Orientador: Hélio Langoni / Coorientador: Rodrigo Costa da Silva / Banca: Simone Baldini Lucheis / Banca: Cassiano Victoria / Banca: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como leishmaniose visceral americana (LVA) ou calazar é uma antropozoonose, causada pelo protozoário flagelado do gênero Leishmania, com ampla distribuição mundial. No Brasil, o agente responsável pela doença é a Leishmania (Leishmania) chagasi, transmitida pela picada da fêmea do flebotomínio da espécie Lutzomyia longipalpis, e o principal reservatório doméstico é o cão. É uma doença sistêmica grave, de curso lento e crônico, de diagnóstico complexo. Entre as estratégias de controle da LVC está o inquérito sorológico canino, com a eliminação dos cães reagentes, sendo que diferentes técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico desta enfermidade. Muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a respeito dos testes disponíveis para o seu diagnóstico, nenhum apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivos determinar a prevalência de anticorpos para L. chagasi, em 164 cães capturados pelo CCZ de Bauru, SP, área epidêmica para LVC, comparar as técnicas de imunofluorescência indireta, ensaio imunoenzimático (ELISA) e aglutinação direta (DAT); determinar a carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real, a partir da punção de linfonodo poplíteo e de medula óssea; e identificar possíveis variantes genotípicas de Leishmania. spp a partir do sequenciamento e genotipagem, a fim de contribuir para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, a partir da análise obtida nos diferentes testes, bem como pela avaliação dos sintomas apresentados pelos animais. A sensibilidade apresentada pelas provas DAT e ELISA tendo a RIFI como padrão-ouro foi respectivamente, de 94% e 87%, enquanto a especificidade foi de 28% e 93%. Do total de amostras de sangue, linfonodo e medula óssea submetidas a PCR gênero e espécie- específica, 20 foram positivas somente para gênero, e estas foram sequenciadas ... / Abstract: The canine visceral leishmaniasis (LCV), known as American visceral leishmaniasis (LVA) or kala-azar is a anthropozoonosis caused by the flagellate protozoan of the genus Leishmania, with worldwide distribution. In Brazil, the agent responsible for the disease is Leishmania (Leishmania) chagasi, transmitted by the bite of the female of the species Lutzomyia longipalpis, and the main reservoir is the domestic dog. It is a severe systemic disease, with chronic and slow course and complex diagnostic. Among the strategies for control of LVC are the canine serological survey, with the elimination of reagents dogs and different techniques can be used to diagnose this disease. Many advances have occurred in recent years, but about the tests available for diagnosis, none had 100% sensitivity and specificity. In this context, this project aimed to determine the prevalence of antibodies to L. chagasi in 164 dogs captured by the CCZ, Bauru, SP, epidemic area for LVC, to compare the techniques of indirect immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA) and direct agglutination (DAT) to determine the parasite burden by PCR in real time from peripheral blood puncture, popliteal lymph node and bone marrow of animals serologically positive, and identify potential genotypic variants of Leishmania. spp. from the sequencing in order to contribute to the diagnosis of canine visceral leishmaniasis, from the analysis obtained for the different tests as well as for assessment of symptoms presented by the animals. The sensitivity shown by DAT and ELISA with IFA as the gold standard were respectively, 94% and 87%, while specificity was 28% and 93%. Of the total sample of blood, lymph node and bone marrow subjected to PCR genus and species-specific, 20 were positive only for gender, and these were sequenced and characterized, yielding cleavage bands profile and common sequences belonging to the species L.donovani complex / Mestre

Resumo:O estresse oxidativo ocorre quando há desequilíbrio entre as defesas antioxidantes e os agentes oxidantes no organismo. Considerando que cães com leishmaniose visceral podem desenvolver uremia, o que afeta o metabolismo oxidativo e a apoptose dos neutrófilos, propusemos investigar a hipótese de que o estresse oxidativo, a alteração do metabolismo oxidativo e da apoptose dos neutrófilos de cães variam com o estágio da doença e que a instalação do quadro de uremia contribui para esta variação. Para tal, foram avaliados marcadores plasmáticos de estresse oxidativo (capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica, glutationa, ácido úrico, bilirrubina e albumina), a produção de superóxido (método de redução do tetrazólio nitroazul e citometria de fluxo com a sonda hidroetidina), viabilidade e taxa de apoptose (método morfológico e citometria de fluxo utilizando o sistema anexina V-PE) de neutrófilos de cães com leishmaniose classificados de acordo com o LeishVet Consensus em estágio moderado da doença, estágio muito severo quando a uremia está instalada e de cães com uremia sem leishmaniose, comparando-os a cães saudáveis. A leishmaniose, independentemente do estágio, e a uremia causam estresse oxidativo levando à redução da capacidade antioxidante total, que pode estar relacionado à maior produção de superóxido e maior apoptose induzida observada nesses grupos. Espontaneamente, neutrófilos de cães com leishmaniose muito severa e com uremia possuem menor viabilidade, maior apoptose e maior peroxidação lipídica, sugerindo que a uremia seja a causa de tais alterações. Conclui-se que ocorre estresse oxidativo independente do estágio da leishmaniose, entretanto a condição urêmica contribui para diminuição da viabilidade dos neutrófilos em cães no estágio final da doença. As alterações do metabolismo oxidativo dos neutrófilos ocorrem concomitante ao / Abstract:Oxidative stress occurs due to an imbalance between oxidants and antioxidant defenses. Considering that dogs with leishmaniasis may develop uremia, which affects the oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils, we proposed to investigate the hypothesis that oxidative stress, alteration of oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils in dogs varies according to stage of leishmaniasis and that uremia, commonly occurs in late stages of disease, would contribute to such variations. To this, we evaluated plasma markers of oxidative stress (total antioxidant capacity, lipid peroxidation, glutathione, uric acid, bilirubin and albumin), superoxide production (method of nitroblue tetrazolium reduction and flow cytometry with the probe hydroethidine), and viability and apoptosis rate (morphological method and flow cytometry using annexin V-PE system) on neutrophils from dogs with leishmaniasis classified according to the LeishVet Consensus in moderate stage of the disease, very severe stage when uremia is installed and dogs with uremia negative for leishmaniasis, comparing them to healthy dogs. Leishmaniasis regardless of stage and uremia cause oxidative stress with reduced total antioxidant capacity, which may be related to greater induced production of superoxide and stimulated apoptosis observed in these groups. While spontaneously, neutrophils of dogs in very severe stage and with uremia had lower viability, increased apoptosis and higher lipid peroxidation, suggesting that uremia is the cause of such changes. Can be concluded that the intensity of oxidative stress does not vary with the stage of leishmaniasis, however uremic condition contributes to reduce the viability of neutrophils in late-stage dogs. Changes of neutrophil oxidative metabolism occur concomitant with oxidative stress and increased neutrophil apoptosis in both leishmaniasis and in uremia alone / Orientador: Paulo César Ciarlini / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Mary Marcondes / Mestre

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Coorientador: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Paulo Ricardo Dell'Armelina Rocha / Banca: Geórgia Modé Magalhães / Banca: Marcos Rogério André / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Resumo: A resposta imune de cães com Leishmaniose Visceral (LV) pode apresentar um perfil variado de citocinas, com predominância de citocinas pró-inflamatórias (resistência) ou antiinflamatórias (susceptibilidade), dificultando ou favorecendo a multiplicação do protozoário Leishmania infantum chagasi nos tecidos do hospedeiro. Nesses animais existe um desequilíbrio entre os perfis das respostas imunes Th1 e Th2. A avaliação da resposta imunológica destes cães com diferentes manifestações clínicas de LV é de fundamental importância para a compreensão da patogenia da doença. O objetivo geral deste estudo foi avaliar o perfil de citocinas Th1, Th2 e regulatórias, fatores de transcrição (T-bet e GATA-3) e carga parasitária em cães com LV e controle, no fígado, baço e linfonodos poplíteo e pré-escapular, para verificar possíveis diferenças na resposta imune compartimentalizada. Neste estudo foram utilizados 28 cães de área endêmica para a LV e cinco cães de área não endêmica (controle). Os cães infectados foram separados em grupos sintomático (n=16) e assintomático (n=12). A quantificação da expressão dos genes das citocinas (IFN- γ, TGF-β, IL-10, IL-4, IL-12 e MIF), da carga parasitária tecidual e dos fatores de transcrição foi feita por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real, em amostras de tecidos dos diferentes órgãos. O baço e os linfonodos poplíteo e pré-escapular foram os órgãos que apresentaram maior número de cópias do DNA da Leishmania infantum chagasi. Os resultados da expressão dos genes de citocinas mostraram que houve um aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IFN-γ, MIF, IL-12), anti-inflamatórias (IL-4) e regulatórias (IL-10, TGF-β) nos grupos de cães infectados, algumas com diferenças significativas do grupo controle (P<0,05). Enquanto o fator de transcrição T-bet teve níveis mais elevados nos animais assintomáticos. Em conclusão ... / Abstract: The immune response of dogs with visceral leishmaniasis (VL) may present a varied profile of cytokines, predominantly proinflammatory (resistance) or anti-inflammatory (susceptibility) cytokines, hindering or favoring the multiplication of the protozoan Leishmania infantum chagasi in the host tissues. In these animals there is an imbalance between the profiles of Th1 and Th2 immune response. The evaluation of the immune response of these dogs with different clinical manifestations of VL is crucial for understanding the pathogenesis of the disease. The aim of this study was to evaluate the profile of Th1, Th2 and regulatory cytokines, transcription factors (T-bet and GATA-3) and parasite load in dogs with VL and control, in the liver, spleen and popliteal and prescapular lymph nodes to verify possible differences in compartmentalized immune response. In this study 28 dogs from an endemic area for VL and five dogs from non-endemic area (control) were used. The infected dogs were divided into symptomatic (n = 16) and asymptomatic (n = 12) groups of dogs. The quantification of the gene expression of cytokines (IFN-γ, TGF-β, IL-10, IL-4, IL-12 and MIF) and tissue parasitic load of the transcription factors was done using the technique of quantitative PCR in real time, tissue samples from different organs. The spleen and popliteal and pre-scapular lymph nodes were the organs that showed a higher number of copies of the DNA of Leishmania infantum chagasi. The results of the expression of cytokine genes showed that there was an increased expression of pro-inflammatory (TNF-α, IFN-γ, MIF, IL-12), anti-inflammatory (IL-4) and regulatory cytokines (IL-10 , TGF-β) in groups of infected dogs, with some significant differences from the control group (P <0.05). While the transcription factor T-bet had higher levels in asymptomatic animals. In conclusion GATA-3 was less expressed in the group of infected dogs suggesting that there other mechanisms ... / Doutor

Orientador: Maria Cecilia Rui Luvizotto / Banca: Fabio dos Santos Nogueira / Banca: Suely Regina Mogami Bomfim / Resumo: O objetivo dessa pesquisa foi analisar a resposta imune celular de cães negativos (GI), vacinados (GII) e positivos (GIII) para a LVC por meio da imunocitoquímica para os anticorpos anti-CD4, anti-CD8 e FOXP3 na capa leucocitária e medula óssea. Na capa leucocitária, quando comparados os grupos entre si, não houve diferença estatística para as células T CD4. Os grupos I e III apresentaram maior imunomarcação para anti-CD8. Embora não tenha sido observada diferença estatística (p>0,05), a imunomarcação para FOXP3 mostrou os menores valores percentuais nos três grupos estudados. Os grupos I e II apresentaram maior imunomarcação para anti-CD4, seguida do anti-CD8, quando comparados os anticorpos em cada grupo separadamente. Nos animais do grupo III, foi observada maior expressão de células imunorreativas ao anti-CD8 seguida do anti-CD4, e valores reduzidos para FOXP3. Nas células da medula óssea não foi verificada diferença estatística na expressão dos anticorpos anti-CD4, anti-CD8 e FOXP3 quando comparados os grupos entre si. Na análise comparativa entre os anticorpos testados, entretanto, foi observada maior marcação para o anticorpo anti-CD4 em GI, ausência de diferença estatística em GII e maior percentual de células positivas para anti-CD8 em GIII. Os valores de FOXP3 também se mantiveram reduzidos em todos os grupos. A técnica de cito inclusão foi padronizada com sucesso, obtendo 68% de viabilidade para amostras da capa leucocitária e medula óssea. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a presença de células T CD4+ e CD8+ em animais vacinados, em associação à expressão reduzida do marcador de células T regulatórias FOXP3, sugerem que a vacina Leishmune® exerce um efeito estimulatório na resposta imune celular de cães, promovendo um incremento da resposta protetora Th1 / Abstract: The aim of this research was to analyze the cellular immune response of negative (GI), vaccinated (GII) and positive (GIII) dogs for VCL by immunocytochemistry for CD4, CD8 and FOXP3 antibodies on the buffy coat and bone marrow. In the buffy coat, when compared the three groups together, there was no statistical difference in CD4+ T cells. Groups I and III showed higher immunostainning for anti-CD8. Although no statistical difference was observed, immunostainning for FOXP3 showed the lowest percentages in all three groups. Groups I and II showed higher immunoreactivity to anti-CD4 followed by anti-CD8 antibodies when compared each group separately. In group III, we observed increased expression of immunoreactive cells to anti- CD8 followed by anti-CD4, and reduced values for FOXP3. In bone marrow cells there was no statistical difference in the expression of anti-CD4, anti-CD8 and FOXP3 antibodies in the three groups. The comparative analysis between the antibodies tested, however, revealed greater cellularity expressing anti-CD4 in GII, and higher percentage of anti-CD8 positive cells in GIII. The group II showed no statistical difference between the antibodies analyzed. FOXP3 values also remained low in all groups. The results of this study indicate that the presence of CD4 + and CD8 + T lymphocytes in the vaccinated animals, combined with reduced expression of the marker of regulatory T cells FOXP3 suggest that Leishmune ® vaccine exerts a stimulatory effect on immune response of dogs, promoting an increase in the protective Th1 response / Mestre

Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é uma enfermidade infecciosa de caráter zoonótico, endêmica em algumas áreas do Brasil, causada pela L. chagasi. A maior dificuldade encontrada para controlar a doença está relacionada ao seu diagnóstico, que apresenta limitações quanto aos seus resultados. Desta maneira, o estudo comparou duas provas sorológicas, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA); o exame parasitológico direto bem como a reação em cadeia pela polimerase (PCR), ambos de aspirado de linfonodo. Foram utilizados os iniciadores gênero-específicos LINR4 e LIN19 e os iniciadores RV1 e RV2 espécie-específicos para identificar a L. chagasi. Foram coletadas amostras de 100 cães sorologicamente positivos, provenientes do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Bauru, região endêmica, e de 100 cães provenientes do CCZ de Botucatu-SP, área não-endêmica para a enfermidade. A RIFI, o parasitológico e a PCR apresentaram especificidade de 100% e o ELISA de 99%. As sensibilidades foram 97,77%; 93,33% e 91,11%, para RIFI, ELISA e PCR respectivamente. A proporção de concordância entre as provas foi satisfatória, apresentando valores de P sempre menores que 0,05. Pode-se concluir que além do exame sorológico, pode-se utilizar também a PCR de linfonodo no diagnóstico da LVC, pois a associação de técnicas melhorou a detecção de cães infectados, contribuindo para o melhor controle desta zoonose. / Abstract: The visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic infectious disease, endemic in some areas from Brazil, caused by L. chagasi. The greatest difficulty to control the disease is related to its diagnosis, which present limitations related with the results. Thus, the study compared two serologic methods, the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); the parasitological direct examination and the polymerase chain reaction (PCR), both drawn from the lymph node. The initiators used were gender-specific LINR4 and LIN19 and the initiators species-specific RV1 and RV2 to identify L. chagasi. The samples were collected from 100 dogs serologically positive, from the Center for Zoonoses Control (CZC) of Bauru, endemic region, and 100 dogs from the CZC of Botucatu-SP, an area considered non-endemic to the disease. The IFAT, the parasitological and the PCR showed 100% of specificity and ELISA 99%. The sensitivities were 97.77%, 93.33% and 91.11% for IFAT, ELISA and PCR respectively. The proportion of agreement between the methods was satisfactory, showing values of P always smaller than 0,05. It was concluded that in addition to the serologic methods, PCR of lymph node can also be used for CVL diagnosis, and that the combination of techniques improved the detection of infected dogs, contributing for better control of this zoonosis. / Orientador: Helio Langoni / Coorientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Antonio Carlos Paes / Banca: Paulo Eduardo Martins Ribolla. / Mestre

Orientador: Sueli Aparecida Calvi / Coorientador: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é causada pelos protozoários intracelulares obrigatórios pertencentes ao complexo Leishamania donovani (L.donovani). O sucesso na cura da LV depende principalmente do estado imunitário do hospedeiro em combinação com os efeitos das drogas leishmanicidas. Nesse sentido, a resistência do hospedeiro a leishmaniose está associada à produção de citocinas envolvidas na indução e efetuação de uma resposta do tipo Th1, como IL-12, IFN-γ e TNF-α. Essa resposta culmina na ativação de macrófagos com conseqüente aumento na produção de metabólitos do estresse oxidativo com atividade leishmanicida. Por outro lado, a suscetibilidade à infecção e a progressão da doença estão relacionadas com o direcionamento de uma resposta do tipo Th2, com produção de IL-4 e de outras citocinas como a IL-10, que desativam macrófagos. A subpopulação de células Th17 vem ganhando importância na resposta contra a Leishmania, entretanto não se sabe até o momento se está envolvida na resistência ou suscetibilidade à infecção. Apesar desses resultados, são raros os trabalhos que tenham objetivado avaliar de forma sistemática, os perfis de resposta de células CD4+ em pacientes com LV, antes e após o tratamento. Desta forma, um dos objetivos do presente estudo foi quantificar as citocinas do perfil Th1, Th2 e Th17 nestas duas fases da evolução da doença. Outro objetivo foi avaliar o estado redox desses pacientes, uma vez que ao tentar eliminar o parasita através do processo de ativação d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is caused by obligatory intracellular protozoa belonging to Leishmania donovani (L. donovani) complex. The success in LV cure depends mainly on the immune status of the host in combination with the effects of antileishmanial drugs. Accordingly, leishmaniasis host resistance is associated with production of cytokines involved in Th1 response induction and its effector functions, such as IL-12, IFN-γ and TNF-α. This response culminates in macrophages activation, that begin to release higher levels of oxigen and nitrogen reactive species that have potent leishmanicidal activities. In contrast, susceptibility to infection and disease progression are linked to a predominat Th2 response that produces IL-4 and other cytokines such as IL-10 that deactivate macrophages. The importance of Th17 subset in host response to leishmania has also been studied, however it is not established yet if it is involved in resistance or susceptibility to infection. Despite these findings, few studies have aimed to evaluate the predominant profiles of CD4 + cells that are activated in patients with LV before and after treatment. Thus, one of the objectives of the present study was to quantify the cytokines tipical of Th1, Th2 and Th17 profiles in these two stages of disease progression. In addittion, we aimed to evaluate the redox status of these patients, since by trying to eliminate the parasite through the macrophage activation process, they can release excessive am... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Aparecido Antonio Camacho / Banca: Mary Marcondes / Banca: Áulus Cavalieri Carciofi / Banca: Rosângela de Oliveira Alves Carvalho / Banca: Wagner Luís Ferreira / Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença multissistêmica. Em cães com LV, poucos estudos mencionam os mecanismos fisiopatológicos que levam a quadros de hipertensão arterial, e também não são bem esclarecidas às consequências da hipertensão sistêmica sobre a função miocárdica de cães acometidos pela doença. Entretanto, sabe-se que um dos principais órgãos a serem acometidos são os rins, e quando comprometidos, são desenvolvidos mecanismos fisiopatológicos que levam a quadros de hipertensão arterial de origem renal. Desta forma, a presente investigação científica teve como objetivo, avaliar os efeitos da pressão arterial sobre a estrutura e função cardíaca de cães com LV. Para tanto, foram avaliados 43 cães com LV entre 5 e 14 Kg, estratificados pelos valores de pressão arterial sistólica (PAS) em três grupos. Dezenove (19) cães com valores de PAS até 129 mmHg formaram o G1, 12 cães com valores de PAS entre 130 e 159 mmHg formaram o G2, e 12 cães com valores de PAS acima de 160 mmHg formaram o G3. Os cães foram diagnosticados para LV por meio de punção biopsia aspirativa de linfonodo e medula óssea. Após confirmação diagnóstica, foram submetidos a exames laboratoriais, físicos, radiográficos de tórax, eletrocardiográficos, ecodopplercardiográficos, mensuração da PAS, determinação das concentrações séricas da aldosterona, troponina I, desidrogenase láctica 1 (LDH1), creatina quinase fração MB (CK-MB), e renina plasmática, relação proteína creatinina urinaria (UP/C), e avaliação histopatológica do miocárdio. Os cães do G3 apresentaram hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo, aumento nos parâmetros de disfunção diastólica relativos à índice de Tei e índice de relaxamento isovolumétrico, além de aumento significativo das concentrações da aldosterona, Renina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a multisystem disease. In dogs with VL, few studies mention the pathophysiological mechanisms leading to hypertension frames, and are not well clarified the consequences of systemic hypertension on myocardial function in dogs affected by the disease. However, it is known that one of the major organs to be affected are the kidneys, and when compromised, are developed pathophysiological mechanisms that lead to conditions of hypertension from renal origin. Thus, the present research aimed to assess the effects of systolic blood pressure on the cardiac structure and function of dogs with VL. Therefore, we studied 43 dogs with VL and stratified by the values of systolic blood pressure (SBP) in three groups. 19 dogs with SBP to 129 mmHg shaped the G1, 12 dogs with SBP between 130 and 159 mmHg shaped the G2, and 12 with SBP above 160 mmHg shaped the G3. The dogs were diagnosed for LV by aspiration biopsy of lymph node and bone marrow. After confirming the diagnosis, underwent laboratory exams, physical, chest radiographic , electrocardiographic, Doppler echocardiographic measurement of SBP, determination of serum aldosterone, troponin I, lactate dehydrogenase 1 (LDH1), creatine kinase MB fraction (CK-MB) and plasma renin, urinary creatinine ratio protein (UP / C), and histopathological evaluations of myocardium. G3 Dogs showed concentric left ventricular hypertrophy, increase in parameters of diastolic dysfunction on the Tei index and index of isovolumetric relaxation, and significant increase of concentrations of aldosterone, renin, CKMB and Troponin I. As for the evaluation of renal function G3 dogs showed increased of serum concentrations of calcium, phosphorus, magnesium, urea, and increased fractional excretion of sodium and UP / C. The results indicate... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo:Cães infectados com Leishmania infantum, apresentam uma redução do número de linfócitos T. PD-1(programmed cell death 1) um novo membro da família B7-CD28, é expresso por células do sistema imune e sua ligação a PD-L1 (CD274) ou PD-L2 (CD273) induz à desativação dos linfócitos T ou à apoptose. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de PD-1 e seus ligantes bem como sua função na indução de apoptose de linfócitos T, secreção de TNF-α e IL-4, óxido nítrico e na carga parasitária em cães com leishmaniose visceral. Observamos que na leishmaniose visceral canina PD-1 e seus ligantes participam na indução da apoptose celular de linfócitos T, estão regulando a produção de óxido nítrico, TNF-α, IL-4, além da carga parasitária. Esse estudo ajuda a esclarecer o mecanismo da resposta imunológica e drogas imunoterapeuticas como anticorpos monoclonais bloqueadores que podem influenciar na LVC / Abstract:Dogs infected with Leishmania infantum showed a reduction in the number of lymphocytes T. PD-1 (Programmed cell death 1) a new member of the B7-CD28 family, it is expressed by cells of the immune system and its binding to PD-L1 (CD274) or PD-L2 (CD273) induces deactivation of T cells or apoptosis. This study aimed to evaluate the PD-1 expression and its ligands as well as their role in T lymphocyte induction of apoptosis, TNF-α and IL-4 secretion, nitric oxide production and parasite load in dogs with visceral leishmaniasis. We observed that in canine visceral leishmaniasis PD-1 and its ligands involved in induction of apoptosis of T lymphocytes, are regulating the nitric oxide production, TNF-α, IL-4, as well as the parasitic load. This study helps to clarify the mechanism of immune response and immunotherapeutic drugs such as blocking monoclonal antibodies that can influence the LVC / Orientador:Valéria Marçal Felix de Lima / Banca:Alexandra Ivo de Medeiros / Banca:Caris Maroni Nunes / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Embora as ações de vigilância e controle da leishmaniose visceral (LV) preconizadas pelo Ministério da Saúde venham sendo realizadas nas mais variadas áreas endêmicas do país, seus resultados não tem sido satisfatórios. Para conter a expansão da doença, tendo em vista o seu aumento em centros urbanos, a estratégia de controle da leishmaniose visceral utilizada no Brasil atualmente merece reavaliação. Neste estudo, foram analisados os dados das ações do Programa de Controle da Leishmaniose Visceral (PCL) desenvolvidas no período de 2006 a 2008 em 38 dos 113 bairros que compõe o município de Teresina, no Estado do Piauí. As ações do PCL (borrifação domiciliar com inseticidas e eliminação de cães sororreagentes) foram avaliadas trimestralmente, sendo a variável dependente o número de casos de LV ocorridos um ano após a execução das ações. Foram incluídas nas análises o ano de implementação destas ações e variáveis sócio-econômicas. A regressão de Poisson foi realizada para verificar o grau de associação entre a ocorrência do agravo em relação às diferentes combinações de medidas de controle implementadas pelo PCL sob intensidades de prevalência canina maiores ou menores que 10%. Após a regressão multivariada, constatou-se que, quando não se estratifica pelo nível de prevalência de infecção canina, os resultados apontam para uma não efetividade das ações de controle. Todavia, quando se estratifica pela prevalência canina, observa-se que, em locais onde ela é baixa, o controle do reservatório canino, executado de maneira independente das outras ações de controle, esteve associado com uma redução de 37% nas taxas de ocorrência de LV um ano após a implementação da ação (Razão de taxas de incidência = 0,63, p=0.05). A borrifação com inseticida executada de maneira independente das demais ações de controle, bem como a execução conjunta do controle do vetor alado e do reservatório canino, em ambos os cenários de prevalência canina, não apresentaram associação significativa com a incidência da doença nos anos posteriores a sua implementação. Estes achados constituem material relevante para discussão da efetividade das ações de controle da Leishmaniose Visceral. / Although visceral leishmaniasis (VL) surveillance and control activities as recommended by the Brazilian Ministry of Health have been implemented in different endemic areas of the country, their results have not been satisfactory. To contain the spread of the disease, particularly considering its recent increase in transmission in urban centers, the strategy currently in use in Brazil for controlling VL deserves reassessment. This study analyzed data concerning the control actions of the Program for the Control of Visceral Leishmaniasis (PCL) developed between the years 2006 to 2008 in 38 of the 113 districts that make up the city of Teresina, Piauí State, Brazil. The PCL control actions (household insecticide spraying and culling of infected dogs) were evaluated at each three months and the outcome variable was the number of cases of VL occurring one year after. In te analysis were included also the year in which the PCL actions were performed and socio-economic variables. of their implementation. Poisson regression models were performed to verify the degree of association between the occurrence of VL and different combinations of control measures implemented by PCL in different canine prevalence scenarios (higher or lower than 10%). Results from multivariate analysis suggest non-effectiveness of control measures when not stratifying by canine prevalence. However, when stratifying by canine prevalence it is observed that in places where the prevalence is low (<10%), culling infected dogs was associated with a decrease of 37% in the incidence of VL (Incidence rate ratio = 0.63, p=0.05). Indoor household spraying with insecticides in both canine prevalence scenarios and culling dogs in higher prevalence settings were not significantly associated with the occurrence of VL cases. These findings constitute relevant material to the discussion of the effectiveness of control measures of Visceral Leishmaniasis.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-05-31T20:46:06Z No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) Previous issue date: 2016-12-13 / Introdu??o: Os c?es s?o considerados os principais reservat?rios dom?sticos de Leishmania infantum no Brasil e apresentam um amplo espectro de manifesta??es cl?nicas, variando de perda de peso, anemia grave, hepatoesplenomegalia e les?es d?rmicas disseminadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de express?o g?nica em c?lulas do ba?o e do sangue perif?rico de c?es naturalmente infectados por L. infantum e investigar as altera??es histopatol?gicas no ba?o, f?gado, intestino e pele, visando identificar poss?veis vias imunorreguladoras envolvidas na patog?nese da LVC. Metodologia: Vinte e um c?es oriundos do Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN foram estudados e um subgrupo destes animais (n=8) foi utilizado para estudos de express?o g?nica global. A carga de Leishmania nos diversos tecidos, foi estimada por qPCR e cultura para Leishmania foi realizada. O RNA total do ba?o e do sangue perif?rico foi extra?do e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequ?ncias obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A express?o g?nica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anota??o funcional e as caracter?sticas moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG atrav?s do pacote STRINGdb. Fragmentos de f?gado, duodeno, pele e ba?o foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluoresc?ncia para an?lises histopatol?gicas. Resultados: As cargas parasit?rias estimadas para ba?o e f?gado apresentam correla??o, por?m n?o h? correla??o entre a carga parasit?ria destes tecidos com aquela presente no sangue. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no ba?o de animais sintom?ticos, como CTLA4, CCL2 e IL27; al?m destes, cerca de 1.190 genes apresentaram express?o reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. As vias de ativa??o de c?lulas NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like expressas no ba?o de animais sintom?ticos estavam com express?o elevada, enquanto as vias de s?ntese de ?ncoras de GPI e ativa??o do imunoproteossoma estavam reprimidas. A progress?o da LVC resulta em desorganiza??o da citoarquitetura do ba?o, com perda parcial da delimita??o entre polpa branca e vermelha. ? observado infiltrado inflamat?rio no f?gado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluoresc?ncia a presen?a de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no ba?o de animais sintom?ticos. Conclus?es: A desregula??o de mecanismos tipicamente associados ? imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Al?m disso, uma alta efici?ncia no processamento e apresenta??o de ant?genos parecem ser respons?veis, pela resist?ncia ao desenvolvimento dos sinais cl?nicos e integridade tissular durante a infec??o por L. infantum em c?es. / Background: Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum in Brazil. Those animals present a wide spectrum of clinical manifestations, varying from weight loss, anemia to hepatosplenomegaly and skin lesions. The goal of this study was to evaluate the gene expression profile in the spleen and peripheral blood cells from naturally Leishmania-infected dogs and to study the histology of the spleen, liver, gut and skin, in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 dogs was studied and a sub group (n=8) was selected for transcriptomic studies. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR and parasite was isolated from the spleen by culture. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: Parasite load estimated in the spleen and liver were strongly associated, however no correlation was observed between them and circulating parasite estimation. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatic dogs, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. We found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways are highly expressed in the spleen of symptomatic dogs, while GPI-anchors synthesis and immunoproteasome activation related genes are downregulated in these animals. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, with partial loss of the delimitation between white and red pulp. Furthermore, an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirming the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 are overexpressed the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: These findings suggest that misregulation of innate immunity is involved in CVL and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.