Le gène MLL (Mixed-Lineage Leukemia), un homologue du gène trithorax de la Drosophile, localisé à la bande chromosomique 11q23, est fréquemment réarrangé dans plusieurs types de leucémies, essentiellement suite à des translocations chromosomiques. Dans les différentes translocations chromosomiques, la partie N-terminale de MLL est fusionnée avec les séquences d’un gène partenaire. Malgré le grand nombre de partenaires de fusion rapportés, peu de fusions MLL ont été bien caractérisées sur le plan moléculaire. De plus, l’impact pronostique de plusieurs fusions moins fréquentes n’est pas bien établi. L’objectif de mon projet est de caractériser plusieurs translocations MLL qui ont été détectées dans 39 spécimens leucémiques collectés par la Banque de cellules leucémiques du Québec (www.bclq.gouv.qc.ca), et d’établir une corrélation entre les résultats de la cytogénétique et différents paramètres biologiques et cliniques des leucémies respectives. L’identification des gènes partenaires de fusion (GPF) dans notre série (30 échantillons étudiés), a révélé la fusion de MLL à un gène partenaire très récurrent dans 26 leucémies: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; à un GPF modérément commun dans 1 leucémie : MLLT6(AF17); et à un partenaire rare de MLL dans 3 leucémies : GAS7 et AF15/CASC5 (2 cas). Nous avons poursuivi notre travail avec la caractérisation des points de cassure de deux fusions, soit MLL-ELL associée à un syndrome myéloprolifératif (une association rare), et MLL-GAS7 (une fusion rare de MLL), associée à une leucémie aiguë myéloïde. L’analyse des transcrits de fusion par RT-PCR et séquençage a révélé respectivement la fusion de l’exon 9 de MLL à l’exon 2 de ELL et des exons 7 ou 8 de MLL (deux transcrits) à l’exon 2 de GAS7. Ce travail permettra d’effectuer des études fonctionnelles et des projets de recherche translationnelle en utilisant ces spécimens de leucémies avec différents réarrangements de MLL, bien caractérisés sur le plan clinique et moléculaire. / The MLL (Mixed-Lineage Leukemia) gene, a human homolog of the Drosophila trithorax gene, located at chromosomal band 11q23, is frequently rearranged in several types of leukemia, mostly by chromosomal translocations. In different chromosomal translocations, the N-terminal part of MLL is fused to sequences of the partner gene. Despite the large number of fusion partners that have been reported, several gene fusions remain poorly characterized at the molecular level. Moreover, the prognostic impact of less frequent fusions is not well established. The aim of my project is to characterize different MLL fusions detected in 39 leukemic samples, collected by the Quebec Leukemia Cell Bank (www.bclq.gouv.qc.ca) and to correlate cytogenetics with the clinical and biological features of the corresponding leukemia. Identification of fusion partner genes in our series (30 samples studied), revealed fusion of MLL to one of the most frequent partners in 26 leukemias: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; to a moderately common MLL fusion partner in 1 leukemia: MLLT6(AF17); and to a rare partner in 3 leukemias: GAS7 and AF15/CASC5 (2 cases). We have characterized the breakpoints of two fusions, MLL-ELL in a myeloproliferative syndrome (a rare association) and MLL-GAS7 (a rare MLL fusion) associated with acute myeloid leukemia. Fusion transcripts analysis by RT-PCR and sequencing revealed respectively, a fusion of MLL exon 9 to ELL exon 2 and of MLL exon 7 or exon 8 (two transcripts) to GAS7 exon 2. This study is essential to perform functional studies and translational research projects using these well characterized leukemic specimens with different MLL rearrangements.

Par une stratégie de dépistage combinant le caryotype et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), une insertion (X;6) présente chez des jumelles avec une leucémie myéloïde aiguë (LMA) et une translocation (12;13) dans deux cas de LMA et un cas de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) ont été mis en évidence. L’insertion (X;6) n’est pas rapportée et serait un variant de la translocation (X;6) rapportée dans 4 cas de LMA, dont un associe un gène de fusion MYB-GATA1. Nous avons mis en évidence la dérégulation de l’expression de ces gènes dans le cas d’insertion sans la présence de fusion MYB-GATA1. De plus, dans le premier cas de translocation (12;13) identifié, ETV6 serait fusionné à CDX2 ou FLT3. Le deuxième cas associe la délétion des gènes miR-15a et miR-16-1 à une fusion d’ETV6 et le troisième cas impliquerait une fusion ETV6- FOXO1. / By a screening strategy combining standard cytogenetics and fluorescent in situ hybridization (FISH), an insertion (X;6) in twins with acute myeloid leukemia (AML) and a translocation (12;13) in 2 cases of AML and a case of acute lymphoblastic leukemia (ALL) have been identified. Insertion (X;6) is not reported and could be a variant of translocation (X;6) described in 4 cases of AML, one of which is associated with a MYB-GATA1 fusion gene. We have identified the disruption of MYB and GATA1 in the insertion but no MYB-GATA1 fusion seems to be present. Other mechanisms could be in play for the disruption of these genes’ expression. Moreover, in the first case of translocation (12;13) identified, ETV6 is fused to either CDX2 or FLT3. The second case associates the deletion of miR-15a and miR-16-1 genes to an ETV6 fusion. In the third case, an ETV6- FOXO1 fusion seems to be involved.

La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease characterized by frequent rearrangements of the RUNX1 gene located at chromosomal band 21q22. In this subtype of leukemias, t(8;21)(q22;q22) and t(3;21)(q26;q22) translocations are among the most studied rearrangements, being respectively associated with a favourable and poor prognosis. However, approximately half of RUNX1 translocations remain uncharacterized at the clinical and molecular levels at the present time. The main objectives of this thesis are to characterize four novel RUNX1 translocations in adult patients with acute leukemias and to study the expression profiles of specific transcriptional targets of RUNX1 fusions involved in self-renewal or differentiation of hematopoietic cells. Using molecular techniques, we identified CLCA2 and SV2B genes as novel fusion partners of RUNX1 in t(1;21)(p22;q22) and t(15;21)(q26;q22) translocations. We also described the recurrence of the USP42 and TRPS1 genes involved in t(7;21)(p22;q22) and t(8;21)(q23.3;q22) translocations. Chimeric fusion proteins, truncated isoforms of RUNX1, alteration of RUNX1 transcripts expression and overexpression of the fusion partner were possible outcomes of these various fusions, thus demonstrating the diversity of RUNX1 alterations in acute leukemias. Genomic breakpoints of the recurrent RUNX1-UPS42/USP42-RUNX1 and RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 fusions were cloned and analyzed revealing typical signatures of the non-homologous end joining recombination mechanism at fusion junctions. Since variation in the structure and composition of these junctions was observed, we proposed that distinct cellular machineries would be involved in the genesis of these abnormalities. Quantitative real-time PCR was performed on primary leukemic cells expressing these rare RUNX1 fusions. We demonstrated, for the first time, that similar downregulation of CEBPA and upregulation of JUP, an effector of the Wnt pathway, are detected in most samples studied presenting either recurrent or rare RUNX1 fusions. Despite an overexpression of JUP detected in each RUNX1 positive sample studied, other targets of the Wnt pathway like CCND1 and MYC genes were differently expressed in these cells, thus confirming the heterogeneity of this group of leukemias. Our expression data show that similar transcriptional targets, activated or repressed, are detected in cells expressing either chimeric or truncated RUNX1 proteins and establish the first molecular evidences suggesting that the recurrent RUNX1-RUNX1T1 and four rare RUNX1 fusions share common molecular deregulations. As relapse frequently occurs in RUNX1 positive leukemias, JUP overexpression could be of particular interest with regard to targeted-therapy, as demonstrated by previous work showing potential benefits of inhibiting the Wnt pathway in other genetic groups of acute leukemias.

Durant la méiose, il se produit des échanges réciproques entre fragments de chromosomes homologues par recombinaison génétique. Les chromosomes parentaux ainsi modifiés donnent naissance à des gamètes uniques. En redistribuant les mutations génétiques pour générer de nouvelles combinaisons, ce processus est à l’origine de la diversité haplotypique dans la population. Dans cette thèse, je présente des résultats décrivant l’implication de la recombinaison méiotique dans les maladies chez l’humain. Premièrement, l'analyse statistique de données de génotypage de familles québécoises démontre une importante hétérogénéité individuelle et sexe-spécifique des taux de recombinaisons. Pour la première fois chez l’humain, nous avons observé que le taux de recombinaison maternel diminue avec l'âge de la mère, un phénomène potentiellement impliqué dans la régulation du taux d’aneuploïdie associé à l’âge maternel. Ensuite, grâce à l’analyse de données de séquençage d’exomes de patients atteints de leucémie et de ceux de leurs parents, nous avons découvert une localisation anormale des évènements de recombinaison chez les enfants leucémiques. Le gène PRDM9, principal déterminant de la localisation des recombinaisons chez l’humain, présente des formes alléliques rares dans ces familles. Finalement, en utilisant un large spectre de variants génétiques identifiés dans les transcriptomes d’individus Canadiens Français, nous avons étudié et comparé le fardeau génétique présent dans les régions génomiques à haut et à faible taux de recombinaison. Le fardeau génétique est substantiellement plus élevé dans les régions à faible taux de recombinaison et nous démontrons qu’au niveau individuel, ce fardeau varie selon la population humaine. Grâce à l’utilisation de données génomiques de pointe pour étudier la recombinaison dans des cohortes populationnelles et médicales, ce travail démontre de quelle façon la recombinaison peut affecter la santé des individus. / The intergenerational mixing of DNA through meiotic recombination of homologous chromosomes is, along with mutation, a major mechanism generating diversity and driving the evolution of genomes. In this thesis, I use bioinformatics and statistical approaches to analyse modern genomic data in order to study the implication of meiotic recombination in human disease. First, using high-density genotyping data from French-Canadian families, we studied sex- and age-specific effects on recombination patterns. These analyses lead to the first observation of a significant decrease in recombination rates with advancing maternal age in humans, with potential implications for understanding trisomic conceptions. Second, using next-generation sequencing of exomes from families of children with leukemia, we discovered unusual distributions of recombination breakpoints in some leukemia patients, which implicates PRDM9, a protein involved in defining the location of recombination breakpoints, in leukemogenesis. Third, using single nucleotide polymorphisms (SNPs) called from RNA sequencing data, we present a detailed comparison of the mutational burden between high and low recombining regions in the human genome. We further show that the mutational load in regions of low recombination at the individual level varies among human populations. In analysing genomic data to study recombination in population and disease cohorts, this work improves our understanding of how recombination impacts human health. Furthermore, these results provide insights on how variation in recombination modulates the expression of phenotypes in humans.

Le microenvironnement, composé de différents éléments cellulaires et de la matrice extracellulaire, joue un rôle primordial dans le développement tumoral et la dissémination métastatique. Ainsi, l'étude de ces interactions cellulaires est importante pour que des thérapies ciblées luttent contre la chimiorésistance des cellules tumorales. Ce travail de thèse a pour but d'étudier le rôle du facteur de croissance IGF-I dans la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire et des leucémies myéloïdes présente au sein du microenvironnement.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire, acquise grâce aux cellules hôtes (hospicells), est liée à la sécrétion de IGF-I par ces cellules. Nous avons également montré que IGF-I est impliqué dans la régulation de certains gènes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, et BCRP) via les voies de STAT3, Jak2, PI3K et ERK.Dans les leucémies myéloïdes, nous avons montré que IGF-I a un effet sur la prolifération des cellules tumorales. Il induit l'expression de la protéine P-gp ainsi que la chimiorésistance des cellules sensibles à la chimiothérapie. Nous avons également déterminé le rôle de IGF-I dans la résistance des cellules leucémiques en présence des hospicells. Ces dernières ont une activité hyperangiogénique in vivo, lié à l'HIF-1 et au VEGF, et inhibent les réponses immunes des lymphocytes T par production de NO.Nous avons déterminé le rôle crucial de MMP-9 dans la migration des cellules résistantes du cancer du sein exprimant la protéine P-gp et dans la formation d'un réseau tubulaire, suggérant un lien existant entre l'expression de P-gp et de MMP-9.

Le rôle de l'environnement dans l'étiologie des leucémies aigües de l'enfant (LA) fait aujourd'hui l'objet de recherches intenses. Dans ce contexte, le présent travail a pour objectif d'étudier la relation entre l'incidence de LA et la proximité des centrales nucléaires de production d'électricité (CNPE) et des lignes à haute tension (LHT). Avant cette analyse fine, un premier travail a consisté à étudier les variations départementales de l'incidence de LA.Les cas inclus dans ces études sont toutes les LA du Registre National des Hémopathies malignes de l'Enfant sur la période étudiée : 1990-2004 pour l'étude de l'incidence départementale et 2002-2007 pour les études de l'association avec les facteurs d'exposition environnementale. Dans l'approche cas-témoins principalement utilisée pour ces dernières, les 30 000 sujets témoins constitue un échantillon représentatif de la population pédiatrique française sur la période d''intérêt. D'autre part, la géolocalisation des adresses des sujets et des sources d'exposition permet de définir des critères de proximité en relation avec la probabilité et/ou l'intensité d'exposition aux facteurs d'intérêt. * L'étude des LA par département n'a pas mis en évidence de tendance ni de structure spatiale dans l'incidence à ce niveau géographique : que ce soit globalement, par classe d'âge, par sexe ou par sous-type de leucémie. * Sur la période 2002-2007 contrairement aux périodes précédentes, un quasi-doublement de l'incidence des LA à moins de 5 km des CNPE a été mis en évidence, avec une approche cas-témoin comme avec l'étude d'incidence. Ce résultat n'était pas spécifique d'une CNPE ou d'un type de CNPE et non lié à la cartographie des émissions aériennes de radioactivité par les CNPE. * L'association trouvée entre l'incidence de LA et la proximité aux LHT de plus de 225 kV (<50 m) semble restreinte aux enfants de moins de 5 ans ou n'habitant en milieu urbain ; aucune association n'a été trouvée avec la proximité aux LHT de moins de 150 kV.

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements. / Acute myeloid leukemia (AML), a cancer where hematopoietic precursors are arrested in an early stage of development, is associated with a poor survival rate of 20 to 30% over five years, despite intensive chemotherapy treatments. In approximately 90% of AML cases the malignant cells express CD33 antigen, which makes it a target of choice for development of immunotoxin based therapy. Three immunoconjugates (IC) composed of anti-CD33 monoclonal antibody coupled with maytansine derivative, which prevent tubulin polymerization and thus formation of mitotic spindle, were designed. These three IC were tested for their activity against several AML cell lines and primary AML patient cells and we investigate mechanisms responsible for variation in sensitivity to IC treatment. In this report, we show that differences in number of CD33 molecules on AML cell surface does not explain the observed differences in IC sensitivity. We demonstrate that binding of huMy9-6 antibody to CD33 induces rapid internalization and that it is first process through endosome. We confirm that lysosomal processing is essential for the antimitotic effect induced by IC treatment. Also, we provide evidence that SOCS3 protein may play a role in resistance of AML cells to anti-CD33 therapy by directing IC-CD33-SOCS3 complex to the proteasome and therefore affecting lysosomal decoupling of IC-CD33 and intracellular release of maytansine derivatives. Finally, the linkers and maytansine derivative modifications were not sufficient to increase sufficiently the efficacy of conjugates to eliminate higher numbers of AML cells. The identification of mechanisms responsible for increased resistance of AML cell lines and primary AMLs may allow us to identify IC responsive AML cells and also identify strategies to improve the efficacy of IC treatment.

Les longs ARN non codants (lncRNAs) sont définis comme des transcrits de plus de 200nt et n'ayant pas de potentiel codant. Des études récentes ont démontré que les lncRNAs pouvaient être impliqués dans la régulation de la transcription, de la traduction, de la différenciation cellulaire, de l'expression génique, du cycle cellulaire et des modifications de la chromatine. De plus, il a été montré un impact fonctionnel de certains lncRNAs dans le processus de cancérogenèse mais nos connaissances actuelles sur ces molécules dans le cancer, et plus particulièrement dans la leucémie, restent extrêmement limitées. Au cours de cette étude, nous avons analysé l'expression des lncRNAs par RNA-sequencing sur 40 patients atteints de leucémie aiguë myéloblastique (LAM) à caryotype normal. Parmi les 11065 lncRNAs exprimés dans nos échantillons, nous avons identifié une signature de lncRNAs associée à la mutation de NPM1. Afin de mettre en évidence les fonctions putatives des lncRNAs sélectionnés, nous avons utilisé un algorithme de prédiction d'interaction protéine/ARN. De manière intéressante, plus de la moitié des lncRNAs présentent des sites d'interactions potentiels à SUZ12, une sous unité du complexe PRC2 (Polycomb repressive complex 2), connu pour être recruté par des lncRNAs pour la régulation épigénétique de gènes cibles. Par RNA immunoprécipitation (RIP) de SUZ12, nous avons pu démontrer que le lncRNA XLOC_087120 interagissait avec SUZ12. De plus, son expression est anti-corrélée avec celle des gènes voisins codants des histones, suggérant un rôle dans la régulation négative des histones par ce lncRNA. L'impact de la dérégulation de XLOC_087120 sur les histones a été confirmé par des expériences de surexpression et d'inhibition de ce lncRNA dans des lignées de LAM. De plus, même si la mutation NPM1 ne semble pas affecter directement l'expression de ce lncRNA, des expériences d'infection de la forme mutée de NPM1 dans une lignée LAM ont montré que NPM1 pourrait réguler la localisation nucléaire/cytoplasmique de XLOC_087120 et moduler sa fonction de répresseur. En conclusion, ces données suggèrent que les lncRNAs sont des facteurs clés dans la pathogenèse des LAMs. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) are defined as RNA transcripts that are larger than 200 nt but do not appear to have protein- coding potential. Recent studies have demonstrated that lncRNAs regulate many processes such as transcription, translation, cellular differentiation, gene expression regulation, cell cycle regulation, and chromatin modification. Cumulative evidence points towards an important role of lncRNAs in cancer initiation, development, and progression. However, our overall knowledge of lncRNAs in cancer, including leukemia, remains extremely limited. In this study, we investigated lncRNA expression by RNA-sequencing in 40 acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. Among 11065 lncRNA expressed in our samples, we identified specific lncRNA signature associated with the presence of NPM1 mutation. To go further into the putative function of these lncRNAs, we used catRAPID Omics algorithm to predict potential protein partners. Interestingly, the majority of the selected lncRNAs contains putative SUZ12 binding sites, a PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) component known to be linked to lncRNAs and to epigenetically regulates target genes. By using SUZ12 RNA Immunoprecipitation, we identify one lncRNA named XLOC_087120 linked to SUZ12. XLOC_087120 is located in a region enriched in histone genes. Pearson correlation showed a significative anti-correlation between XLOC_087120 and histone neighboring coding gene expression suggesting a role of this lncRNA in the regulation of histone genes. The impact on histone genes expression was confirmed by overexpression and inhibition of XLOC_087120 in AML cell lines. Overexpression of NPM1 mutant in an AML cell line showed that NPM1 modulates the nuclear/cytoplasmic localization of XLOC_087120 and consequently its repressive function. Altogether, these data suggest that lncRNAs should be considered as key players in the pathogenesis of acute myeloid leukemias.

Les dérivés de la cytosine sont d’importantes modifications épigénétiques dont le rôle dans l’évolution de la leucémie lymphoïde chronique (LLC) n’est pas totalement exploré. Dans ce contexte, notre première étude vise à examiner le niveau global de la 5-methylcytosine (5-mCyt), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmCyt), 5-carboxylcytosine (5-CaCyt) et 5-hydroxymethyluridine (5-hmU) dans des lymphocytes B purifiés de patients LLC (n=56) et d’individus sains (n=17). Les principaux acteurs de la régulation épigénétique (DNMT1/3A/3B, MBD2/4, TET1/2/3, SAT1) ont été évalués par PCR quantitative en temps réel. L’analyse a permis de mettre en exergue trois groupes de patients. En premier lieu, un groupe de patients stables (délai médian de progression [PFS] et délai au premier traitement [TFT] >120 mois), avec un profil épigénétique similaire au groupe contrôle. Deuxièmement, un groupe intermédiaire (PFS=84; TFT=120 mois) qui présente une augmentation de la déméthylation de l’ADN expliquée par l'induction SAT1 / TET2 pendant la progression de la maladie. Troisièmement, un groupe de patients avec une forme active de la maladie (PFS=52; TFT=112 mois) qui présentent une hyperlymphocytose, une réduction du temps de doublement des lymphocytes et des modifications épigénétiques majeures. Au sein de ce groupe, une réduction est observée pour la 5-mCyt, 5-hmCyt, 5-CaCyt et serait associée à une diminution des DNMTs, TETs et MBDs au cours de la progression de la maladie. Les profils épigénétiques mis en évidence sont indépendants du statut mutationnel IGHV mais sont associés avec les anomalies cytogénétiques. Nous nous sommes également intéressés à cette association et nous avons montré dans la deuxième étude que les modifications des dérivées de la cytosine peuvent affiner le pouvoir pronostic des anomalies cytogénétiques. En conclusion, nos résultats suggèrent que les variations de la méthylation ainsi que des intermédiaires de la déméthylation de l’ADN sont impliqués dans la progression de la LLC. / Cytosine derivatives are important epigenetic modifications whose role in the pathogenesis and evolution of chronic lymphocytic leukemia (CLL) is not fully explored. In this context, our first study aims to examine the global DNA level of 5-methylcytosine (5-mCyt), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmCyt), 5-carboxylcytosine (5-CaCyt) and 5-hydroxymethyluridine (5-hmU) in purified B lymphocytes of CLL patients (n = 56) and healthy individuals (n = 17). The main actors in epigenetic regulation (DNMT1 / 3A / 3B, MBD2 / 4, TET1 / 2/3, SAT1) were evaluated by quantitative real time PCR. The analysis highlighted three groups of patients. First, a group of patients with stable disease (median time to progression [PFS] and time to first treatment [TFT]> 120 months), with an epigenetic profile similar to the control group. Secondly, an intermediate group (PFS = 84, TFT = 120 months) which shows an increase in DNA demethylation explained by SAT1 / TET2 induction during disease progression. Third, a group of patients with an active form of the disease (PFS = 52, TFT = 112 months) who have hyperlymphocytosis, a short lymphocyte doubling time, and major epigenetic changes. Within this group, a reduction is observed for 5-mCyt, 5-hmCyt, 5-CaCyt which is associated with a decrease in DNMTs, TETs and MBDs during disease progression. The identified epigenetic profiles are independent of IGHV mutational status but are associated with cytogenetic abnormalities. We were also interested in this association and we showed in the second study that modifications of cytosine derivatives levels can refine the prognostic power of cytogenetic abnormalities.In conclusion, our results suggest that methylation variations as well as DNA demethylation intermediates are involved in the progression of CLL.

La duplication interne en tandem au sein du gène du Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) est l’une des mutations les plus fréquemment observées dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM). Elle est corrélée à un mauvais pronostic. Des inhibiteurs de tyrosine kinase anti-FLT3 (FLT3-ITK) sont en cours de développement mais les premiers essais cliniques ont été décevants. Les rémissions sont de courte durée, et si une clairance leucémique sanguine est observée, la LAM persiste au sein de la moelle osseuse. Dans ce travail, nous avons démontré que les cytokines activatrices de STAT5, telles que l’interleukine-3 et la thrombopoïétine, et les basses pressions en oxygène, telles que celles observées au sein de la niche hématopoïétique augmentent l’expression et l’activité du récepteur tyrosine kinase AXL qui protège les cellules de LAM FLT3-ITD de l’apoptose induite par le FLT3-ITK quizartinib (AC220). Nous avons démontré dans un modèle murin que les cellules de LAM FLT3-ITD « knock-down » pour AXL sont plus sensibles au quizartinib, et que cette différence se révèle spécifiquement dans un modèle de prise de greffe hématopoïétique. La combinaison de stratégies inhibitrices du FLT3-ITD et d’AXL permettra d’améliorer l’efficacité des FLT3-ITK en atteignant la fraction de cellules responsable des rechutes, nichée dans son microenvironnement. A l’issue, nous avons démontré que le gilteritinib (ASP2215), double FLT3/AXL-ITK est plus efficace que le quizartinib pour atteindre ces cellules leucémiques médullaires. Enfin, nous avons démontré que la combinaison d’un anticorps monoclonal anti-AXL avec un FLT3-ITK ou de la cytarabine était une stratégie thérapeutique prometteuse dans les LAM FLT3-ITD ou sauvage. / Internal tandem duplication in Fms-like tyrosine kinase 3 gene (FLT3-ITD) is the most frequent mutation observed in acute myeloid leukemia (AML), and correlates with poor prognosis. FLT3 tyrosine kinase inhibitors (FLT3-TKI) have been promising for therapeutic strategies but clinical trials have revealed rarely long-lasting remission with persistent leukemic cells present in the bone marrow. In this work, we show that the hematopoietic niche microenvironment protects FLT3-ITD AML cells from FLT3-TKI quizartinib (AC220) through convergent up-regulation of AXL expression and activity. Cytokine-dependent activation of STAT5 enhances AXL gene transcription and expression, while low O2 concentration up-regulates AXL protein levels. Moreover, cytokines such as thrombopoietin or interleukin-3 directly activate AXL. RNA interference-based inhibition of AXL expression in FLT3-ITD AML cells allowed a selective purge of leukemic cells within their microenvironment when combined with FLT3-TKI in immuno-compromised mice. Altogether, our data support a strategy combining FLT3-TKI and anti-AXL therapy to eradicate FLT3-ITD AML cells, including those protected by the hematopoietic niche. In such a setting, we performed a study to test the efficacy of gilteritinib (ASP2215) and we showed in vitro and in vivo that this dual FLT3/AXL-TKI is more efficient to eradicate leukemic cells in their microenvironment than quizartinib which is a more specific FLT3-TKI. Finally, we also studied an anti-AXL monoclonal antibody on primary AML cells and showed that its efficacy could be interesting with FLT3-TKI and cytarabine in both FLT3-wild type and FLT3-ITD AML.