks in all regions of the country. Even though the sporadic reports of feline leishmaniasis, more studies are necessary to consider cats as the great importance as reservoirs in the feline leishmaniasis. These animals almost do not represent any clinical symptoms, even infected, representing important source of infection to another domestic animals, humans and vice-versa. Blood samples were collected from fifty cats habiting the Municipal Grove from Marília-SP, an area with high number of visitors and already detected sandflies. Traps CDC were installed in ten different points of the Municipal Grove from Marília-SP, since July to December/2012. Four specimens of Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) were captured (two males and two females) and four females specimens of the Brumptomyia genre. The parasitological analysis of gut contents of two females of Lu. longipalpis was negative. The Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) for Leishmania infantum was performed, resulting in four (8%) reagent animals. All cats were non-reagent to Leishmania braziliensis by IFAT. Regarding to Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test for Leishmania infantum, 42% of the animals (21/50) were reagent. For L. braziliensis, 18% of the animals (9/50) were reagent to ELISA test. The Polimerase Chain Reaction (PCR) for Leishmania infantum and for Leishmania braziliensis from ...

Orientador: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Coorientador: David Luciano Rosalen / Banca: Karina Paes Bürger / Banca: Caris Maroni Nunes / Resumo: Dentre as zoonoses que têm a participação de cães na sua transmissão, merecem destaque a leptospirose e a leishmaniose visceral, presentes em todas as regiões do Brasil. No Estado de São Paulo a leptospirose é endêmica e a ocorrência de leishmaniose visceral vem apresentando aumento significativo. No Distrito de Córrego Rico, Jaboticabal/SP, é grande o número de cães soltos nas ruas e de roedores que invadem as residências. Há relato, na literatura, de um cão reagente à leishmaniose visceral. Recentemente, em 2011, um jovem veio a óbito por leptospirose. Diante desses fatos, o presente estudo teve como objetivo realizar uma avaliação sorológica das duas enfermidades em cães de Córrego Rico e identificar fatores predisponentes ou relacionados à sua ocorrência. Para tanto, as residências que abrigam cães foram visitadas, aplicou-se um questionário semi-estruturado para levantamento de informações que permitissem avaliar as condições gerais de posse e saúde de cada animal, com entrega de panfleto educativo. Amostras de sangue foram obtidas de 274 cães para serem submetidas à prova de soroaglutinação microscópica (SAM) frente a 24 sorovares de Leptospira spp. Vinte e duas amostras mostraram-se reagentes com títulos 1:100, sendo os sorovar butembo, seguido pelo autumnalis, bratislava e pyrogenes os mais frequentemente encontrados. As mesmas amostras passaram por avaliação de anticorpos contra Leishmania chagasi, por meio das técnicas de imunofluorescência indireta (RIFI) e ensaio imunoenzimático indireto (ELISA). Pela imunofluorescência, duas amostras mostraram-se positivas. Já no teste ELISA, todas as amostras testadas foram negativas. A Análise Multivariada permitiu identificar fatores locais que podem estar relacionados com a ocorrência de leptospirose. Embora não tenha sido detectado... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Among the zoonosis transmitted by dogs in Brasil, leptospirosis and visceral leishmaniosis can be found throughout the country. In São Paulo state, leptospirosis is endemic and the occurrence of visceral leishmaniosis is significantly increasing. In the district of Córrego Rico, Jaboticabal/SP, there is a large number of free roaming dogs and homes that are invaded by rodents, and according to the literature, dogs have also tested positive for leishmaniosis in that region. Recently, in 2011, a fatal human case of leptospirosis was reported. This study was conducted to evaluate the serological response of both diseases in the above mentioned district and to identify predisposing factors that could be related to their occurrence. The households with dogs were visited and a questionnaire was filled to compile the information and evaluate the general conditions of dog health and ownership. An educational folder was also distributed to each participant. Blood samples of 274 dogs were submitted to microscopic serum agglutination (SAM) to 24 serotypes de Leptospira spp. Twenty tow samples were positive with titers 1:100. The serotypes butembo, followed by autumnalis, bratislava and pyrogenes were the most commonly found. The blood samples were also evaluated against Leishmania chagasi antibodies using indirect immunoflourescence (IFI) and ELISA. Two samples were positive based on IFI and all tested negative by the ELISA. The multivariate statistical analysis was able to identified local factors related to the incidence of leptospirosis. There were no findings on positive seroconversion of leishmaniosis and the reagents to leptospirosis were 8,0%. However, this study clearly shows the importance of the population control of dogs and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Antônio Carlos Alessi / Banca: Rosângela Zacarias Machado / Banca: Wagner Luiz Tafuri / Banca: Karen Regina Lemos / Resumo: Na Leishmaniose Visceral Canina (LVC) a resposta imune órgãoespecífica pode variar de acordo com o órgão afetado, favorecendo ou não a multiplicação do parasito Leishmania (L.) chagasi. O objetivo deste estudo foi analisar, por meio, da técnica de imuno-histoquímica, o fígado e o baço de cães com Leishmaniose Visceral (LV), considerando a carga parasitária, a densidade de células Natural Killer (NK), de macrófagos e de linfócitos, bem como, células em apoptose, de células expressando moléculas de MHC-II e as citocinas TGF-b e TNF- a. Estes resultados foram comparados com os diferentes estágios da doença. Utilizou-se 71 cães naturalmente infectados de área endêmica para LV, classificados nos grupos sintomático (S), assintomático (A) e oligossintomático (O). Um grupo controle foi composto por 10 cães de área não endêmica para LVC. As células positivas para os anticorpos CD56, caspase 3 clivada, MHC-II, TGF- , TNF- , MAC387, CD3 e para a carga parasitária (soro hiperimune de cão positivo para LVC) foram submetidas a testes não paramétricos para a comparação entre os grupos. O baço foi o órgão que apresentou a maior carga parasitária. A apoptose de linfócitos foi maior nos cães sintomáticos quando comparados ao grupo controle. A intensidade de inflamação foi elevada nos cães com doença avançada (grupo S), caracterizada pela formação de granulomas difusos contendo parasitos. O fígado mostrou menor carga parasitária, um perfil celular dos granulomas rico em linfócitos. A densidade de células NK foi baixa no fígado e baço, bem como a imunodetecção das citocinas TGF- e TNF- . A expressão de MHC-II foi maior no baço de cães do grupo S. Portanto, pode-se sugerir que existe um padrão de resposta diferenciado no baço e fígado, porém outra metodologia deveria ser utilizada para quantificar de forma mais precisa as citocinas TGF- e TNF- nestes órgãos / Abstract: In Canine Visceral Leishmaniasis (LVC), the immune response to organ-specific can vary with the affected organ, thus favoring or hindering the multiplication of the parasiteLeishmania (L.) chagasi. . The aim of this study was to analyze by immunohistochemistry, the liver and spleen of dogs with visceral leishmaniasis (VL), considering the parasitic load, the density of Natural Killer cells (NK), macrophages and lymphocytes, as well apoptosis cells, cells expressing molecules of MHC-II and the cytokines TGF- and TNF- . These results were compared with different stages of disease. We used 71 naturally infected dogs from an endemic area for VL, classifieds in the symptomatic (S), asymptomatic (A) and oligosymptomatic (O) groups. A control group consisted of 10 dogs from nonendemic area for LVC.The positive cells for CD56 antibody, cleaved caspase 3, MHC-II, TGF- , TNF- , MAC387, CD3 and parasite load (serum hyperimmune dog seropositive for VL) were subjected to nonparametric tests for comparison between groups. The spleen was the organ with the highest parasite load. The apoptosis of lymphocytes was higher in symptomatic dogs when compared to the control group. The intensity of inflammation was higher in dogs with advanced disease (group S), characterized by the formation of granulomas containing diffuse parasites. The liver showed lowest parasite load, a profile of cell granulomas rich in lymphocytes The density of NK cells was low in the liver and spleen and few cells were positive for cytokines TGF- and TNF- . Expression of MHC-II was higher in the spleen of dogs in Group S. Therefore, one may suggest that there is a differential pattern of response in the spleen and liver, but other methods should be used to quantify more accurately the cytokines TGF- and TNF- in these organs / Doutor

Orientador : Paulo Inácio da Costa / Coorientador: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Andrea Soares da Costa Fuentes / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Silmara Marques Allegretti / Banca: Marco Tulio Alves da Silva / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é a forma clínica mais severa da doença e pode ser fatal se não tratada. Um diagnóstico específico e acurado é requerido para a identificação de cães infectados a fim de promover um melhor controle epidemiológico e tratamento adequado. O desenvolvimento de um teste diagnóstico mais específico é importante, especialmente no Brasil onde os animais infectados são eutanaziados. Diversos pesquisadores discordam quanto à especificidade dos testes atualmente utilizados. Este trabalho reporta o isolamento, expressão e teste de dois genes específicos de Leishmania infantun (syn = chagasi), como potencial epítopo para desenvolvimento de um novo método diagnóstico e vacina. Os genes denominados Lc 24 e Lc 36 foram amplificados com primers específicos, clonados e expressos em E. coli. As proteínas recombinantes rLc 24 e rLc 36 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de GST. Diferentes concentrações das proteínas foram testadas por Dot Blot usando um pool de soros de cães infectados com leishmaniose visceral e um pool de soro de cães não infectados. Concentrações das proteínas a 0,1 e 0,01μg/mL foram detectadas no ensaio, mostrando que as proteínas rLc 24 e rLc 36 são imunorreativas e apresentam potencial para serem usadas em novos testes diagnósticos e desenvolvimento de vacina. / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is the most severe clinical form of the disease and can be fatal if untreated. A specific and accurate diagnosis is required for the identification of infected dogs to provide better epidemiological control and earlier treatment. The more accurate diagnosis test is important especially in Brazil where infected animals are euthanized. Discordance among investigators regarding the accuracy of the tests currently employed for this purpose. This works reports the isolation, expression and test of two specific genes of Leishmania infantun (syn = chagasi), as a potential epitope for the development of a new diagnosis method and vaccine. The partial sequence of the genes rLc 24 and rLc36 was amplified with specific primers, cloned, and expressed in E. coli. The rLc 24 and rLc36 recombinant proteins was purified by GST affinity chromatography. Different concentrations of proteins were tested by Dot blot using a serum pool from infected dogs with leishmaniasis and a serum pool from dogs not infected. The protein concentrations of 0,1 and 0,01μg/mL were detected in the dot blot tests, showing that the protein rLc36 is immunoreaction and has potential to used in new diagnosis tests and development of vaccine. / Doutor

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Resumo: PD-1 ligado a PD-L1 ou PD-L2, desencadeia sinais incapacitantes às células T, podendo estar envolvidos na supressão das respostas imunes na LVC. Investigamos a expressão de PD-1 e seus ligantes no baço na LVC, e sua correlação com a carga parasitária. Para confirmar o seu papel regulador na leishmaniose, estes receptores foram avaliados após infecção in vitro por L. infantum. Em cães infectados, foi avaliado o bloqueio destes receptores na produção de citocinas e seus efeitos no sobrenadante da cultura, de linfoproliferação com antígeno solúvel (AtgS) de L. infantum. Foram selecionados 23 cães saudáveis e 54 com LV. PD-1 e seus ligantes foram determinados por imunohistoquímica em tecidos esplênicos. A carga parasitária de cães infectados foi avaliada por PCR em tempo real. As citocinas nos sobrenadantes de cultura foram determinados por ELISA de captura e o NO por Griess. A Linfoproliferação das células do linfonodo e expressão de PD-1 e seus ligantes após infecção in vitro por L. infantum foram avaliadas por citometria de fluxo. Observou-se que a infecção por L. infantum, aumenta a expressão de PD1 e seus ligantes. Uma correlação positiva foi observada entre a expressão de PD-1 e PD-L1 em linfócitos B e o aumento da carga parasitária. O bloqueio destes receptores restaura a proliferação de linfócitos, aumenta a produção de NO e diminui a IL-4 e IL-10. L. infantum modula a expressão de PD-1 e seus ligantes na LVC, suprimi a linfoproliferação, alterando a produção de citocinas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: PD-1 when bound to PD-L1 or PD-L2, triggers signals disabling T cells, and they may be involved in the suppression of cellular immune responses in CVL. We investigated the expression of PD-1 and its ligands in spleen in CVL, and its correlation with parasite burden in this tissue, to confirm its regulatory role in leishmaniasis. These receptors were evaluated after in vitro infection by L. infantum. In infected dogs, we evaluated the blocking of these receptors in the production of cytokines in the effects of supernatant of cultured cells, and antigen specific lymphoproliferation. We selected 23 healthy dogs and 54 with VL. PD-1 and its ligands were determined by immunohistochemistry in splenic tissues. Parasitic load of infected dogs was evaluated by RT-PCR. Cytokines in culture supernatants were determined by capture ELISA and NO by Griess. Lymphoproliferation lymph nodes and expression of PD-1 and its ligand after in vitro infection by L. infantum was evaluated by flow cytometry. We observed that L. infantum infection increases expression of PD-1 and its ligands. A positive correlation was observed between the expression of PD-1 and PD-L1 B lymphocytes and an increase in parasite load. Blockade these receptors restores lymphocyte proliferation, increases the production of NO and decreases IL-4 and IL-10. In conclusion, L. infantum modulates expression of PD-1 and its ligands in CVL, suppressing lymphoproliferative response and altering cytokine production, which in turn ca... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Isabel Kinney Ferreira de Miranda Santos / Resumo: A leishmaniose visceral é uma zoonose, considerada como uma entre seis doenças tropicais mais importantes nos países em desenvolvimento. O agente etiológico da enfermidade no Brasil, a Leishmania chagasi, é transmitida pela picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, que adquire o parasito ao realizar o hematofagismo em animais infectados. No ambiente doméstico, o cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose visceral e, em consequência disso, é também o principal alvo das campanhas de controle da forma humana da doença. Neste trabalho foi avaliado o potencial diagnóstico para a leishmaniose visceral canina de um antígeno recombinante, produzido a partir do gene de uma proteína, isolado em L. chagasi, amostra Jaboticabal. O gene isolado apresenta similaridade com a família A2 de L. chagasi e foi expresso utilizando o vetor pET28a em E. coli. A proteína de 11 KDa expressa, foi avaliada pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). O ELISA com o antígeno recombinante His6_A2 detectou anticorpos anti-A2 em 52% dos cães infectados com L. chagasi. Enquanto que, 67% dos soros de animais vacinados e 65% dos animais de áreas-não endêmicas, foram negativos pelo ELISA_A2. Os testes de Western-blotting e Dot-ELISA realizado com soros de camundongos inoculados com essa proteína His_A2 demonstrou resultados positivos de antigenicidade e imunogenicidade. Todos os sequenciamentos de DNA mostraram homologia com genes da família A2. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a zoonosis and one of six most important tropical diseases in developing countries. The causative agent of the disease in Brazil, Leishmania chagasi, is transmitted by the bite of the sandfly Lutzomyia longipalpis, who acquired the parasite biting infected animals. In domestic environment, the dog is considered the main reservoir of visceral leishmaniasis, and in consequence it is also the main target of campaigns to control the disease in human beings. This study evaluated the potential of a recombinant antigen produced from the A2 gene Jaboticabal strain L. chagasi for diagnosis of canine visceral leishmaniasis (LVC). The isolated gene showed similarity with L. chagasi family A2 gene, and was expressed using pET28a expression vector in E. coli. The 11-kDa protein expressed was evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using known positive and negative sera, previously tested by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). The His-A2 recombinantantigen detected anti-A2 antibodies in 52% of L. chagasi infected dogs. Seventy-seven percent of vaccinated dogs and 65% of dogs from non-endemic areas were both negative by A2-ELISA. The antigenicity and immunogenicity of the expressed protein was confirmed by Western blot and Dot-ELISA assays, performed using sera from mice inoculated with this protein. / Mestre

Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Lucilena Delazari dos Santos / Banca: Ricardo de Oliveira / Resumo: A leishmaniose visceral americana, causada pelo parasita intracelular Leishmania (L) infantum chagasi, é transmitida pela picada do mosquito Lutzomyia longipalpis. O tratamento é realizado à base de quimioterápicos clássicos, que desenvolvem importantes efeitos colaterais no hospedeiro. A prospecção de novas drogas é o grande desafio mundial do momento. Assim, este estudo realizado in vitro teve por objetivos avaliar o efeito anti-leishmania de frações do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi. Do veneno total foram extraídas e purificadas duas frações denominadas respectivamente de fosfolipase A2 (PLA2) e peptídica. Além disso, formas promastigotas e macrófagos infectados por amastigotas foram expostos a uma diluição seriada de PLA2 e da fração peptídica em intervalos que variaram entre 1,5625 μg/mL e 200 μg/mL. Ambas demonstraram atividade contra as formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi variando de acordo com as doses testadas e o tempo de incubação. O ensaio MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) das frações contra as formas promastigotas mostrou IC50 de 52,07 μg /mL para a PLA2, e uma IC50 de 16,98 μg/mL para a fração peptídica. O ensaio MTT para se avaliar a citotoxicidade nos macrófagos peritoneais mostrou uma IC50 de 98 μg/mL para PLA2 e uma IC50 16,98 μg/mL para a fração peptídica. Nos macrófagos peritoneais infectados pelas formas amastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi a PLA2 estimulou o crescimento dos parasitas; em doses mais elevadas foi capaz de controlar em 23% o seu crescimento. A fração peptídica controlou 43% do crescimento do parasita intracelular na dose de 16,98 μg/mL., mostrando-se tóxica acima desta doe para os macrófagos. Ambas as frações estimularam a produção de H2O2 pelos macrófagos, mas apenas PLA2 foi capaz de estimular a produção ... / Abstract: American visceral leishmaniasis is caused by the intracellular parasite Leishmania ( L ) infantum chagasi , and transmitted by sand fly Lutzomyia longipalpis. Treatment is based on classical chemotherapeutics with significant side effects and the search for new drugs is the greatest global challenge. Thus , this in vitro study aimed to evaluate the anti - leishmanicidal effect of Crotalus durissus terrificus venom's fractions on promastigotes and amastigotes of Leishmania (L) infantum chagasi. The whole venom were purified two fractions called respectively phospholipase A2 (PLA2) and peptide. Furthermore, promastigotes and macrophage infected per amastigotes were exposed to serial dilutions of the peptide fraction and PLA2 at intervals varying between 1.5625 μg/mL and 200 μg/mL. Both showed activity against promastigotes and varies according to the tested doses and the time of incubation. The MTT assay (3-(4,5-Dimethyl-1,3- thiazol-2-yl)-3,5-diphenyl-2H-tetrazol-3-ium bromide) against promastigotes showed IC50 of 52.07 μg/mL to PLA2, and 16.98 μg/mL for peptide venom's fraction. The MTT assay to evaluate the cytotoxicity in peritoneal macrophages showed an IC50 of 98 μg/mL for PLA2 and 16.98 μg/ml for peptide. In peritoneal macrophages infected by Leishmania (L) infantum chagasi amastigotes the PLA2 stimulated growth of parasites, at higher doses was able to control 23 % growth. The peptide fraction controlled 43 % of the intracellular parasite growth at a dose of 16.98 μg/mL, showing up this dose toxic to macrophages . Both fractions stimulated H2O2 production by macrophages but only PLA2 was able to stimulate NO production . The results encourage further studies to describe the metabolic pathways involved in cell death , as well as the prospect of molecules with antiparasitic activity present in the peptide fraction of Crotalus durissus terrificus / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca:Juliana Regina Peiró / Banca: Aparecida de Fátima Michelin / Resumo: A Leishmaniose visceral (LV) no Brasil representa um grave problema de saúde pública; portanto, é importante estudar novas alternativas para o tratamento de cães infectados. O imunomodulador agregado de magnésio-amônio fosfolinoleato-palmitoleato anidrido proteína (P-MAPA) melhora a imunocompetência quando o sistema imunológico está comprometido, mas sua dependência de receptores Toll-like (TLRs) e os mecanismos envolvidos na resposta imune ainda não estão claros. Estudou-se a ação in vitro de P-MAPA sobre a expressão de TLR2 e TLR4, espécies reativas de oxigénio (ROS), óxido nítrico (NO) e p38 ativada por mitógeno proteína quinase (p38MAPK) e fosforilação de IKK em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e macrófagos de cães saudáveis e infectados. O PBMC ou macrófagos foram isolados e cultivados com diferentes concentrações de P-MAPA (20,100 e 200 μg/mL) em uma atmosfera húmida, a 37°C com 5% de CO2. A observação revelou que nos macrófagos de cães infectados com Leishmania sp. mostraram uma diminuição em TLR2 em comparação com cães saudáveis e em indução com P-MAPA. ROS foram aumentados em PBMC de cães infectados com Leishmania sp. em comparação com cães saudáveis e P-MAPA melhorou a produção de ROS. A produção de NO foi aumentada no sobrenadante da cultura a partir de macrófagos estimulados por P-MAPA em ambos os grupos de cães saudáveis e infectados com Leishmania sp. O tratamento de macrófagos de cães saudáveis com imunomodulador P-MAPA induziu p38 MAPK e fosforilação de IKK, sugerindo a transdução de sinal por esta via. Estas descobertas sugerem que a P-MAPA tem potencial como uma droga terapêutica no tratamento de leishmaniose visceral canina / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) in Brazil represents a serious public health problem; therefore, it is important to study new alternatives to treat infected dogs. The immunomodulator protein aggregate magnesium-ammonium phospholinoleate-palmitoleate anhydride (P-MAPA) improves immunocompetence when the immune system is impaired, but its dependence on Toll-like receptors (TLRs) and the mechanisms involved in the immune response remain unclear. The in vitro action of P-MAPA on the expression of TLR2 and TLR4, reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO) and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) and IKK phosphorylation were studied in mononuclear cells from peripheral blood and macrophages from healthy and Leishmania-infected dogs. The PBMC or macrophages were isolated and cultured with different concentrations of P-MAPA (20,100 and 200 μg/mL) in a humid environment at 37°C with 5% CO2. Observation revealed that Leishmania-infected dogs showed a decrease in TLR2 in macrophages compared with healthy dogs and in induction with P-MAPA. ROS were increased in PBMCs from Leishmania sp.-infected dogs compared with healthy dogs and P-MAPA improved ROS production. NO production was increased in culture supernatant from macrophages stimulated by P-MAPA in both healthy and Leishmania-infected dogs. Treatment of macrophages from healthy dogs with immunomodulatory P-MAPA induced p38 MAPK and IKK phosphorylation, suggesting signal transduction by this pathway. These findings suggest that P-MAPA has potential as a therapeutic drug in the treatment of canine visceral leishmaniasis / Mestre

Orientador: Cáris Maroni Nunes / Banca: Francisco Chiaravalloti Neto / Banca: Márcia Dalastra Laurenti / Banca: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca: Mary Marcondes / Resumo: Leishmaniose visceral é uma doença grave que tem no cão seu principal reservatório doméstico. Algumas lacunas no conhecimento dificultam ainda mais o controle da doença. Com relação ao reservatório canino, a possibilidade de se estabelecer indicadores de infectividade ao vetor, como a carga parasitária, poderia resultar em melhor caracterização de seu papel como fonte de infecção na cadeia epidemiológica. Foram realizados xenodiagnósticos em cães acometidos de leishmaniose visceral, com subsequente avaliação da carga parasitária no hospedeiro e no vetor, utilizando-se flebotomíneos da área urbana de Araçatuba,SP. Após cinco dias do repasto, as fêmeas foram dissecadas e submetidas à avaliação parasitológica por meio da demonstração direta do parasito (DDP) e da contagem em câmara de Neubauer (NC). Fragmento de DNA de cinetoplasto (kDNA) de Leishmania spp. foi amplificado por meio da PCR convencional e em tempo real (qPCR), para quantificação da carga parasitária. Os cães foram avaliados para a presença de sinais clínicos e amostras de sangue, swab conjuntival e de pele foram colhidas e processadas por PCR e qPCR. Os resultados dos métodos diagnósticos utilizados foram correlacionados em modelo de regressão linear e a positividade de felbotomíneos foi corrigida pela positividade natural. Tanto a PCR convencional quanto a qPCR mostraram-se adequadas para a avaliação da infectividade canina. Houve correlação entre a carga de parasitos presentes na pele e no swab conjuntival do cão bem como com a cargas de parasitos dos flebotomíneos. Alguns sinais clínicos dos cães, pela análise de componentes principais (PCA), estiveram relacionados com a maior taxa de infecção dos vetores. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a severe disease that has the dog as its main domestic reservoir. Gaps in the knowledge difficult even more the control of this disease. Regarding the canine reservoir, the possibility of establishing infectivity indicators, like the dogs parasite load, could result in better characterization of its role as source of infection in the transmission chain. Xenodiagnosis in dogs with visceral leishmaniasis were performed with subsequent parasite load evaluation of the host and the vectors, using sandflies captured in the urban area of Araçatuba,SP. After five days, the female sand flies were dissected, subjected to parasitological evaluation by the direct demonstration of the parasite (DDP) and by counting in a Neubauer chamber (NC). A kinetoplast DNA fragment of Leishmania spp. was amplified by conventional PCR and by qPCR to check the presence and quantification of Leishmania kDNA. Dogs were assessed for clinical signs and blood, skin and conjunctival swab samples were taken and tested for parasite load. The diagnostic methods tested (NC, PCR and qPCR) were correlated by linear regression and positivity results were corrected by the natural infection rate. Conventional PCR and qPCR proved to be appropriate for evaluating canine infectivity. There was a correlation between the parasite load present in the dog' skin and the conjunctive swab, as well as with the sandflies parasite loads. Principal component analysis revealed that some of the clinical signs shown by the dogs were related to a highest sandfly infection rate. / Doutor

Orientador: Mary Marcondes / Banca: Paulo César Ciarlini / Banca: Raimundo Souza Lopes / Resumo: A leishmaniose visceral é uma zoonose causada por um protozoário do gênero Leishmania, cujo agente etiológico no Brasil é a Leishmania chagasi. O primeiro caso canino autóctone no Estado de São Paulo, Brasil, foi identificado em 1998 no município de Araçatuba. Desde então a doença vem se espalhando por todo o Estado. O objetivo do presente estudo foi determinar a freqüência de ocorrência de anticorpos anti-Leishmania chagasi em amostras de soro de 584 cães de São José do Rio Preto, São Paulo, área não endêmica para a doença e que dista 160 Km de Araçatuba. Asoroprevalência foi de 0,86% por ELISA e 0,17% por imunocromatografia. Areação de imunofluorescência indireta foi utilizada em 138 amostras eidentificou 1,45% de soropositividade. O ELISA identificou cinco cães positivos,a RIFI dois e um cão foi identificado pela imunocromatografia. Um dos cãespositivo pela RIFI havia sido vacinado para leishmaniose visceral. Dois cãesque foram considerados positivos pelo ELISA indireto foram testados por PCRpara detecção da presença de Leishmania chagasi, mas os resultados foram negativos, não confirmando a doença. Somente um cão foi soropositivo em todos os métodos. Ele apresentava sinais clínicos inespecíficos e foi adquirido pelo proprietário em uma área endêmica para a doença. O diagnóstico não pôde ser confirmado por exame parasitológico direto ou PCR porque o cão morreu antes dos resultados dos exames sorológicos. Os resultados obtidos na população do presente estudo permitem concluir que São José do Rio Preto deve ser, ainda, área não endêmica para leishmaniose visceral canina. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a zoonosis caused by a protozoa of the genus Leishmania, whose etiological agent in Brazil is Leishmania chagasi. The first canine autochthonous case of the disease in the São Paulo State, Brazil, was identified in 1998 in Araçatuba. Since then, the disease has spread to great part of the State. The aim of the present study was to determine the frequency of occurrence of anti-Leishmania chagasi antibodies in serum samples of 584 dogs from São José do Rio Preto, São Paulo, a non endemic area for the disease, 160km far from Araçatuba. Seroprevalence was 0,86% by ELISA and 0,17% by imunochromatography. IFAT, used to test 138 samples, identified 1,45% of seropositivity. ELISA identified five positive dogs, IFAT two, and immunochromatography one. One of the dogs that were considered positive by IFAT has been vaccinated for visceral leishmaniasis. Two dogs that were considered positive by indirect ELISA were tested by PCR for the presence of leishmania chagasi, but the results were negative, not confirming the disease. Only one dog was seropositive by all methods. He presented inespecific clinical signs and was acquired by his owner in an endemic area for the disease. The diagnoses could not be confirmed by direct parasitological test or PCR, because the dog has died before serologic results. The population results achieved in this study allow us to conclude that São José do Rio Preto city still must be a canine visceral leishmaniasis non-endemic area. / Mestre