La technologie iPSC (induced pluripotent stem cells) permet l’obtention d’une source cellulaire illimitée pour la modélisation et la thérapie de maladies génétiques, la médecine régénérative, l’étude pharmacologique et récemment la modélisation et l’étude du cancer. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est la pathologie modèle du concept de « cellule souche cancéreuse » : des cellules souches LMC (CS-LMC) s’avèrent résistantes aux inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK), traitement conventionnel de ce syndrome myéloprolifératif. Elles sont responsables de la persistance d’une maladie résiduelle et de rechutes lors de l’interruption du traitement. Malheureusement, leur isolement est difficile. Nous proposons dans ce travail de modéliser les CS-LMC par les iPSC LMC. Nous montrons pour la première fois dans les iPSC LMC que BCR-ABL1 réprime l’expression des facteurs clés de la pluripotence (OCT4,NANOG, le cluster miR302-367) via les kinases ERK1/2. Les ITK, en bloquant l’activité deBCR-ABL1, entraîne une hausse des niveaux d’expression de ces marqueurs. L’effet « prosouche» des ITK, découvert dans les iPSC LMC, est également observé lors du traitement de CS-LMC primaires. L’agent thérapeutique pourrait ainsi, en maintenant ou renforçant le compartiment LMC immature, participer paradoxalement à la persistance de la maladie résiduelle. Étonnamment, les ITK augmentent également l’expression des marqueurs« souches » dans les iPSC et CS hématopoïétiques normales. Ce résultat suggère un effet« pro-souche » généralisé à plusieurs types cellulaires. / IPSC (induced pluripotent stem cells) offer renewable source of biologically relevant human cells for genetic diseases modelling and therapy, regenerative medicine, pharmacological study and, recently, cancer research. The proof of « cancer stem cell concept » was established in chronic myeloid leukemia (CML) : CML stem cells (CML-SC) are resistant to treatment (tyrosine kinase inhibitors (TKI)). They are involved in residual disease persistence and relapse when treatment is discontinued in the majority of patients. We modelled CML-SC with CML iPSC. We showed, for the first time, that BCR-ABL1 acts as a repressor of key stemness markers (OCT4, NANOG, miR302-367 cluster) via ERK1/2 in human CML iPSC. By blocking BCR–ABL1 activity, TKI increase pluripotency gene expression. Interestingly, a similar pro-stemness effect was observed during CML-SC treatment. By inducing a more primitive stemness phenotype, TKI could promote residual disease and relapse. Interestingly, an increase of stemness gene expression was also observed during TKI treatment of healthy cells (iPSC and hematopoietic stem cells). These data suggest a global TKI pro-stemness effect in other stem cell types.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec dysplasie, identifiées par la classification OMS 2008 sous le nom de LAM-MRC (« AML with myelodysplasia-related changes »), sont actuellement définies par la présence de critères cliniques, cytologiques et cytogénétiques. Elles forment un groupe hétérogène tant sur le plan biologique que pronostique. Nous avons fait l'hypothèse que la caractérisation moléculaire des LAM-MRC pourrait permettre d'identifier des marqueurs spécifiques associés à ces pathologies et d'en distinguer différents sous-groupes. Nous avons mis en évidence que les LAM-MRC de risque cytogénétique intermédiaire présentent un profil mutationnel spécifique caractérisé par un taux élevé de mutation d'ASXL1 et une faible proportion de mutations de DNMT3A, NPM1 et FLT3. Les LAM-MRC de risque cytogénétique défavorable, essentiellement complexes et/ou monosomales, sont quant à elle associées aux mutations de TP53. Alors que les critères actuels des LAM-MRC ne permettent pas d'en stratifier le pronostic, nous avons montré que les mutations d'ASXL1 ou de TP53 sont des facteurs pronostics péjoratifs majeurs. Ainsi, une reclassification basée sur la présence de ces altérations moléculaires exclusives entre elles permettrait d'affiner le diagnostic et la stratification pronostique de ces maladies. Enfin, dans une stratégie de médecine personnalisée combinant le séquençage à haut débit à des tests de sensibilité thérapeutique in vitro, l'identification de tels marqueurs moléculaires permettraient de prédire la réponse aux traitements, de guider les choix thérapeutiques et d'orienter le développement de nouvelles drogues. / Acute myeloid leukemia (AML) with myelodysplasia-related changes (AML-MRC) as reported in the WHO 2008 classification are defined by the presence of clinical, morphological and cytogenetic criteria. AML-MRCs are heterogeneous diseases with prognostic heterogeneity. We hypothesized that molecular characterization of AML-MRC could identify specific molecular markers and disease subgroups. We showed that AML-MRCs with intermediate cytogenetic risk harbor a specific mutational profile characterized by a high frequency of ASXL1 mutations and a low incidence of DNMT3A, NPM1 and FLT3 mutations. Unfavorable cytogenetic risk AML-MRCs, especially due to complex and/or monosomal karyotypes, are associated with TP53 mutations. While WHO criteria do not stratify the prognosis of AML-MRC patients, we showed that the mutations of ASXL1 or TP53 are major poor prognostic factors. The criteria defining AML-MRC do not identify distinct clinical and biological subgroups and do not predict outcome of patients with AML-MRC. In contrast, ASXL1 and TP53-mutated AML identify two distinct biological subgroups of AML-MRC with very poor outcome. This molecular characterization could be useful to redefine AML-MRC in a future classification aiming at merging biological characterization and specific prognostic value. Finally, we showed that a personalized treatment approach combining next generation sequencing and in vitro drug screening could be useful to predict therapeutic response and to guide both treatment choices and new targeted drug developments.

Mon travail de thèse consistait à caractériser le rôle de la protéine TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma) dans l’hématopoïèse adulte. L’hématopoïèse est un processus actif, ordonné, et hautement régulé faisant intervenir des étapes de prolifération, de différenciation et d’apoptose et permettant la production de toutes les cellules sanguines matures à partir d’un nombre restreint de cellules souches hématopoïétiques. La dérégulation des mécanismes intervenant dans l’hématopoïèse induit le développement d’hémopathies, notamment de leucémies. Les souris nullizygotes pour Tif1γ meurent au cours de l’embryogenèse du fait de graves défauts du développement. Afin d’étudier le rôle de Tif1γ dans l’hématopoïèse murine, et plus particulièrement sa contribution au développement et à la différenciation des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, nous avons généré des souris déficientes pour Tif1γ uniquement dans les cellules hématopoïétiques. Nous avons observé que Tif1γ agit en tant que gène suppresseur de tumeur dans ces cellules. Nous avons aussi démontré que Tif1γ est un régulateur clef du devenir des cellules souches hématopoïétiques chez les mammifères. Nous avons mis en évidence que, chez les souris âgées, la délétion de Tif1γ provoque l’apparition d’un syndrome myéloprolifératif dysplasique, ressemblant fortement au phénotype de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) humaine. De façon intéressante, nous avons identifiéé que plus de 40% de patients atteints de cette pathologie présentent un faible taux de TIF1γ. La décitabine, molécule hypométhylante utilisée en thérapeutique, permet le rétablissememnt d’une expression normale de TIF1γ. Chez certains patients, nous avons corrélé la diminution de l’expression de TIF1 avec l’hyperméthylation de l’ADN et un patron spécifique de modifications d’histones (acétylations et méthylations) sur le promoteur du gène TIF1γ. Ces résultats suggèrent une signature épigénétique spécifique de la leucémie myélomonocytaire chronique sur le promoteur de TIF1γ. L’ensemble de nos données indiquent donc que TIF1γ est un gène suppresseur de tumeur régulé épigénétiquement dans les cellules hématopoïétiques. / My thesis deals with the characterization of the role of the protein TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma) in adult hematopoiesis. Hematopoiesis is an active process, orderly and highly regulated, using proliferation, differentiation and apoptosis steps, and allowing the production of mature blood cells from a restricted number of hematopoietic stem cells. Deregulation of mechanisms involved in hematopooiesis leads to the development of leukemias. Tif1γ knockout mice die during embryogenesis with severe development defects. In order to study the role of Tif1γ in murine hematopoiesis, and more particularly its contribution to hematopoietic stem and progenitor cells development and differentiation, we generated hematopoietic Tif1γ deleted mice. We showed that Tif1γ functions as a tumor suppressor gene in hematopoietic cells. Moreover, we identified Tif1γ as a key player in the commitment of mammal hematopoietic stem cells. In ageing mice, we demonstrated that the Tif1γ deletion leads to a myeloproliferative and myelodysplastic syndrome, phenotypically very close to the human chronic myelomonocytic leukemia (CMML). We also identified a very low level of TIF1γexpression in the monocytes of 40% CMML patients. Decitabine, a hypomethylating molecule used in CMML therapy, allows the restoration of a normal TIF1γ expression. In some patients, we have highlighted the correlation between the low expression of TIF1γ, the DNA hypermethylation and a specific pattern of histone modifications (acetylation and methylation) on TIF1γ gene promoter. These results suggest a specific epigenetic signature of the disease on this promoter. Taking together, our data indicate that TIF1γ is a tumor suppressor gene, epigenetically regulated in hematopoietic cells.

La sous-famille BTN3A comprend 3 isoformes : BTN3A1, A2 et A3. Le domaine intracellulaire B30.2 de BTN3A1 est impliqué dans la reconnaissance du Phosphoantigène (Pag) et l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2(LTVγ9Vδ2). BTN3A2, dépourvue de B30.2, pourrait être un récepteur-leurre. L’anticorps monoclonal (Acm) 20.1 reconnaît les trois isoformes de BTN3A et sensibilise les tumeurs à la lyse par les LTVγ9Vδ2, mimant l’action des Biphosphonates (N-BP). Nous avons étudié l’expression, la régulation et le ciblage de BTN3A en contexte d’hémopathie maligne et de tumeur solide. Nous avons montré que BTN3A2 est l’isoforme majoritairement exprimée par les blastes de Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) primaire. Cependant, l’Acm 20.1 sensibilise les blastes de LAM primaire à la lyse par les LT Vγ9Vδ2, même ceux résistants aux N-BP. Cet effet est confirmé dans des souris NOD-SCID-γcKO xénogreffées avec la lignée U937 ou des blastes primaires. Nous avons ensuite montré l’expression de BTN3A sur des lignées et des tumeurs pancréatiques primaires et observé qu’elle est associée au pronostic chez les patients atteints de cancer du pancréas. L’expression de BTN3A2, isoforme majoritairement exprimée augmente en contexte de stress cellulaire hypoxique et métabolique. La faible expression de BTN3A1 comparativement à BTN3A2 et le clivage des BTN3A pourraient favoriser l’échappement tumoral à la reconnaissance par les LT Vγ9Vδ2. Cependant, les LT Vγ9Vδ2 ont des fonctions cytolytiques préservées en hypoxie. Le ciblage de BTN3A par l’Acm 20.1 sur les tumeurs étudiées, en restaurant la lyse par les LT Vγ9Vδ2, offrirait des perspectives thérapeutiques notamment pour les tumeurs chimiorésistantes. / BTN3A subfamily comprises three isoforms: BTN3A1, A2 and A3. The B30.2 intracellular domain of BTN3A1is involved in Phosphoantigen recognition and Vγ9Vδ2 T cells activation. BTN3A2, devoid of B30.2 domain, could be « a decoy receptor ». The agonist anti-BTN3A monoclonal Antibody (mAb) 20.1 recognizes the three BTN3A isoforms and sensitizes tumors to Vγ9Vδ2 T cell lysis. This mAb mimics the effect of Aminobisphosphonates (N-BP). We studied BTN3A expression, regulation and targeting in tumors of hematological and solid origin. We showed that primary Acute Myeloïd Leukemia (AML) blasts express BTN3A with a main expression of BTN3A2. However, the 20.1 mAb sensitizes primary AML blasts to Vγ9Vδ2 T cell lysis even N-BP-poorly sensitive blasts. This was confirmed in NOD-SCID-γc KO mice xenografted with U937 human cell line or primary blasts. Next, we have demonstrated BTN3A expression in pancreatic cell lines and primary tumors. We observed that BTN3A is associated to prognosis in patients with pancreatic cancer. BTN3A2 is the most highly expressed isoform and its level of expression increases upon hypoxic and metabolic cellular stress. The weak expression of BTN3A1 compared to BTN3A2 isoform together with BTN3A molecules shedding could constitute an immune escape mechanism of tumor cells from Vγ9Vδ2 T cells recognition. Though, Vγ9Vδ2 T cells have preserved cytotoxic functions under hypoxic condition. BTN3A targeting with anti-BTN3A 20.1 mAb on the tumors we studied would open new therapeutic perspectives notably in chemoresistant tumors, thanks to the restoration of Vγ9Vδ2 T cell lysis.

Les leucémies chroniques à éosinophiles sans autre spécification (CEL,NOS) sont des néoplasmes myéloprolifératifs rares caractérisés par une hyperéosinophilie (HE) clonale. Avec 12 cas décrits, la translocation t(5;12)(q31;p13), différente de la translocation t(5;12)(q32;p13) ETV6-PDGFRB classique, semble être récurrente de cette entité. Peu étudiée, sa leucémogenèse reste non élucidée.L’objectif de ce travail était la caractérisation génomique et transcriptomique de ce remaniement afin d’en comprendre la physiopathologie.L’étude FISH sur cellules triées réalisée confirmait l’HE clonale, et indiquait un avantage sélectif semblant limité aux polynucléaires éosinophiles (PNE), puisque d’autres cellules, également porteuses de la translocation, ne proliféraient pas.Un transcrit de fusion ETV6-FNIP1, jamais décrit, différent des transcrits ETV6-ACSL6 habituellement observés, a été retrouvé dans le cas d’étude. La non récurrence d’un transcrit fonctionnel commun entre les cas était en défaveur de leur implication dans la leucémogenèse par l’apport d’une nouvelle fonction.ETV6 et ACSL6 étaient constamment impactés par le réarrangement, soit par formation d’un transcrit, soit par délétion comme dans le cas d’étude. Leur diminution d’expression, en l’absence de second événement, témoignait de l’haploinsuffisance de ces gènes suppresseurs de tumeurs.Par l’étude d’une cohorte de 39 patients avec HE, nous avons montré une dérégulation spécifique d’IL-3 dans la translocation t(5;12)(q31;p13), sans atteinte d’IL-5 ni de CSF2 (GM-CSF), cytokines impliquées dans l’éosinopoïèse. Des séquences conservées situées dans l’intron 2 d’ETV6 et en aval de l’exon 11 d’ACSL6 pourraient être responsables de cette dérégulation.Sans autre anomalie spécifique retrouvée, la translocation t(5;12)(q31;p13) constitue l’évènement oncogénique principal de ces cas. Parmi les mécanismes étudiés, plusieurs, sinon tous, pourraient être nécessaires au développement de la maladie. / Chronic eosinophilic leukemias not otherwise specified (CEL, NOS) is a rare myeloproliferative neoplasm characterized by clonal eosinopoiesis. In this setting, we studied a patient with a t(5;12)(q31;p13) which differs from the usual t(5;12)(q32;p13) ETV6-PDGFRB translocation. In this rare translocation (11 similar examples so far described in the litterature), mechanisms driving leukemogenesis still need to be investigated.The aim of this study was the genomic and transcriptomic characterization of this translocation in order to understand its pathophysiology.Triaged FISH study confirmed clonal HE, and suggested a specific advantage limited to eosinophils, since other nonproliferative cells also carried the translocation.A novel ETV6-FNIP1 fusion transcript hitherto never described was found. This transcript was different from the usual out-of-frame ETV6-ACSL6 transcripts, and no common functional transcript was observed among the published cases. The implication of these transcripts seems unlikely.ETV6 and ACSL6 are constantly impacted by rearrangement, either by a fusion transcript or by deletion as in the case study. Their underexpression, in the absence of a second hit, support the haploinsufficiency of these tumor suppressor genes.By studying a cohort of 39 patients with HE, we show a deregulation of IL-3 in the t(5;12)(q31;p13) translocation, without deregulation of IL-5 or CSF2 (GM-CSF), cytokines involved in eosinopoiesis. Conserved sequences in ETV6 intron 2 and downstream of ACSL6 exon 11 may be responsible for this deregulation.The t(5;12)(q31;p13) constitues the main oncogenic driver. From the mechanisms studied, many, if not all, may be associated for the development of the disease.

Notre groupe a montré que l’hypoxie sévère (0.1% O2) induit un arrêt du cycle cellulaire en G0 des cellules humaines CD34+ et des cellules murines FDCP mix. Peu d’études ont exploré l’existence de Cellules Initiatrices de Leucémie (CIL) dans les LAL et leur rôle dans les rechutes. Notre projet s’est focalisé sur l’effet de l’hypoxie sévère sur la quiescence des CIL dans les LAL, qui pourrait être responsable d’un pourcentage de rechutes. En effet dans la niche hématopoïétique, ou sont localisées les Cellules souches hématopoïétiques et probablement les CIL, la concentration d’oxygène avoisinerait 0,1%.Nous avons utilisé la lignée de LAL NALM6 pour explorer les effets de l’hypoxie sévère sur leur survie, leur cycle cellulaire et leur chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence qu’une culture à 0.1% O2 durant 7 jours de la lignée NALM6: - inhibe leur prolifération sans surmortalité, - révèle une population restreinte de CIL quiescentes et chimiorésistantes capables d’induire une leucémie dans des souris. Nous avons recherché les relations entre l’hypoxie sévère et quelques caractéristiques des cellules primaires de patients atteints de LAL : existence et rôle de CIL résistantes à l’hypoxie et aux agents thérapeutiques conventionnels des LAL ; localisation de ces cellules résiduelles dans la moelle osseuse des souris xénogreffées. Nos résultats suggèrent que certaines rechutes de LAL pourraient être dues à la persistance à long terme de « quiescent/dormant » CIL dans les niches hypoxiques de la moelle osseuse. Ce modèle est intéressant pour explorer les mécanismes in vitro et in vivo de chimiorésistance dans les LAL et le rôle de l’environnement dans ce phénomène. / Our group showed that severe hypoxia (0.1% O2) induces G0 cell-cycle-arrest of human CD34+ cells and of murine FDCP-mix Cells. Few studies explored the existence of quiescent Leukemia Initiating Cells (LIC) in ALL and their role in primary chemoresistance and relapses. Our project is focused on the effect of very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent LIC in ALL, that could be responsible of a percentage of relapses. Indeed in bone marrow niches, where hematopoietic stem cells and probably LIC are located, the O2 concentrations are below 0.1%.In the present study we used the NALM-6 ALL cell line to explore the effects of culture at 0.1% O2 on their survival, cell cycle and chemoresistance. Our results evidence that a 7 days culture of NALM-6 cells at 0.1% O2: - inhibits their proliferation without major cell death; - reveals a restricted LIC population of quiescent and chemoresistant LIC; - maintains quiescent chemoresistant LIC that induce leukemia when injected in immunodeficient mice. We investigated the relationships between severe hypoxia and some characteristics of ALL primary cells obtained from patients: existence and role of quiescent chemoresistant LICs in ALL relapses; location of these residual cells inside the bone marrow of engrafted mice. Our results suggest that some ALL relapses could be due to the long term persistence of “quiescent / dormant” LIC in hypoxic bone marrow niches. This model is of interest for exploring the in vitro and in vivo (xenograft) mechanisms of chemoresistance in ALL and the role of the bone marrow environment in this phenomenon.

La caractérisation des tumeurs malignes et la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux sont essentielles pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Les criblages génétiques, devenus encore plus puissants avec la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, le séquençage nouvelle génération et la bioinformatique, sont des outils formidables pour décrypter de nouveaux mécanismes cellulaires, dont la résistance au traitement. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif qui est caractérisé par l’anomalie génétique t(9;22). Cette aberration chromosomique est à l’origine du gène de fusion BCR-ABL1 qui code l’oncogène du même nom responsable de la prolifération anarchique des cellules. L’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, élimine de manière spécifique les cellules leucémiques en ciblant et en bloquant l’activité kinase de cette protéine. Malheureusement, comme pour tout type de thérapie ciblée, une résistance au traitement survient chez certains patients. Afin de repérer des nouvelles voies de résistance à cet inhibiteur de tyrosine kinase, nous avons effectué un criblage génétique avec la librairie « genome-scale CRISPR knock-out » (GeCKO v2) in vitro dans la lignée cellulaire K562. Nous avons découvert plusieurs gènes qui semblent être essentiels pour la réponse au traitement par imatinib, tels que les facteurs pro-apoptotiques BIM et BAX, ou le répresseur de la voie des MAPK, SPRED2. Le rétablissement spécifique de l’apoptose dans les cellules BIM knock-out (KO) par des BH3-mimétiques, ou l’inhibition ciblée de la voie MAPK dans la lignée SPRED2 KO sensibilise de nouveau les lignées résistantes. Dans ce travail, nous avons découvert des mécanismes de résistance déjà connus (l’apoptose, la voie MAPK…) mais nous avons également démontré l’implication de voies peu connues telles que le complexe Mediator, la maturation de ARNm et l’ubiquitinylation de protéines. Spécifiquement cibler ces lésions génétiques avec des thérapies ciblées combinées peut permettre de surmonter les phénotypes de résistance et ouvre la porte à l’utilisation de l’oncologie de précision. / The characterization of malignant tumour growth and the understanding of resistance mechanisms to treatment in cancer is of utmost importance for the discovery of novel “druggable” targets. Efficient genetic screening, now even more possible with the convergence of CRISPR-Cas9 gene editing technology, next-generation sequencing and bioinformatics, is an important tool for deciphering novel cellular processes, such as resistance to treatment in cancer. Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterised by the t(9;22) genetic abnormality, which encodes the driver of CML, the BCR-ABL1 fusion protein. Imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, specifically eliminates CML cells by targeting and blocking the kinase activity of this protein, yet, as for all targeted therapies in cancer, resistance to treatment exists. In order to discover alternative BCR-ABL1 independent mechanisms of imatinib resistance, we utilized the genome-scale CRISPR knock-out library GeCKO v2 to screen for imatinib sensitising genes in vitro on K562 cells. We revealed genes that seem essential for imatinib induced cell death, such as pro-apoptotic genes (BIM, BAX) or MAPK inhibitor SPRED2. Specifically re-establishing apoptotic capabilities in BIM knock-out (KO) cells with BH3-mimetics, or inhibiting MAP-kinase signalling in SPRED2 KO cells with MEK inhibitors restores sensitivity to imatinib, overcoming resistance phenotypes. In this work, we discovered previously identified pathways (apoptosis, MAP-kinase signalling) and novel pathways that modulate response to imatinib in CML cell lines, such as the implication of the Mediator complex, mRNA processing and protein ubiquitinylation. Targeting these specific genetic lesions with combinational therapy can overcome resistance phenotypes and paves the road for the use of precision oncology.

Les leucémies sont une famille de cancers issus de la prolifération maligne des cellules hématopoïétiques. La leucémie myéloïde aigüe (AML) représente 30% des leucémies chez les adultes et menace surtout les personnes âgées de 64 ans et plus. Actuellement, la chimiothérapie est la méthode principale de prise en charge de l’AML, mais celle-ci comporte des effets secondaires importants ainsi qu’un risque de récidive qui freinent son développement. Le redéploiement de molécules déjà utilisées pour d’autres maladies est une stratégie émergente dans le traitement du cancer. Par exemple, la chlorpromazine (CPZ), un antipsychotique, démontre une activité contre les lignées cellulaires issues d’AML, mais son activité au niveau du système nerveux central entraine des effets indésirables. Compte tenu de l’activité de CPZ contre les cellules leucémiques, nous avons mis au point un système de vectorisation des médicaments original pour le traitement de l’AML. La CPZ est d’abord incluse dans une cyclodextrine (CD) : molécule cage à base de glucose et ce complexe est ensuite encapsulé dans un liposome : vésicules à contenu aqueux délimitées par une ou plusieurs bicouches phospholipidiques. Ce système de “drug-in-CD-in-liposomes” (DCL) est conçu pour circuler longtemps dans le sang après injection intraveineuse mais ne pas passer la barrière hémato-encéphalique (BHE).Il a été nécessaire d’optimiser la formulation avec ses trois composants principaux : CD, CPZ et phospholipides. Ainsi, une évaluation physico-chimique approfondie a été réalisée pour les interactions CD/CPZ, CD/phospholipides et CPZ/phospholipides. La calorimétrie de titration isotherme (ITC) a permis de déterminer la stœchiométrie et la constante d’association pour les complexes d’inclusion CD/CPZ, démontrant les associations les plus importantes avec la Sugammadex ou la SBE-β-CD. La spectroscopie RMN 2D ROESY a mis en évidence des géométries d’inclusion différentes selon la taille et le type de substitution des CDs. Par ailleurs, l’inclusion de la CPZ dans les CDs accélère légèrement la photodégradation de l’antipsychotique. Quant à l’interaction CD/phospholipides, la SBE-Et-β-CD déstabilise les liposomes multilamellaires (MLVs) composés de palmitoylstearoylphosphatidylcholine (PSPC) pour des concentrations supérieures à 25 mM, tandis que les autres CDs sont sans effet. En outre, des études de turbidité ont démontré que les liposomes unilamellaires (SUV) ne sont pas perturbés en présence de la plupart des CDs. Une étude de l’interaction entre CPZ et PSPC a démontré que la quantité maximale qu’il est possible d’encapsuler était égale à 3,75 mol%. Par la suite, des DCL contenant CPZ ont été préparés par la méthode « dehydration-rehydration vesicles » (DRV) mais le pourcentage du principe actif encapsulé (EE) s’avérait faible (environ 10%). Ainsi la méthode DRV combinée à l’utilisation d’un gradient de concentration de sulfate d’ammonium a été mise en œuvre, ce qui a permis d’augmenter l’EE à 27% tout en gardant une taille compatible avec l’administration IV. Par la suite, la cytotoxicité de ces formulations a été évaluée sur 4 lignées cellulaires humaines issues d’AML (HL-60, MOLM13, MV4-11 and OCI-AML). Les liposomes contenant la CPZ ont tous démontré un effet cytotoxique tandis que les liposomes vides avaient tendance à stimuler la croissance cellulaire et les CD seules étaient sans effet. Pourtant, l’activité des DRVs avec CD était inférieure à celle des DRV/CPZ, selon l’ordre suivant : DRV-SGM/CPZ < DRV-SBE-β-CD/CPZ < DRV-HP-γ-CD/CPZ. L’activité était inversement proportionnelle à la constante d’affinité, suggérant une libération retardée. Cette hypothèse a été confortée par le fait que l’activité des DRV CD/CPZ était plus importante après une exposition de 72h qu’après 24h.Ces résultats sont prometteurs pour la mise au point de systèmes à libération contrôlée de CPZ pour le traitement d’AML. / Leukemia is a group of cancers caused by malignant clonal proliferation of hematopoietic stem cells. Accounting for 30% of all leukemias in adults, acute myeloid leukemia (AML) is especially a threat for older people with a median age of 64 years. Presently, chemotherapy is the main therapeutic method for AML but severe side-effects and possibility of relapse have hampered its development. “Repurposing” of drugs used in other diseases is a current trend for the treatment of cancer. For example, chlorpromazine (CPZ), a widely used anti-psychotic drug, shows effective activity in AML cell lines, but can also cause side effects in the central nervous system.Basing on the inhibiting capability of CPZ against leukemia-related cell lines, we have designed and developed a novel nanometric drug delivery system for AML treatment. CPZ is first entrapped in the hydrophobic internal cavity and forms inclusion complexes with cyclodextrin (CD), a cask-like molecule composed of glucose units, then the CD/CPZ inclusion complexes are encapsulated in liposomes, phospholipid vesicles consisting of a series of lipid bilayers enclosing aqueous compartments. The “drug-in-CD-in-liposomes” (DCL) system provides a promising strategy which is capable of achieving long circulation time in the blood after intravenous administration while circumventing the blood-brain barrier (BBB). It was necessary to optimize the formulation for its three main components: CD, CPZ and phospholipid. Therefore, a comprehensive physicochemical investigation of the interaction between CD/CPZ, CD/lipid and CPZ/lipid was performed. Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to obtain the stoichiometry and association constant of the CPZ-CD inclusion complexes, showing that sugammadex and SBE-β-CD has the highest complexation ratio. 2D ROESY NMR revealed different inclusion processes depending on the size and chemical modification of CDs. Photodegradation experiments indicated that CDs can slightly accelerate CPZ's photodegradation. As far as liposome stability was concerned, SBE-Et-β-CD was found to have an obvious interaction with palmitoyl stearoyl phosphatidylcholine (PSPC) multilamellar liposomes (MLVs) above 25 mM, while the other CDs were without effect. However, turbidity measurements indicated that small unilamellar liposomes (SUVs) remain intact in presence of CDs. A study of the interaction between CPZ and PSPC showed that the maximum proportion of CPZ that could be incorporated into the lipid membrane was 3.75 mol%. Subsequently, DCL systems containing CPZ was prepared by the dehydration-rehydration vesicles (DRV) method. However, low drug encapsulation efficiency (EE) was obtained (about 10% of added drug). Therefore, an active loading strategy, the ammonium sulphate gradient method, was used in combination with the DRV method. As a result, the EE of CPZ increased to about 27% and yielded liposomal formulations with suitable size for IV administration.Finally, the cytotoxicity of CPZ, CDs, empty liposomes and liposomes containing CD/CPZ complexes was evaluated against a panel of leukemia cell lines. CPZ was found to show a growth-inhibiting effect on the human leukemia cell lines (HL-60, MOLM13, MV4-11 and OCI-AML), while empty liposomes were observed to slightly promote their growth and CDs alone had no significant cytotoxicity. However, a difference in activity was observed with the DRV containing CD/CPZ complexes, which were less active than DRV containing free CPZ, with the order: DRV-SGM/CPZ < DRV-SBE-β-CD/CPZ < DRV-HP-γ-CD/CPZ. The activity was inversely proportional to the formation constant of CD/CPZ complexes obtained by ITC, suggesting a delayed release from the complexes. This was confirmed by varying the exposure time; the activity of DRV CD/CPZ being relatively higher in a longer incubation.These results suggest that the DCL system could provide controlled release of CPZ for the treatment of AML.

Objectifs. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’influence du groupe pronostique auquel le patient est attribué au moment du diagnostic et du protocole de traitement sur le développement d’anomalies dentaires et leur sévérité chez les enfants traités pour la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL). L’étude comporte un objectif secondaire : confirmer les résultats des études précédentes ayant montré un nombre et une sévérité plus élevée d'anomalies dentaires chez le groupe 0-5 ans. Hypothèse. Chez des enfants ayant été traités pour la LAL, la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires seront plus élevées chez ceux ayant fait partie du groupe pronostique de très haut risque, ayant reçu une combinaison de chimiothérapie, de radiothérapie et de greffe de moelle osseuse et ayant eu leur diagnostic avant l’âge de 6 ans. Méthodes. Des patients âgés entre 14 et 25 ans et ayant reçu un diagnostic de LAL avant l’âge de 11 ans ont été recrutés au Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine. Un examen dentaire et radiologique ont été effectués. Des données concernant le diagnostic, le groupe pronostique et le type de traitement reçu ont été notées à partir du dossier médical des participants. Résultats. Des défauts dentaires ont été observés chez 26 (50,98%) des 51 sujets, la microdontie étant l’anomalie la plus prévalente (39,22%). Les participants des catégories haut risque et très haut risque ayant reçu de la chimiothérapie haute dose étaient significativement plus à risque de présenter une anomalie dentaire comparé à ceux de la catégorie risque standard ayant reçu la chimiothérapie conventionnelle (p=0.046). Un âge ≤ 5 ans au diagnostic augmentait significativement la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires (p<0.001). Conclusion. Le traitement de la LAL pédiatrique affecte l’odontogénèse. Le groupe pronostique et le protocole de traitement ont augmenté le risque de développer au moins une anomalie dentaire. L’âge au diagnostic a affecté la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires. / Objective. The main objective of this study is to assess the influence of the risk group to which the patient is assigned at diagnosis and the treatment protocol on the development and severity of dental anomalies in children treated for acute lymphoblastic leukemia (ALL). The secondary aim was to confirm the results of previous studies that showed an increased number and severity of dental defects in children aged 0 to 5 years old at diagnosis. Hypothesis. In children treated for ALL, the prevalence and severity of dental anomalies will be the highest in those who were in the very high risk prognostic group, who received a combination of chemotherapy, total body irradiation and hematopoietic stem cell transplantation and who were diagnosed before the age of 6 years old. Methods. Patients aged between 14 and 25 years old who received diagnosis of ALL before the age of 11 years were recruited at the Sainte-Justine Mother and Child University Hospital Center. Dental and radiographic examinations were performed. Data about the diagnosis, risk group and type of treatment received were collected from medical records. Results. Dental anomalies were recorded in 26 (50.98%) out of 51 subjects and microdontia was the most prevalent dental defect (39.22%). Participants in the high risk and very high risk categories receiving high-dose chemotherapy were significantly more likely to show a dental anomaly compared to those in the standard risk group receiving conventional chemotherapy (p=0.046). Age ≤5 years at diagnosis significantly increased the prevalence of dental anomalies and the severity rating (p<0.001). Conclusion. Therapy for childhood ALL affects the developing dentition. Risk group and treatment protocol influenced the odds of developing at least one dental anomaly. Age at diagnosis affected both the prevalence and severity of dental defects.

Les associations chimioradiothérapies occupent une place importante dans le traitement des cancers. De nouveaux médicaments ciblent spécifiquement la cellule tumorale. Ces thérapies ciblées peuvent agir sur les mécanismes de radiorésistance tumorale et sont prometteuses en association avec la radiothérapie. Le STI571 (imatinib ou Glivec) inhibe spécifiquement l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl. Il entraîne une radiosensibilisation dans la lignée de leucémie myéloïde chronique K562 en agissant sur le cycle cellulaire. Le BIBW2992 est un inhibiteur sélectif d'EGFR et HER2, responsable d'une cytotoxicité et d'une radiosensibilisation des cellules d'adénocarcinome pancréatique BxPC3 et Capan-2, indépendamment de leur statut KRAS. Le mécanisme sous-jacent cette radiosensibilisation n'est pas univoque, faisant intervenir à la fois des modifications du cycle cellulaire et une induction de la mort mitotique. Nos résultats montrent que l'association d'un inhibiteur de tyrosine kinase aux radiations ionisantes peut entraîner une radiosensibilisation in vitro dont les mécanismes sont variables en fonction du type de lignée cellulaire.