Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-26Bitstream added on 2014-06-13T19:18:35Z : No. of bitstreams: 1 camargo_jb_me_botfmvz.pdf: 604246 bytes, checksum: 07ea679245c94fa23e7b1461f7a2ce2a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A leishmaniose visceral (LV) é uma enfermidade infecciosa de caráter zoonótico, endêmica em algumas áreas do Brasil, causada pela L. chagasi. A maior dificuldade encontrada para controlar a doença está relacionada ao seu diagnóstico, que apresenta limitações quanto aos seus resultados. Desta maneira, o estudo comparou duas provas sorológicas, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA); o exame parasitológico direto bem como a reação em cadeia pela polimerase (PCR), ambos de aspirado de linfonodo. Foram utilizados os iniciadores gênero-específicos LINR4 e LIN19 e os iniciadores RV1 e RV2 espécie-específicos para identificar a L. chagasi. Foram coletadas amostras de 100 cães sorologicamente positivos, provenientes do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Bauru, região endêmica, e de 100 cães provenientes do CCZ de Botucatu-SP, área não-endêmica para a enfermidade. A RIFI, o parasitológico e a PCR apresentaram especificidade de 100% e o ELISA de 99%. As sensibilidades foram 97,77%; 93,33% e 91,11%, para RIFI, ELISA e PCR respectivamente. A proporção de concordância entre as provas foi satisfatória, apresentando valores de P sempre menores que 0,05. Pode-se concluir que além do exame sorológico, pode-se utilizar também a PCR de linfonodo no diagnóstico da LVC, pois a associação de técnicas melhorou a detecção de cães infectados, contribuindo para o melhor controle desta zoonose. / The visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic infectious disease, endemic in some areas from Brazil, caused by L. chagasi. The greatest difficulty to control the disease is related to its diagnosis, which present limitations related with the results. Thus, the study compared two serologic methods, the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); the parasitological direct examination and the polymerase chain reaction (PCR), both drawn from the lymph node. The initiators used were gender-specific LINR4 and LIN19 and the initiators species-specific RV1 and RV2 to identify L. chagasi. The samples were collected from 100 dogs serologically positive, from the Center for Zoonoses Control (CZC) of Bauru, endemic region, and 100 dogs from the CZC of Botucatu-SP, an area considered non-endemic to the disease. The IFAT, the parasitological and the PCR showed 100% of specificity and ELISA 99%. The sensitivities were 97.77%, 93.33% and 91.11% for IFAT, ELISA and PCR respectively. The proportion of agreement between the methods was satisfactory, showing values of P always smaller than 0,05. It was concluded that in addition to the serologic methods, PCR of lymph node can also be used for CVL diagnosis, and that the combination of techniques improved the detection of infected dogs, contributing for better control of this zoonosis.

Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Coorientadora: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Ana Carolina Borsanelli / Banca: Andréa Fontes Garcia / Resumo: Leishmaniose visceral é uma doença infecciosa, de potencial zoonótico, negligenciada e um sério problema de saúde pública em muitas partes do mundo. Dada à importância epidemiológica, a pesquisa teve como objetivo identificar soroprevalência, distribuição espacial e os fatores de risco relacionados à ocorrência de casos de leishmaniose visceral canina (LVC) no município de Piacatu. Foram analisados dados de inquérito censitário canino, com coleta de amostras de 833 animais, com posterior mapeamento dos casos positivos e aplicação de questionário epidemiológico casa a casa em locais de ocorrência de LVC. Baseado nos dados da análise soro- epidemiológica e espacial observou-se que ocorreram associações significativas entre fatores de risco e prevalência de LVC. Medidas de controle da LV necessitam ser intensificadas e direcionadas ao controle de vetores com identificação de flebótomos infectados, manejo ambiental e avaliação do real potencial de transmissão de gatos e animais considerados sorologicamente negativos. / Abstract: Visceral leishmaniasis is an infectious disease of zoonotic potential, neglected and a serious public health problem in many parts of the world. Given the epidemiological importance, the research aimed to identify seroprevalence, spatial distribution and risk factors related to the occurrence of cases of canine visceral leismaniasis (LVC) in the city of Piacatu. Data from a canine census survey were analyzed, with samples collected from 833 animals, with subsequent mapping of the positive cases and application of an epidemiological questionnaire at places with LVC occurrence. Based on data from the seroepidemiological and spatial analysis it was observed that there were significant associations between risk factors and prevalence of LVC. Control measures of LV need to be intensified and directed to the control of vectors with identification of infected sandflies, environmental management and evaluation of the real transmission potential of cats and animals considered serologically negative. / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, Progragama de Pós-graduação em Medicina Tropical, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-01-04T13:40:56Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-04T12:53:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-04T12:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / No Brasil, a leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pelo parasito Leishmania chagasi, (sin. L. infantum). Considera-se que a principal via de transmissão da LV é por meio da picada de flebotomíneos infectados. Entretanto, formas alternativas têm sido investigadas e a picada ou ingestão de carrapatos infectados poderia ter relevância epidemiológica. A presença de L. chagasi em Rhipicephalus sanguineus poderia explicar a transmissão do parasito na população canina em locais onde há baixa frequência de flebotomíneos. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de Leishmania spp. em R. sanguineus coletados em cães naturalmente infectados no Distrito Federal. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília. Os carrapatos foram obtidos de uma amostra de conveniência composta por 48 cães entregues por seus donos à Diretoria de Vigilância Ambiental da Secretaria de Saúde do Distrito Federal com diagnóstico suspeito ou confirmado de LVC, por meio de testes sorológicos, ou cães recolhidos por ocasião da realização do inquérito rotineiro do programa de controle de LVC no DF. Foi coletado sangue venoso dos 48 cães para avaliação sorológica da infecção por Leishmania spp por meio das técnicas imunoenzimática e imunofluorescência indireta, ambas com antígeno bruto de L. major; do teste imunocromatográfico rápido de duplo percurso com antígeno recombinante K28 e aplicação da técnica de PCR para amplificação de alvos de DNA gênero-específicos. Após a identificação dos espécimes de R. sanguineus, os carrapatos foram armazenados em pools de até 10 espécimes, separando-os em grupos de machos, fêmeas e ninfas. Os carrapatos foram dissecados para retirar o intestino e glândulas salivares para extração de DNA e posterior amplificação da região conservada de 120pb de kDNA e 234pb do gene hsp70 de Leishmania spp. por meio da PCR e para cultura em meio NNN modificado. Os produtos amplificados de kDNA foram ainda submetidos à digestão com as endonucleases Hae III e BstUI e ao sequenciamento genético para identificação das espécie do parasito. Foram realizados esfregaços em lâminas coradas com Giemsa para observação direta de formas de Leishmania spp. A positividade das técnicas sorológicas aplicadas ao sangue canino foi de 66,6% pelo ELISA, destes, 81,2% pela RIFI e 56,2% do total pelo DPP, e ainda, 70,8% dos cães apresentaram pelo menos um dos três testes com resultados reagentes ou positivos. Foram coletados 130 espécimes de R. sanguineus dos 27 cães que se apresentaram ectoparasitados. Houve sucesso no isolamento em cultura de Leishmania spp. de cinco pools de glândulas salivares e intestinos de carrapatos coletados em quatro cães. O sequenciamento do kDNA amplificado pela PCR a partir destas amostras demonstrou homologia com sequências de Leishmania spp. Os produtos amplificados de kDNA a partir de amostra sanguínea de um dos cães apresentou homologia com sequência de L. braziliensis, no entanto, a homologia do material amplificado a partir dos carrapatos coletados desse cão foi com uma sequência de L. infantum. A cultura analisada por eletroforese de isoenzimas foi identificada como L. infantum. A infecção por Leishmania nos cães, dos quais foram coletados os pools de carrapatos positivos na cultura, foi confirmada pela PCR. A lâmina do pool de machos de um dos cães foi a única a apresentar formas flageladas de tripanossomatídeos, cuja identificação não foi possível pela morfometria. Os resultados obtidos indicam que R. sanguineus que se alimentam naturalmente em cães naturalmente infectados por L. infantum apresentam DNA do parasito no intestino e glândulas salivares, confirmam a presença de L. infantum viável nestes ectoparasitos,e a possibilidade de isolar L. infantum em meio de cultura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, canine visceral leishmaniasis (CVL) is caused by the parasite Leishmania chagasi (syn. L. infantum). It is considered that the principal route of transmission of the VL is through the bite of infected sand flies. However, alternative methods have been investigated and bites or ingestion of infected ticks could have epidemiological relevance. The presence of L. chagasi in Rhipicephalus sanguineus could explain the transmission of the parasite in the canine population in areas where there are low frequency of sand flies. The objective of this study was to detect the presence of Leishmania spp. in R. sanguineus collected from dogs naturally infected in the District Federal. The project was approved by the Ethics Committee on Animal Use of the UNB Faculty of Medicine. Ticks were obtained from a convenience sample consisting of 48 dogs delivered by their owners to the Environmental Surveillance Directory of Health Department of the District Federal with suspected or confirmed diagnosis of CVL, through tests, or dogs collected during the day routine investigation of the control program LVC in DF. Venous blood was collected from 48 dogs for serologic evaluation of infection by Leishmania spp. by means of ELISA and indirect immunofluorescence techniques, both with crude antigen of L. major, the immunochromatographic dual path assays with recombinant K28 and amplification of genus specific DNA targets by PCR. After identification of specimens of R. sanguineus ticks were stored in pools of up to 10 specimens, separating them into groups of males, females and nymphs. Ticks were dissected to remove the gut and salivary glands for DNA extraction and subsequent amplification of 120pb of the conserved region of kDNA and 234pb of the hsp70 gene of Leishmania spp. by PCR. Ticks sample were also cultured in modified NNN culture medium. The amplified products of kDNA were further subjected to digestion with restriction endonucleases Hae III and BstUI and gene sequencing to identify the parasite species. Smears were prepared on slides stained with Giemsa for observation of Leishmania spp. forms. The positivity of serological techniques applied to canine blood was 66.6% by ELISA. Among positive samples, 81.2% were also positive by IFA and 56.2% by DPP, then, 70.8% of dogs had at least one of the three tests with positive results. We collected 130 specimens of R. sanguineus of the 27 dogs that had ectoparasites. Isolation of Leishmania spp. was successfull in five pools of salivary glands and intestines of ticks collected from four dogs. Sequencing kDNA amplified by PCR from these samples revealed homology with sequences of Leishmania spp. The amplified products of kDNA in a blood sample from one of the dogs showed sequence homology to L. braziliensis, however, the amplified material from ticks collected from this dog had homology with L. infantum sequence. The isolate analyzed by mulilocus enzyme electrophoresis was identified as L. infantum. The Leishmania infection in dogs where we collected the pools of ticks which had successful parasite isolation in culture was confirmed by PCR. The smear of the pool of male ticks collected from one dog was the only positive for flagellated trypanosomatidae whose identification was not possible by morphometry. Our results indicate that R. sanguineus feeding naturally in dogs naturally infected by L. infantum had parasite DNA present in the intestine and salivary glands, confirm the presence of viable L. infantum in these ectoparasites, and the possibility of isolation of L. infantum in culture medium.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2010-06-11T20:16:07Z No. of bitstreams: 1 2008_CeciliaAzevedoDias.pdf: 1860042 bytes, checksum: a5e68c02f6ce03d9bfe796388ba72bd5 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-06-23T23:40:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CeciliaAzevedoDias.pdf: 1860042 bytes, checksum: a5e68c02f6ce03d9bfe796388ba72bd5 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T23:40:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CeciliaAzevedoDias.pdf: 1860042 bytes, checksum: a5e68c02f6ce03d9bfe796388ba72bd5 (MD5) Previous issue date: 2008-12-10 / Considerando que os rins são freqüentemente acometidos na leishmaniose visceral canina, esse estudo visa contribuir para um melhor entendimento das alterações clínico-laboratoriais e nefropatias associadas à enfermidade. Foram realizados exames clínicos, hemograma completo, bioquímica sanguínea (proteína total, globulina, albumina, uréia e creatinina) e urinálise de 14 cães sintomáticos e 13 cães assintomáticos com leishmaniose visceral, além de 10 animais saudáveis como controle. Os principais sinais clínicos encontrados foram: palidez de mucosas (59,3%), linfadenopatia generalizada (55,6%), alterações dermatológicas (55,6%), esplenomegalia (55,6%), hepatomegalia (33,3%), condição corporal magra (33,3%) e alterações oftálmicas (29,6%). Nos cães com a enfermidade, foi observada anemia normocítica normocrômica (70,4%), diminuição na contagem de linfócitos (33,3%), aumento das concentrações séricas de uréia e creatinina (18,5%) e concentrações elevadas de proteínas, sangue oculto e hemácias na urina, em comparação aos animais do grupo controle. Os cães do grupo sintomático apresentaram hiperproteinemia, hiperglobulinemia e hipoalbuminemia mais expressivas, acometendo 64% dos animais desse grupo. Foram observadas glomerulonefrites em 70,4% dos cães, alterações intersticiais no parênquima renal em 70,4% e alterações tubulares em 40,7%. As principais glomerulopatias observadas nos cães com leishmaniose visceral foram glomerulonefrite membranoproliferativa (47,4%), glomeruloesclerose segmentar focal (21%), glomerulonefrite proliferativa mesangial (15,8%) e glomerulonefrite membranosa (15,8%). Os cães com glomerulonefrite membranoproliferativa apresentaram maior comprometimento da função renal. Em áreas endêmicas para a doença, como o Distrito Federal, os resultados do presente estudo pretendem contribuir para identificação e diagnóstico mais precoce da enfermidade nos cães. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Considering the fact that kidneys are usually injured in canine visceral leishmaniasis, the aim of this study was to improve knowledge about clinical and laboratorial changes and nephropathies associated with this disease It was conducted physical examination, complete blood count, serum biochemistry (total protein, globulin, albumin, blood urea nitrogen and creatinln) and urinalysis from 14 symptomatic and 13 asymptomatic dogs with visceral leishmaniasis. Ten healthy animals were used as control group. The most important clinical signs found were: paleness of the mucous membrane, generalized limphadenopathy, cutaneous lesions, splenomegaly, hepatomegaly, weight loss and ophtalmological lesions. The infected group presented normocytic normochromic anemia, lymphopenia, azotemia and higher urinary level of proteins, occult blood and erythrocytes, compared with control group. The symptomatic group presented most significant hyperproteinemia, hyperglobulinemia and hypoalbuminemia in 64% of the animals. 70.4% of the dogs presented glomerulonephritis and intersticial changes in renal parenchyma, and 40.7% presented tubular injuries. The most important glomerulopathies reported in dogs with visceral leishmaniasis were membranoproliferative glomerulonephritis (47.4%), focal segmentar glomerulosclerosis (21%), mesangial proliferative glomerulonephritis (15.8%) and membranous glomerunephritis (15.8%). Dogs with membranoproliferative glomerulonephritis presented a more impaired renal function.. In canine visceral leishmaniasis endemic areas, such as Distrito Federal, the results of this study intend to improve early identification and diagnosis of the disease in dogs.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T15:02:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Gilzane Dantas Nóbrega.pdf: 1294447 bytes, checksum: 21608dde0c9fde9504e79e6652893aa4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T15:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Gilzane Dantas Nóbrega.pdf: 1294447 bytes, checksum: 21608dde0c9fde9504e79e6652893aa4 (MD5) Previous issue date: 2014 / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma doença de caráter zoonótico que reflete em graves problemas à saúde pública. Os cães são os principais reservatórios domésticos do protozoário. No Brasil, uma das formas de controle é a eutanásia dos cães portadores da infecção e nesse contexto, o diagnóstico preciso da LVC é muito importante. Porém, ainda não há um teste altamente sensível e específico, de fácil execução, simples, menos invasivo e de rápido resultado. As avaliações das novas metodologias empregadas para diagnóstico são necessárias ao aprimoramento do programa de controle. Esse estudo teve como objetivo avaliar e comparar dois testes sorológicos que utilizam proteínas recombinantes, sendo um teste imunocromatográfico (TR DPP®) com antígeno rk26/rk39/rk9 e um Ensaio Imunoenzimático (ELISA/S7®) com HSP70 e um teste molecular, a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real para diagnóstico da LVC no Semiárido Paraibano. Foram utilizadas 258 amostras de soro e sangue total divididas em dois grupos: 212 de animais assintomáticos e 46 de animais sintomáticos obtidos durante um levantamento epidemiológico no Semiárido Paraibano. Os resultados mostraram que do total das amostras, 32,9% (85/258) foram positivas em pelo menos um teste, sendo 29,2 % (62/212) dos animais assintomáticos e 50,0% (23/46) dos animais sintomáticos. Os melhores resultados de concordância entre os testes foram obtidos quando realizada a comparação entre a qPCR e o ELISA/S7® mostrando que para animais assintomáticos a sensibilidade e especificidade foi de 74% e 93%, respectivamente e coeficiente Kappa de 0,58, os animais sintomáticos apresentaram sensibilidade de 80% e 81% de especificidade com coeficiente Kappa de 0,51 revelando moderada concordância em ambos os grupos. Com base nos resultados, o ELISA/S7® apresentou um melhor desempenho entre os testes, embora o TR DPP® seja um teste de fácil execução e rápido diagnóstico.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:29:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4897_1.pdf: 8357327 bytes, checksum: 46d7207290a153cad6a38d771aae9c1c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A Cartografia tem sido utilizada pela saúde pública desde 1854 com os estudos do Dr. John Snow, que a partir de dados descritivos dos óbitos e a base espacial do centro de Londres, conseguiu controlar o problema da epidemia da cólera. A pesquisa aqui desenvolvida teve como objetivos gerar um aplicativo para monitoramento epidemiológico utilizando SIG - Sistemas de Geoinformação, fornecer subsídios às secretarias de saúde e avaliar a aplicação de técnicas de análise espacial. Para tanto, foram utilizados conceitos de Cartografia, com ênfase em SIG, e de epidemiologia com o estudo da zoonose Leishmaniose visceral - Calazar, tendo como área piloto ZEIS Zonas Especiais de Interesse Social em Jaboatão dos Guararapes - PE. Como resultado, foi desenvolvido um sistema aplicativo em SIG utilizando a plataforma SPRING, de consulta pela internet, tendo sido aplicada à metodologia de Modelagem de Dados Espaciais

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-07T14:48:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1802736 bytes, checksum: e5db15c40e2dab33fc52de0674a58641 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-07T14:48:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1802736 bytes, checksum: e5db15c40e2dab33fc52de0674a58641 (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmaniose é o nome dado as enfermidades causadas por protozoários do gênero Leishmania que são capazes de gerar diversos quadros de doenças em seres humanos, dependendo da espécie envolvida na infecção podem ocorrer desde lesões cutâneas localizadas a lesões disseminadas e infecção visceral. No Brasil a leishmaniose visceral (LV) é causada principalmente por Leishmania infantum chagasi (syn Leishmania infantum). A LV tem os cães e o homem como principais espécies afetadas, é uma doença endêmica ocorrendo principalmente em regiões rurais, mas que vem apresentando tendência a urbanização. Segundo o ministério da saúde entre 1990 e 2016 foram relatados mais de 75000 casos desta doença no Brasil. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDase são enzimas capazes de hidrolisar nucleotideos di e/ou trifostato e atuam em diversos processos relacionados a infeciosidade deste parasito, além de terem potencial para uso em diagnóstico de LV em cães. Duas isoformas são conhecidas em L. infantum chagasi, uma maior denominada LicNTPDase1 (~70kDa) e uma menor denominada LicNTPDase2 (~40kDa). Até o momento somente as NTPDases recombinates de L. infantum chagasi foram estudadas. Nosso objetivo foi estudar as enzimas nativas do parasito. Nesse trabalho foram realizadas diferentes abordagens: tentativas de purificar ambas enzimas nativas de promastigotas, avaliação da expressão do mRNA relativos às enzimas em diferentes fases evolutivas do parasito, clonagem e expressão solúvel da região que codifica para o ectodomínio da LicNTPDase2. Constatamos a secreção de uma NTPDase com aproximadamente 70 kDa por formas promastigotas. Análises por RT-qPCR mostraram que a LicNTPDase1 é mais expressa em promastigota de fase logarítmica de crescimento e em condições acidófilas, enquanto a LicNTPDase2 possui maior expressão em amastigota que é uma das formas infecciosas do parasito. Estes dados podem reforçar a participação destas enzimas no desenvolvimento e infecciosidade do parasito. Foi possível expressar a LicNTPDase2 em sua forma solúvel, o que nos ajudará em futuros estudos estruturais, enzimáticos e na produção de anticorpos estruturais contra esta proteína. / Leishmaniasis is the name given to diseases caused by protozoans of the genus Leishmania that are capable of generating several disease states in humans, depending on the Leishmania species involved in the infection, can occur from localized skin lesions to disseminated lesions and visceral infection. In Brazil the visceral leishmaniasis (VL) is caused by the species Leishmania infantum chagasi and its transmission occurs by the bite of females of the insect Lutzomya longipalpis. VL has dogs and man as main species affected, is an endemic disease occurring mainly in rural regions, but that has been showing a strong tendency to urbanization. According to the Health Ministry between 1990 and 201, more than 75,000 cases of this disease have been reported in Brazil. The Ecto-nucleotidases from the E-NTPDase family are enzymes capable of hydrolyzing di- and / or triphosphate nucleotides and act in several processes related to the infectivity of this parasite, besides being potential for use in the diagnosis of VL in dogs. Two isoforms of these enzymes are known in L. infantum chagasi, LicNTPDase1 (~70kDa) and LicNTPDase2 (~ 40kDa). Until now only the recombinants NTPDases of L. infantum chagasi were studied. Thus, our aim was to work with the native enzymes of the parasite. In this work, different approaches were carried out: attempts to purify both native promastigote enzymes, evaluation of the mRNA expression related to the enzymes in different evolutionary stages of the parasite, cloning and soluble expression of the region encoding the ectodomain of LicNTPDase2. Futhermore, we observed the secretion of an NTPDase with approximately 70kDa by promastigote forms. Analyzes by RT-qPCR showed that the LicNTPDase1 is more expressed in log-phase growth promastigotes and in acidophilic conditions, while the LicNTPDase2 has greater expression in amastigote that is one of the infectious forms of the parasite. These datacan reinforce the participation of these enzymes in parasite development and infectivity. Moreover, it was possible to express the LicNTPDase2 in its soluble form, which will help us in future structural, enzymatic studies and in the production of structural antibodies against this protein.

Hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi são considerados um dos melhores modelos para estudo de fatores relacionados à imunossupressão que ocorre durante a leishmaniose visceral ativa, pois apresenta manifestações clínicas similares ao que ocorre no homem e não conseguem controlar a infecção. Neste estudo, hamsteres infectados intraperitonealmente com 2x107 parasitos foram utilizados para avaliação de possíveis fatores envolvidos na dinâmica da imunossupressão. Os parâmetros avaliados foram a produção de citocinas de padrão Th1 e Th2, produção de óxido nítrico por células esplênicas e detecção de apoptose em linfócitos esplênicos em tempos precoces (6, 20, 48 e 72 horas), intermediários (7 e 15 dias) e tardios (30 e 60 dias) de infecção. Inicialmente avaliamos a carga parasitária no baço e observamos aumento progressivo dependente do tempo de infecção, ratificando que hamster infectado é um bom modelo para desenvolvimento de doença. A resposta celular frente a mitógeno e antígeno de Leishmania foi o parâmetro utilizado para avaliação de imunossupressão. Observamos resposta preservada à concanavalina A em todos os tempos de infecção e resposta preservada ao antígeno de Leishmania nos tempos precoces, porém com ausência de resposta antígeno específica a partir do tempo de 7 dias de infecção. A quantificação de óxido nítrico foi determinada em sobrenadante de células esplênicas de cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania, pelo método de Griess. Observamos inicialmente baixo nível de produção de óxido nítrico em todos os tempos de infecção, no entanto quando as células foram estimuladas com antígeno de Leishmania observamos níveis ainda menores nos tempos de 48 e 72 horas de infecção. O perfil de citocinas produzido foi determinado pela reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa, sendo detectado RNA mensageiro tanto de citocinas Th1, quanto Th2 em todos os tempos de infecção (precoce, intermediária e tardia), em células ex-vivo e estimuladas; e também em animais controles não infectados; não havendo um padrão de dicotomização de produção de citocinas neste modelo experimental. Detecção de apoptose em células esplênicas não aderentes (prováveis linfócitos T) ex-vivo e em cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania foi avaliada pelos seguintes métodos: Anexina V, caspase 3 clivada e TUNEL por citometria de fluxo. Houve marcação da exposição de fosfatidil serina pelo método da anexina V, nos tempos de 6 horas de infecção, quando as células foram estimuladas com mitogeno ou antígeno de Leishmania; e com 48 horas e 60 dias de infecção somente quando estimuladas com antígeno de Leishmania. Em células esplênicas em cultura estimuladas com concanavalina não houve marcação de caspase 3 clivada, porém em células esplênicas ex-vivo nos tempos 20, 48 e 72 horas de infecção houve detecção de apoptose, definida por marcação de caspase 3 clivada. A marcação de células esplênicas não aderentes para quebra de DNA foi baixa em todos os tempos analisados, porém observamos aumento de marcação em células esplênicas não aderentes, estimuladas com antígeno nos tempos de 20 horas e posteriormente de 7 dias até 60 dias de infecção. Nossos resultados sugerem que a imunossupressão na leishmaniose visceral no modelo de hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi é antígeno dependente e instala-se nos tempos intermediários de infecção, a partir de 7 dias. Esta imunossupressão parece estar relacionada com aumento de apoptose em linfócitos já nos tempos precoces de infecção, que pode favorecer a progressão da infecção, por ocorrer principalmente em células esplênicas antígenos reativas. Nossos dados sugerem ainda, que a imunossupressão não é decorrente da dicotomização da produção de citocinas Th1 e Th2 / Hamsters infected by Leishmania (L.) chagasi are considered one of the most remarkable models to study several characteristics related to immunosuppression, raised during active visceral leishmaniasis especially because hamsters show similar clinical manifestations as it is found in humans without surmounting the infection. In this study, hamsters infected intraperitoneally with 2x107 parasites were used to evaluate the possible factors involved in the dynamic of immunosuppression that occurs during the disease development. The evaluated parameters were the production of Th1 and Th2 cytokines profile, nitric oxide production of splenic cells and detection of apoptosis in splenic lymphocytes at early (6,20, 48 e 72 hours), intermediate (7 e 15 days) and late times (30 e 60 days) of infection. Initially, we evaluate the parasite load in the spleen and observed a progressive increase dependent on the time of infection, ratifying that infected hamsters are good models to set up the disease development. Cellular response upon mitogen or Leishmania antigen was the parameter used to evaluate the immunosuppression showing a preserved response to concanavalin A at all period of infection and a preserved response to the Leishmania antigen at all early phases however with no specific antigen response from 7 day of infection until the late phase of infection. Nitric oxide quantification was determined in the splenic cells supernatant in culture stimulated upon concanavalin A and Leishmania antigen and we observed initially low level of nitric oxide production, measured by the Griess method. Nonetheless, when the cells were stimulated upon Leishmania antigen we observed a lower level nitric oxide production at 48 and 72 hours of infection. mRNA of Th1 e Th2 cytokines profile was determined by RT-PCR at all period of infection studied in infected or non infected hamsters showing no difference at the cytokine profile in this experimental model. Detection of apoptosis in the non adherent splenic cells (probably T lymphocytes) ex-vivo and in the stimulated culture with concanavalin A and Leishmania antigen was evaluated by the following methods: annexin V-FITC, cleaved caspase 3 and TUNEL by flow cytometry analysis. There was phosphatidilserine staining by annexin method, at 6 hour of infection when cells were stimulated by mitogen or Leishmania antigen at 48 hours and 60 days of infection only when stimulated by Leishmania antigen. Splenic cells in culture stimulated by concanavalin A showed no cleaved caspase 3 staining in all period of infection studied. Otherwise, apoptosis was detected in the ex-vivo splenic cells at 20, 48 and 72 hours of infection by cleaved caspase 3 staining. We observed a low DNA break staining of non adherent splenic cells in all period analyzed, although this staining was increased in non adherent cells stimulated upon Leishmania antigen at 20 hours from 7 day of infection until 60 day of infection. Our results suggest that a visceral leishmaniasis immunosuppression in the hamsters model infected by Leishmania (L.) chagasi is antigen dependent and sets up in the intermediate phases of infection from 7 days on. This immunosuppression seems to be related to the apoptosis increase in lymphocytes already in the early period of infection probably favoring its progression especially because of its occurrence in reactive splenic antigen. Our data also suggest that the immunosuppression is not provided by dichotomization in the Th1 and Th2 cytokines profile

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6314_1.pdf: 1402240 bytes, checksum: 3a6b521eb7d3cff5b8fb4e3b2347a3ec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Protozoários flagelados do gênero Leishmania são transmitidos para mamíferos através da picada de insetos flebotomíneos e são os agentes etiológicos das quatro formas clínicas de leishmanioses: leishmaniose visceral que é fatal quando não tratada, leishmaniose mucocutânea, leishmaniose cutânea e a leishmaniose cutânea difusa. A leishmaniose visceral é comum em países em desenvolvimento, com uma estimativa de 500.000 novos casos a cada ano. A Leishmania chagasi é o agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas e outras espécies são responsáveis pela forma visceral da doença no Velho Mundo. Devido sua importância, o desenvolvimento de drogas e vacinas usando antígenos do parasito têm sido o alvo de muitos estudos. Entre os maiores antígenos do parasito estão as proteínas de choque térmico (HSP), a maior classe de proteínas conservadas, classificadas como chaperonas. Elas são essenciais no controle do ciclo celular e estão envolvidas na assistência ao dobramento e prevenção de reações irreversíveis tais como agregações inespecificas de proteíans celulares. As HSP possuem um papel importante com agente imunoregulatório com potente uso terapeutico; ademais elas foram identificadas como os maiores imunógenos em várias doenças infecciosas e que estimulam uma resposta específica protetora. A HSP83, ortóloga a HSP90 de mamíferos, é uma das proteínas de Leishmania mais abundantes e é reconhecida pela resposta imune humoral e celular em humanos e em cães com leishmaniose visceral. Neste estudo, baseado em alinhamentos, a estrutura primária da HSP83 de Leishmania chagasi foi comparada a HSP90 de outros organismos, para investigação de suas relações filogenéticas. Quando a seqüência de aminoácidos foi alinhada às seqüências depositadas no banco de genes públicos, ficou evidente que a proteína é extremamente conservada mesmo em organismos pertencentes a diferentes reinos. Quando a seqüência codificante foi comparada, foi possível mapear rigorosamente os exons do gene humano, exceto pela presença de três gaps. O primeiro gap corresponde a uma alça flexível entre duas folhas beta, o segundo tem 57aa (o maior gap), compreende o domínio N-terminal correspondendo ao sítio de ligação de ATP e o último gap, que corresponde também a uma alça flexível entre o domínio central e o domínio carboxi. O aumento da divergência na seqüência é coincidente com as regiões equivalentes as junções dos exons na proteína ortóloga de mamíferos. Nossos resultados sugerem que o gene da HSP83 dos organismos ancestrais aos Kinetoplastida tinha introns, e que foram perdidos durante a evolução.

Orientadores: Yuji Takahata, Rogerio Custodio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T14:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_KesleyMoraesGodinhode_D.pdf: 5766531 bytes, checksum: 5d60e17b9a5062a054d9bb7de66054f4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objeto de estudo desta tese é a forma mais severa e letal de Leishmaniose: a Leishmaniose Visceral, LV, cujo principal agente etiológico é a espécie Leishmania donovani. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de modelos Quantitativos das Relações Estrutura-Atividade para duas séries de compostos com atividade antileishmaniose contra formas amastigotas de Leishmania donovani. A primeira série envolve vinte e um análogos de nucleosídeos pirazolo-pirimidínicos e a segunda série compreende oito antifúngicos. Para garantir a robustez dos modelos, além dos compostos que compõem as respectivas séries, foram selecionadas moléculas com conhecida atividade contra LV para compor um conjunto de teste e avaliar a capacidade de previsão dos respectivos modelos. Para a série dos nucleosídeos foram desenvolvidos modelos de regressão logística e árvore de classificação. Em ambas as abordagens os descritores Mor26v e o GAP(HOMO, HOMO-1) se mostraram relevantes para a explicação da atividade leishmanicida destes compostos. O modelo de regressão logística atingiu 90,5% para acurácia de classificação para o conjunto de trabalho e 58% para o conjunto de teste após a análise do domínio de aplicabilidade do modelo. O modelo para árvore de classificação alcançou 95% para acurácia de classificação para o conjunto de trabalho e 83% para o conjunto de teste. Para a série dos antifúngicos foi utilizado um modelo de regressão linear múltipla onde a energia eletrônica e a área da superfície polar se mostraram importantes para a atividade leishmanicida da série. Os valores previstos exibem 98% de correlação com os valores experimentais. Os valores encontrados para o conjunto de teste também estão de acordo com a literatura. Finalmente, novos compostos foram propostos para síntese e avaliação da atividade leishmanicida. / Abstract: The object of study of this thesis is the most severe and lethal form of leishmaniasis: visceral leishmaniasis, LV, whose main etiological agent is the species Leishmania donovani. The goal of this work is the development of Quantitative Structure-Activity Relationship models for two series of compounds presenting antileishmanial activity against amastigotes of Leishmania donovani. The first series includes twenty-one analogues of pyrazolo-pyrimidine nucleosides and the second series comprises eight antifungals. To ensure the robustness of the models, in addition to the compounds that make up their series, molecules with known activity against LV were selected to compose a testset and evaluate the predictive power of their models. For the series of nucleosides logistic regression models and tree classification were developed. In both approaches, the Mor26v and GAP(HOMO, HOMO-1) descriptors were relevant to explain the leishmanicidal activity of these compounds. The logistic regression model reached 90.5% for classification accuracy to the workingset and 58% for testset after analysis of the domain of applicability of the model. The classification tree model reached 95% for classification accuracy of the workingset and 86% for the testset. A multiple linear regression model was applied to the series of antifungal agents. The electron energy and polar surface area were important for the leishmanicidal activity of this series. The predicted values showed 98% of correlation with the experimental values. The values found for the testset are also in agreement with the literature. Finally, new compounds were proposed for synthesis and evaluation of leishmanicidal activity. / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências