Les télomères sont les extrémités des chromosomes et sont protégés par le complexe shelterin pour ne pas être reconnus comme des cassures accidentelles d'ADN double brin. Un enjeu majeur dans la recherche sur les télomères est de comprendre comment l'intégrité des extrémités des chromosomes au cours de l'oncogenèse est modifiée. La perte de répétitions télomériques à chaque division cellulaire peut être compensée par l’activité de l’enzyme télomérase qui ajoute "de novo" des motifs télomériques. Bien que la télomérase soit surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses, l’impact de modifications des protéines shelterin qui coiffent les télomères dans le processus oncogénique n'est pas clair. Dans la première étude, nous avons analysé l'état des télomères de patients atteints de la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) uniquement au stade précoce de la LLC, stade A de Binet. La LLC est une leucémie commune aux pays occidentaux et se développe chez les personnes âgées. Nous avons montré que la majorité des patients atteints de la maladie présente des télomères dysfonctionnels. Les dommages télomériques ne corrèlent pas avec la longueur des télomères ou le statut mutationnel des patients, mais corrèlent avec la faible expression des protéines télomériques TIN2 et TPP1. Dans la seconde étude, nous avons montré que l'expression de l'oncogène H-RasV12 confère une résistance accrue vis-à-vis des télomères dysfonctionnels et aucun défaut de croissance n’est observable lorsque TRF2, une protéine télomérique est inhibée. Cet effet dépend de l'expression de l'interleukine 6 (IL-6), révélant un rôle inattendu de cette cytokine dans la fonction des télomères. De plus, la co-inhibition de TRF2 et IL-6 dans les cellules RasV12 conduit à blocage G2 / M associé à une séparation des chromatides sœurs. Ces résultats suggèrent que l'induction de la tumorigénicité par l’oncogène Ras protège les télomères contre les dommages et que la ségrégation des chromosomes est dépendante de TRF2 et IL-6. / Telomeres protect the chromosome extremities from being repaired and recognized as accidental DNA breaks double-strand. A major issue in telomere research is to understand how systems monitoring the integrity of chromosomes ends change during oncogenesis. Although telomerase overexpression occurs in the majority of cancer cells, whether other types of telomere changes play roles in the oncogenic process is unclear. In the first study, we analyzed the status of telomeres in patients with early stage Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL), which is a common leukemia in Western countries that develops in the elderly. We showed that the majority of CLL patients exhibit telomeric dysfunction. It does not correlate with telomere length or mutation status of patients, but correlates with low expression of telomeric proteins TIN2 and TPP1. In the second study, we showed that expression of the H-RasV12 oncogene confers increased resistance to telomere uncapping and protects against to growth defects when TRF2, a telomeric protein, is depleted. This effect depends upon the expression of interleukin 6 (IL-6), revealing an unexpected role for this cytokine in telomere function. Notably, the co-inhibition of TRF2 and IL-6 in RasV12 cells led to G2/M block associated with an increased incidence of premature sister chromatid separation. These findings suggest that the induction of a tumorigenic state by oncogenic Ras protects against telomere damage and chromosome segregation defects in TRF2-compromised cells through an increase of IL-6 expression

La leucémie T de l’adulte (ATL) est une pathologie lympho-proliférative aiguë associée à l’infection par le virus HTLV-1 (human T-cell leukemia virus type 1). La réactivation de la télomérase observée lors de la phase tardive du développement de l’ATL est un évènement crucial dans la progression tumorale. Elle est induite au niveau transcriptionnel par la protéine HBZ (HTLV-1 bZIP factor) et est dépendante du facteur de transcription JunD. Ce dernier est normalement associé en complexe avec le produit du gène suppresseur de tumeur MEN-1, la ménine, dont l’interaction avec JunD réprime la transcription JunD-dépendante et convertit JunD en inhibiteur de croissance.Mes résultats démontrent que la protéine virale HBZ inhibe la fonction suppresseur de tumeur de la ménine, induisant l’activité transcriptionnelle de JunD et donc l’activation de la transcription de son gène cible : la transcriptase inverse télomérase humaine (hTERT). J’ai démontré que HBZ, JunD et la ménine peuvent coexister dans un même complexe protéique et que HBZ et la ménine ont des effets opposés sur l’activité transcriptionnelle de JunD. En effet la ménine inhibe l’activation du promoteur proximal d’hTERT par JunD, alors que HBZ est capable de contre balancer cet effet. Finalement, je propose qu’en recrutant l’histone acétyltransférase p300, HBZ réverse la déacétylation des histones induite par le recrutement des HDACs par la ménine et par conséquent active le promoteur d’hTERT. L’ensemble de ces résultats a permis d’identifier les mécanismes moléculaires aboutissant à l’inhibition fonctionnelle de la protéine suppresseur de tumeur ménine, résultant en la dérégulation de la voie AP-1 dans les cellules infectées par HTLV-1. Finalement, ce travail apporte de nouvelles précisions sur le mécanisme de la surexpression transcriptionnelle de la télomérase lors de l’infection par HTLV-1, une étape importante de la mise en place et du développement de la leucémie T de l’adulte vers des stades plus agressifs. / Adult T-cell leukemia (ATL) is an aggressive lymphoproliferative disorder associated with human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection. Reactivation of telomerase, a critical event in tumor progression observed in late phases of ATL development, has been shown to be caused by HBZ (HTLV-1 bZIP factor), a regulatory protein encoded by the negative strand of the HTLV-1 genome. The HBZ-mediated up-regulation of the telomerase catalytic subunit is dependent on JunD, which in the cellular context occurs in the complex with menin, the product of the MEN-1 tumor suppressor gene. Interaction with menin represses JunD-dependent transcription and converts JunD into a growth suppressor, whereas it acts as a growth promoter in the absence of menin. My results demonstrate that the viral protein HBZ abrogates tumor suppressor function of menin, resulting in the activation of JunD transcriptional activity and finally in the up-regulation of its target gene, the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). I showed that HBZ, JunD and menin can coexist in the same protein complex and that HBZ and menin exert opposite effects on JunD transcriptional activity. Moreover menin inhibits the JunD-mediated activation of the hTERT proximal promoter and HBZ is able to counteract this effect. Finally, I proposed that HBZ, by recruiting p300 histone acetyltransferase, reverses the histone deacetylation conducted by menin-recruited HDACs and therefore up-regulates the expression of the hTERT gene. Altogether, my work led to the identification of the molecular mechanism leading to the functional impairment of the menin tumor suppressor, which results in the deregulation of AP-1 signaling in HTLV-1 infected cells. Finally this work gave new insights into the mechanism of the transcriptional up-regulation of the hTERT gene upon HTLV-1 infection, being a key event during the development of Adult T-cell leukemia and a necessary step towards the progression into more aggressive courses.

La spectroscopie vibrationnelle est une technologie permettant de générer une grande quantité de données très informatives quant à la composition moléculaire des échantillons analysés. Lorsqu'elle est couplée à des méthodes chimiométriques de traitement et de classification de données, elle devient un outil très performant pour l'identification de structures et sous-structures des échantillons. Appliqué dans le domaine du biomédical, cet outil présente alors un fort potentiel pour le diagnostic de maladie. C'est dans ce cadre qu'ont été réalisés les travaux de ce manuscrit. Dans une première étude relevant du développement algorithmique, un algorithme automatique de classification non supervisée (basé sur les Fuzzy C-Means) et récemment implémenté au sein du laboratoire pour apporter une aide au diagnostic de cancers cutanés par imagerie infrarouge, a été amélioré afin de i) considérablement réduire le temps nécessaire à son exécution ii) augmenter la qualité des résultats obtenus sur les données infrarouge et iii) étendre son champs d'application à des données réelles et simulées, habituellement employées dans la littérature. Cet outil a été testé sur des données infrarouge acquises sur 16 échantillons de cancers cutanés (BCC, SCC, maladie de Bowen et mélanomes), et sur 49 jeux de données réels et simulés. Les résultats obtenus ont montré la capacité de ce nouvel algorithme à estimer des partitions proches de la réalité quelque soit le type de données étudié. La seconde étude de ce manuscrit avait pour but de mettre au point un outil chimiométrique autonome d'aide au diagnostic de la leucémie lymphoïde chronique par spectroscopie Raman. Dans ce travail, des traitements numériques et l'algorithme de classification supervisée Support Vector Machines, ont été appliqués à des données acquises sur des cellules sanguine de 27 témoins et 49 patients présentant une leucémie lymphoïde chronique. Les résultats de classification obtenus ont montré une sensibilité de 80% et une spécificité de 100% dans la détection de la maladie. / Vibrational spectroscopy is a technology able to record a large amount of molecular information from studied samples. Coupled with chemometrics and classification methods, vibrational spectroscopy is an efficient tool to identify sample structures and substructures. When applied to the biomedical field, this tool shows a high potential for disease diagnosis. It is in this context that the works presented in this thesis have been realized. In a first study, dealing with algorithmic development, an automatic and unsupervised classification algorithm (based on the Fuzzy C-Means) and developed by our laboratory in order to help for skin cancer diagnosis using IR spectroscopy, was improved in order to i) reduce the computational time needed to realize clustering, ii) increase results quality obtained on infrared data, iii) and extend its application fields to simulated and real datasets, commonly used in the literature. This tool has been tested on 16 infrared spectral images of skin cancers (BCC, SCC, Bowen's disease and melanoma), and 49 real and simulated datasets. The obtained results showed the ability of this new algorithm to estimate realistic data partitions regardless the considered dataset. The second study of this work aimed at developing an independent chemometric tool to assist for chronic lymphocytic leukemia diagnosis by Raman spectroscopy. In this second work, different numerical preprocessing steps and a supervised classification algorithm, Support Vector Machines, have been applied on data recorded on blood cells coming from 27 healthy persons and 49 patients with chronic lymphocytic leukemia. The classification results showed a sensitivity of 80% and a specificity of 100% in the disease diagnosis.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), caractérisée par une résistance à l'apoptose in vivo et par la faible immunogénicité des cellules leucémiques est une maladie de présentation hétérogène. L'immunochimiothérapie a permis de progresser dans son traitement, mais l'identification de nouvelles cibles d'immunothérapie serait souhaitable. Dans ce contexte, la présence de TLR-7 et TLR-9 sur les cellules de LLC est une piste intéressante. L'objectif principal de cette étude était ainsi de préciser les effets in vitro de l'engagement de TLR-7 et TLR-9 sur les cellules tumorales par leur ligands respectifs Imiquimod R837 et ODN CpG M362. Ces effets ont été examinés sur des LLC classées en formes cliniques et/ou selon leur statut mutationnel IgVH. Les cellules séparées de 40 patients ont été cultivées pendant trois jours, avec du milieu seul, de l'acétate phorbolmyristate (PMA) ou d'Imiquimod ou d'ODN. La cytométrie en flux a permis d'étudier l'expression des TLRs et d'antigènes de différenciation au niveau des cellules B tumorales, d'évaluer l'apoptose, la prolifération et de doser les cytokines. Les voies de signalisation ont été explorées par une technique d'antibody-array et par western blot. Les résultats confirment que les TLRs sont actifs et répondent à leurs ligands sur les cellules leucémiques. L'Imiquimod induit une apoptose accrue des cellules tumorales, surtout chez les patients stables et mutés, impliquant également la voie p38MAPK. L'ODN induit la prolifération des cellules tumorales et les protège de l'apoptose, surtout pour les patients avec une forme agressive et/ou non mutée. Ceci s'accompagne de l'activation de nombreuses protéines anti-apoptotiques et de la production d'IL-8 et d'IL-6. Ces résultats suggèrent que l'Imiquimod et l'ODN pourraient entrer dans une stratégie d'immunothérapie adjuvante pour les patients atteints de LLC / Chronic lymphoid leukemia (CLL), characterized by in vivo resistance to apoptosis and poor immunogenicity of leukemic cells is a hetereogeneous disease. Immunochemotherapy has allowed to progress greatly in its treatment, but the identification of new immunotherapy targets would be welcome. In this context, the presence of TLR-7 and TLR-9 on CLL cells is a promising prospect. The main objective of this work was therefore to precise the effects of in vitro engagement of TLR-7 and TLR-9 on tumor cells by their respective ligands Imiquimod R837 and ODN CpG M362. These effects were examined on CLL classified according to clinical evolution and /or according to their IgVH mutational status. Separated cells from 40 patients were cultured for three days with medium alone, acetate phorbolmyristate (PMA) or Imiquimod or ODN. Flow cytometry allowed to study the expression of TLRs and differentiation antigens on CLL cells' surface, to evaluate apoptosis, measure proliferation and assay cytokines production. Signaling pathways were further studied by antibody-array and western blot. Data obtained confirmed that TLRs are active and respond to their ligands on CLL B-cells. Imiquimod induces increased apoptosis, especially in patients with stable disease or mutated IgVH, with the additional involvement of the p38MAPK pathway. ODN induces cell proliferation and protects them from apoptosis, mostly for patients with an aggressive disease and/or unmutated IgVH. This is concomitant of the activation of anti-apoptotic proteins and of the production of IL-8 and IL-6. These results suggest that Imiquimod and ODN could enter in an adjuvant immunotherapy strategy in CLL

La LLC est caractérisée par une forte hétérogénéité de présentation clinico-biologique avec description de formes indolentes (IGVH mutes, ZAP-70-) et de formes agressives (IGVH non mutes, ZAP-70+). Le BCR et les voies de signalisation en aval ont fait l’objet d'une étude transcriptionnelle de la réponse à une forte stimulation du BCR, que nous avons poursuivi par une approche protéomique. La MW est un syndrome lymphoprolifératif chronique dont la physiopathologie reste actuellement mal comprise même si une mutation récurrente a été récemment décrite. Nous avons pu montrer que l’analyse globale de 48 profils protéomiques permettait de distinguer les cellules de LLC M et UM avant toute stimulation. Parmi les protéines différentiellement exprimées, on peut citer notamment la protéine HCLS1, dont le rôle a déjà été explore dans la LLC. De plus, la stimulation du BCR induit une réponse protéomique spécifique dans les cellules de LLC agressives, correspondant a des variations d’expression de protéines impliquées dans la signalisation cellulaire, la régulation de la réponse immunologique, le métabolisme protéique, la croissance cellulaire et l’apoptose. La diminution d’expression de 2 protéines, RAD23B et PDCD4, après stimulation du BCR de cellules de LLC agressives a été confirmée par Western-Blot chez 19 patients. Cette technologie DIGE permettant également l’étude de différents isoformes protéiques (et notamment d’isoformes de phosphorylation), nous avons observe des modifications d’état de phosphorylation de plusieurs protéines impliquées dans le cytosquelette après stimulation du BCR (lamines, vimentine….). Une étude protéomique par électrophorèse bidimensionnelle E2D DIGE sur des cellules primaires de sang et de moelle issues de patients porteurs de MW non préalablement traités, en comparaison a d’autres syndromes lymphoprolifératifs tels les lymphomes de la zone marginale (LZM) ou la LLC, a permis de mettre en évidence un profil protéomique spécifique des cellules de MW. Parmi les spots polypeptidiques différentiellement exprimés, est à souligner la sous-expression de la protéine Ku70 chez les patients porteurs de MW par rapport aux autres lymphoproliférations. La confirmation de cette sous-expression de Ku70 a été validée au niveau transcriptionnel par PCR classique et au niveau protéique par Western-Blot dans une plus grande cohorte de patients. La mise en évidence de ces protéines d'intérêt dans l'agressivité et la physiopathologie de ces néoplasies lymphoïdes ouvrent la voie à de nouvelles études portant sur la régulation de ces molécules / CLL is characterized by a strong heterogeneity of clinical and biological presentation with indolent forms (mutated IgVH, ZAP-70-) and aggressive forms (unmutated IgVH, ZAP-70 +). BCR and the downstream signaling pathways have been the subject of a study of the transcriptional response to a strong stimulation of the BCR. We continued with a proteomic approach. WM is a chronic lymphoproliferative disorder whose pathophysiology remains poorly understood, although a recurrent mutation has recently been described. We have shown that the overall 48 proteomic profiles analysis allowed to distinguish between CLL cells M and UM before stimulation. Among the differentially expressed proteins include HCLS1 including protein, whose role has already been explored in CLL. Furthermore, stimulation of the BCR induces a specific response in proteomics aggressive LLC cells, corresponding to protein expression changes involved in cellular signaling, regulation of the immune response, protein metabolism, cell growth and apoptosis. The decrease in expression of two proteins, and RAD23B PDCD4 after stimulation aggressive cells was confirmed by Western blotting in 19 patients. This DIGE technology also allows the study of different protein isoforms (especially phosphorylation isoforms), we observed phosphorylation state changes more involved in the cytoskeleton after stimulation of RCC (rolled, vimentin ....). A proteomic study by two-dimensional electrophoresis E2D DIGE on primary cells of blood and marrow from carriers MW previously untreated patients, in comparison to other lymphoproliferative disorders such as marginal zone lymphoma (MZL) or CLL, helped to highlight a specific proteomic profile of cell MW. Among the spots differentially expressed polypeptide is to highlight the under-expression of Ku70 protein in patients MW compared with other lymphoproliferative disorders. The confirmation of this under-expression of Ku70 was confirmed at the transcriptional level by conventional PCR and at the protein level by Western blotting in a larger cohort of patients. We were able to highlight specific proteomic profiles aggressive forms and identification of differently expressed proteins allowed to identify new proteins involved in aggressiveness and pathophysiology of diseases, opening the way for new studies will focus on the regulation of these molecules of interest

Les cellules Natural Killer (NK) sont jouent un rôle essentiel dans la surveillance des hémopathies malignes. Cependant, les cellules tumorales développent des mécanismes immunosuppresseurs pour échapper à l'immunité cellulaire NK. Ainsi, le maintien ou l'amélioration des performances des cellules NK sont considérés comme des défis majeurs. Les objectifs de cette partie étaient d'évaluer l'impact de la perfusion de cellules NK activées sur la récupération et la biologie des cellules NK circulantes après l'allo-SCT. Des doses croissantes de cellules NK activées par IL-2 ex-vivo ont été perfusées chez des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques 3 mois après allo-SCT. Nos résultats ont montré une fréquence plus élevée des cellules NK dans la périphérie des patients traités. Bien que le phénotype immature soit remarquable peu après le traitement, les cellules NK circulantes, présentaient un état d'activation avec un profil de maturation amélioré après 6 mois de traitement. Nous avons également constaté que l'expression des récepteurs NK activateurs (NKG2D, NKp30 et NKp46) augmentait sur les cellules NK circulantes des patients. De plus, ces cellules ont montré une augmentation significative de la capacité de dégranulation ainsi que de la sécrétion de cytokines (IFN-Ƴ et TNF-α) tout au long de l'étude. Ces différences ont notamment été observées chez les patients ayant reçu des doses plus importantes de cellules NK activées. En conclusion, nous supposons que la perfusion de fortes doses de cellules NK activées ex-vivo pourrait être associée à l'amélioration du phénotype et des fonctions des cellules NK au cours de la reconstitution immunitaire après allo-SCT. / Natural killer (NK) cells are effector lymphocytes of the innate immune system that have the ability to kill transformed cells. They play a critical role in hematological malignancies surveillance, however, tumor cells develop immunosuppressive mechanisms to escape NK cell-mediated killing. So, maintaining or improving NK cell performance is considered a major challenge. Our goals are to evaluate the impact of activated NK cells infusion on the recovery and biology of circulating NK cells post allo-SCT.Three different doses (dose 1: 106 NK cell/Kg, n=3; dose 2: 5x106 NK cell/Kg, n=7; dose 3: >5x106 NK cell/Kg, n=6) of ex-vivo IL-2 activated NK cells were infused into patients with hematological malignancies after all-SCT. Our results showed higher frequency of NK cells in the periphery of patients treated with larger doses of activated NK cells. Although the notable immature phenotype shortly after treatment, the circulating NK cells in patients receiving larger doses of activated NK cells displayed more activation status with improved maturation profile after 6 months of treatment. We also found that the expression of activating NK receptors (NKG2D, NKp30, and NKp46) augmented on circulating CD56dim NK cells of patients receiving larger doses of activated NK cells. Moreover, these cells showed a significant increase in degranulation capacity as well as cytokine secretion (IFN-Ƴ and TNF-α) throughout study period. In conclusion, we hypothesize that infusion of high-dose of ex-vivo activated NK cells could be associated with improvements of NK cell phenotype and function during immune reconstitution after allo-SCT.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

Le cancer, qui représente la première cause de mortalité en France, a dans environ 25% des cas une origine virale. Dans ce contexte le virus HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus Type 1) est l'agent étiologique d'une forme très agressive de leucémie et/ou de lymphome appelée ATL (Adult T-cell Leukemia), caractérisée par une grande instabilité génétique et chromosomique. Cette pathologie se développe après une phase asymptomatique de plusieurs décennies et ne connaît à se jour aucun traitement efficace. Parmi l'ensemble des protéines virale, La protéine Tax joue un rôle crucial dans la transformation cellulaire notamment en activant des facteurs de transcription impliqués dans la prolifération et la survie, mais aussi en contrôlant des étapes clefs de la régulation du cycle cellulaire et de la réparation des endommagements de l'ADN. Mon travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à étudier le rôle de l'enzyme AID (Activationinduced cytidine deaminase) dans l'instabilité génomique des lymphocytes T. Nos résultats démontrent que AID est exprimée dans les lymphocytes T CD4+ infectés par HTLV-1, que son expression est induite par la protéine virale Tax et que l'enzyme est fonctionnelle. En utilisant différentes techniques nous avons pu démontrer que AID induit une désamination des deoxycytidines en deoxyuraciles in vitro et des endommagements de l'ADN, de type cassures de l'ADN, dans les cellules infectées par HTLV-1 ou transfectées par Tax. L'accumulation de ces endommagements pourrait participer à la transformation cellulaire au cours de l'infection par HTLV-1 suggérant ainsi un rôle de AID dans la leucémogenèse associée à HTLV-1. La longue période de latence avant le développement de l'ATL suggère la mise en place de mécanismes de survie dans les cellules infectées par HTLV-1. Nous avons donc en parallèle étudié les mécanismes de régulation de l'expression de la protéine anti-apoptotique Bfl-1 et son implication dans la survie des cellules infectées / Cancer, which is the leading cause of death in France, has a viral origin in about 25% of cases. In this context, HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus Type 1) is the etiologic agent of a very aggressive form of leukemia/lymphoma called ATL (Adult T-cell Leukemia), characterized by genetic and chromosomal instability. ATL occurs after an asymptomatic period of several decades and to date there is no effective treatment. Among all the viral proteins, Tax protein plays a crucial role in cell transformation especially by activating transcription factors involved in proliferation and survival, but also by controlling the key steps of the cell cycle regulation and the DNA damage response. The aim of my PhD work was, firstly, to investigate the role of the enzyme AID (activation-induced cytidine deaminase) in the genomic instability of T cells. Our results demonstrate that AID is expressed in HTLV-1-infected CD4+ T cells, that its expression is induced by the viral protein Tax and that AID is functional. Using different techniques we have demonstrated that AID induces deamination of deoxycytidines into deoxyuracils in vitro and DNA damage, like DNA breaks, in HTLV- 1-infected or Tax-expressing cells. Accumulation of DNA damage could be involved in cellular transformation of HTLV-1-infected cells, suggesting a role of AID in leukemogenesis associated with HTLV-1. The long latency period before the development of ATL suggests establishment of survival mechanisms in HTLV-1-infected cells. Thus we studied the mechanisms regulating the expression of anti-apoptotic Bfl-1 protein and its involvement in the survival of infected cells. We have shown that Tax protein induces expression of Bfl-1 via the NF-B and AP-1 pathways, but also that a second viral protein, HBZ, is able to modulate Bfl-1 expression induced by Tax. In addition, the use of Bfl-1 specific shRNA allowed us to highlight the role of Bfl-1 in survival of infected cells as well as in chemoresistance of HTLV-1-infected T cell lines. Thus Bfl-1 appears as a potential therapeutic target in the treatment of ATL

Chaque cadre doit contenir un résumé de 1700 caractères maximum, espaces compris. En cas de dépassement, la coupure sera automatique. Le doctorant adresse son texte sous forme électronique selon les recommandations de la bibliothèqueLes "Liver X receptors " (LXR) sont des récepteurs nucléaires impliqués dans Phoméostasie du cholestérol. Dans les macrophages, la stimulation de la voie LXR accroît la clairance des corps apoptotiques et réprime la réponse inflammatoire. Les LXR inhibent également la prolifération et la survie de cellules malignes.L'activation des LXR dans les cellules dendritiques plasmocytoïdes (PDG) augmentent la clairance des microparticules (MP), via l'induction du récepteur au phosphatidylsérines BAIL L'internalisation des MP active la voie NF-KB ou la voie LXR pour des MP dérivées respectivement, de cellules endothéliales (EMP) ou plaquettaires (PMP). Ces deux voies de signalisation se réprimaient mutuellement, déterminant la réponse inflammatoire des PDG.La contrepartie leucémique des PDC (LPDC) est à l'origine d'une leucémie aiguë agressive, la BPDCN. Nous avons observé une dérégulation de Phoméostasie du cholestérol dans ces cellules. L'activation de la voie LXR entraine un efflux du cholestérol associé à un effet cytotoxique et antiprolifératif. Ils peuvent impliquer : la répression de NF-KB ; ainsi que l'inhibition de la signalisation induite par le facteur de survie IL-3 (incluant STAT5 et Akt). L'utilisation d'un modèle xénogénique murin de BPDCN traitée par agoniste LXR montre une diminution de la cytopénie induite par les LPDC et des infiltrats spléniques et médullaires.Ces travaux démontrent la fonctionnalité de la voie LXR dans les PDC et LPDC, ainsi qu'une régulation croisée avec NF-KB. L'activation de cette voie a démontré son implication dans la clairance des MP et la régulation de la réponse inflammatoire des PDC, ainsi qu'un effet anti-leucémique sur les LPDC. / Nuclear Liver X Receptors (LXR) are involved in cholesterol homeostasis. In macrophages, LXR promote apoptotic body/cell clearance and repress inflammatory responses. LXR are also shown to inhibit proliferation and survival of malignant cells.In plasmacytoid dendritic cells (PDC), LXR stimulation increases microparticle (MP) engulfment via the increased expression of the PS receptor, BAIL MP engulfment induced NF-icB or LXR activation, depending on the endothelial (EMP) or platelet (PMP) origin of MP, respectively. Overall, we show a crosstalk involving LXR and NF-KB, which dictates the inflammatory fate of PDC engulfing MP.The leukemic PDC counterpart (LPDC) is responsible of an aggressive hematologic malignancy, called blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN). In contrast to healthy PDC and other acute leukemias (including lymphoid and myeloid acute leukemias), we report here a specific downregulation of cholesterol homeostasis-related genes in LPDC. LXR pathway activation increases cholesterol efflux and inhibits cell proliferation and survival. This may involve: inhibition of NF-KB signaling pathway and of signaling pathways induced by the survival factor IL-3 (involving Akt and STAT5). Using a xenogeneic mouse model of BPDCN, LXR agonist treatment reduces BPDCN-induced cytopenia as well as bone marrow and spleen LPDC infiltration.Overall, we demonstrate that LXR receptors are functional in PDC and LPDC and are involved in a cross-regulation mechanism with NF-KB. LXR receptors promote MP clearance and control inflammatory responses in PDC, as well as exert an anti-leukemic therapeutic effect in BPDCN via several mechanisms, including cholesterol efflux.