Orientadores: Patrícia Maria Bergamo Favaro, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_MatheusRodrigues_M.pdf: 3896765 bytes, checksum: d056b823ef7d5306e932f125ae5b6eaa (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por hematopoese ineficaz e risco de progressão para leucemia mieloide aguda (LMA). SMD de baixo de risco é caracterizada por um aumento de apoptose na medula óssea e alterações clínicas com perfil autoimune, enquanto que na SMD de alto risco há uma evasão imune, baixa apoptose e danos secundários ao DNA, contribuindo para a progressão para LMA. Essas evidências, junto com os dados de terapia imunossupressora em pacientes com SMD, sugerem o papel do sistema imune na progressão desta doença. Entretanto, o papel do sistema imune não é claro, e estudos que abordem o perfil das células T são importantes para o melhor entendimento da patogênese da SMD. Formin-like 1 (FMNL1) pertence à família de proteínas formina, indispensáveis para muitos processos fundamentais actina-dependentes. FMNL1 é restritamente expressa em células derivadas de linhagem hematopoética e superexpressa em células neoplásicas hematopoéticas malignas. Recentemente, foi descrito que FMNL1 está envolvida no processo de citotoxicidade de células CD8+. Desse modo, estudar a expressão de FMNL1 tanto nos linfócitos como nas células da MO dos pacientes com SMD, poderia contribuir para o melhor entendimento do papel dessa nova proteína neste modelo de neoplasia hematológica. No presente estudo, foi observada uma diminuição significativa na contagem absoluta de linfócitos periféricos no grupo SMD, após ajuste para idade, quando comparada com o grupo de doadores saudáveis (controle). Entretanto, houve um aumento da frequência de células CD3+, resultante do aumento significativo das subpopulações de células CD3+CD4+ no grupo de alto risco e CD3+CD8+ no grupo de baixo risco, de acordo com as classificações FAB e WHO. A razão CD4:CD8 encontrou-se aumentada no grupo de alto risco comparado com o de baixo risco. Dependência transfusional foi correlacionada positivamente com a porcentagem de CD3+CD4+, enquanto que a idade dos pacientes correlacionou-se de forma negativa com a porcentagem de CD3+ e CD3+CD8+. Os níveis de expressão de FOXP3, nas células CD3+ de sangue periférico, foram significativamente menores no grupo de baixo risco quando comparado com o grupo controle, e esse padrão se repetiu para a expressão de IL10. A quantificação dos transcritos de IL10 correlacionou-se negativamente com a porcentagem de células CD3+CD8+. Em conclusão, evidenciamos que pacientes com SMD apresentaram um menor número de linfócitos, porém com a frequências das células T CD3+, CD3+CD4+ e CD3+CD8+ aumentadas. Os pacientes de baixo risco apresentaram uma diminuição da expressão de FOXP3 e de IL10, quadro característico de um microambiente apoptótico e inflamatório. Já no grupo de alto risco, a expressão de FOXP3 e de IL10 aumenta em relação ao grupo de baixo risco. É interessante ressaltar que nos pacientes com SMD houve uma correlação entre o aumento da expressão de IL10 e a diminuição das células T CD3+CD8+, sugerindo a contribuição das Tregs na progressão da doença através da produção de IL10. A análise da expressão de FMNL1 em células CD3+ de sangue periférico não denotou diferenças significativas entre os pacientes com SMD e o grupo controle. Entretanto observou-se uma correlação positiva entre a expressão de FMNL1 e o número de células CD3+CD4+ e ambos com a dependência transfusional. Quanto à expressão de FMNL1 em amostras de MO, houve uma expressão significativamente menor nos pacientes com SMD quando comparado com as células de doadores normais, além de uma correlação negativa entre FMNL1 e número de citopenias. Usando modelos de linhagens celulares hematopoéticas para a diferenciação, observou-se um aumento significativo na expressão gênica e protéica de FMNL1 durante a diferenciação megacariocítica. Esses resultados sugerem a participação de FMNL1 na ativação de linfócitos CD4+ no sangue periférico e na diferenciação hematopoética na medula óssea / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of disorders characterized by ineffective hematopoiesis and risk of progression towards acute myeloid leukemia. Low-risk MDS is characterized by increased apoptosis in the bone marrow (BM), with a clinical autoimmune profile, whereas in high-risk MDS an immune evasion, low apoptosis and secondary DNA damage occurs, contributing to the progression of AML. This evidence, together with the data of immunosuppressive therapy in patients with MDS, suggests a role of the immune system in the progression of this disease. However, this role of the immune system is remains unclear, and studies that address the profile of T cells are important for a better understanding of the pathogenesis of MDS. Formin-like 1 (FMNL1) belongs to the family of proteins formina indispensable for many fundamental processes in actin-dependent. FMNL1 is strictly expressed in hematopoietic lineage derived cells, and overexpressed in malignant hematopoietic neoplastic cells. FMNL1 has recently been reported to be involved in the cytotoxicity of CD8+ cells. Thus, studies on the expression of FMNL1, both in lymphocytes and BM cells of MDS patients, could contribute to a better understanding of the role of this protein in this new model of hematologic malignancy. In the present study, we observed a significant decrease in absolute peripheral lymphocyte counts in the MDS group, after adjusting for age, compared with the healthy donor group (control). However, there was an increased frequency of CD3+, resulting in a significant increase of the CD3+CD4+ subpopulation in high risk and CD3+CD8+ in MDS low risk, according to FAB and WHO classifications. CD4:CD8 ratio was increased in the high risk when compared to the low risk group. Transfusion dependence was positively correlated with the percentage of CD3+CD4+, whereas the age of patients correlated negatively with the percentage of CD3+ and CD3+CD8+. The expression levels of FOXP3, in peripheral blood CD3+ cells, was significantly lower in the low risk group compared to controls and this pattern was repeated for the expression of IL10. Interestingly, IL10 transcripts correlated negatively with the percentage of CD3+CD8+. In conclusion, we found that patients with MDS had a lower lymphocyte number, however presented an increased frequency of CD3+ and CD3+CD8+ T cells. Our low risk patients showed a decreased expression of FOXP3 and IL10, characteristic of apoptotic and inflammatory microenvironment. In the high risk group, the expression of FOXP3 and IL10 was normal. Interestingly, there was a correlation between increasing expression of IL10 and reduction of CD3+CD8+ T cells in patients, suggesting the contribution of Treg in disease progression due to IL10 production. Analysis of FMNL1expression in CD3+ cells of peripheral blood showed no significant differences between patients with MDS and the control group. However, there was a positive correlation between FMNL1 expression and the number of CD3+CD4+, and both were transfusion dependence. FMNL1 expression in BM samples was significantly lower in MDS patients when compared with cells from normal donors, and there was a negative correlation between FMNL1 and number of cytopenias. Using models of hematopoietic cell lineages for differentiation, we observed an increase in gene and protein expression of FMNL1 during megakaryocytic and granulocytic differentiation. These results suggest the participation of FMNL1 in the activation of CD4+ lymphocytes in peripheral blood and bone marrow hematopoietic differentiation / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências

Triptofano (TRP) é metabolizado por duas vias, a via serotonérgica e a via das quinureninas. Na via serotonérgica, TRP é metabolizado a serotonina (5-HT) e, em algumas células, à melatonina (MLT) que pode ser oxidada à N1-acetil-N2-formil-5- metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) por ação de peroxidases. Na via das quinureninas o TRP é diretamente metabolizado à N formilquinurenina (NFK) e em seguida a quinurenina (QUIN). A enzima indolamina 2, 3 dioxigenase (IDO) é uma das responsáveis por esta reação. Dada a importância da IDO na tolerância imunológica e pelo fato desta enzima ser induzível nos propusemos a avaliar a existência de uma regulação cruzada entre esta enzima e a via serotonérgica. Avaliando a interferência de AMK sobre a ação de IDO e a interferência de QUIN sobre a formação de AFMK por peroxidases, observamos uma possível interação entre as vias. AMK é um inibidor competitivo clássico de IDO e o Ki encontrado foi de 0,98 mM. QUIN é um inibidor acompetitivo linear simples da formação de AFMK e o Ki encontrado foi de 0,1 mM. A inibição da formação de AFMK também ocorre para a peroxidase humana (mieloperoxidase, MPO). Além de representarem uma regulação cruzada utilizada in vivo, as inibições encontradas podem ser relevantes para a proposta de novos inibidores de IDO e MPO na terapia imunomodulatória. Dado o nosso interesse pelas enzimas IDO e MPO, avaliamos ainda a localização intracelular destas enzimas em células de peritônio de camundongo, tanto residente como ativada com concanavalina A (Con A). O estímulo com Con A representa uma ativação de linfócitos T mediado por interferon gama (IFN-γ) e foi usado como modelo experimental para avaliar condições de localização em células ativadas. Por imunocitoquímica verificamos que IDO e MPO localizam-se próxima à membrana plasmática sendo que uma leve dispersão apenas de MPO foi observada em células ativadas com Con A. A localização intracelular das duas enzimas é no citoplasma, vesículas e núcleo. Curiosamente, verificamos MPO em células isoladas e também em agrupamentos celulares de duas ou mais células. Por citometria de fluxo identificamos macrófagos, linfócitos B1 e agrupamentos celulares como células que contém MPO. A mobilização de MPO durante a ativação celular, a presença de MPO em linfócitos e a presença de MPO e IDO em núcleos são informações novas que sugerem novas atividades para estas enzimas. / Tryptophan (TRP) is metabolized by two mains pathways, the serotoninergic pathway and the kynurenine pathway. In the serotoninergic pathway, TRP is metabolized to serotonin (5-HT) and, in some cells, to melatonin (MLT). The later can even be oxidized to acetyl-N1-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5 -methoxykynuramine (AMK) by peroxidases. In the kynurenine pathway, TRP is metabolized to N-formylkynurenine (NFK) and to kynurenine (KYN). Indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO) is one of those responsible for this reaction. Since IDO is importat in immune tolerance and the fact that this enzyme is inducible by cytokines we proposed whether there is a cross regulation between this enzyme and the serotoninergic pathway. A possible interaction between MLT and TRP oxidation pathways was shown by the AMK influence on IDO activity and QUIN interference on AFMK formation by peroxidases. AMK was shown to be an IDO classical competitive inhibitor with a Ki of 0.98 mM. QUIN was a peroxidase (horseradish peroxidase, HRP) classical uncompetitive inhibitor and Ki was found to be 0,1 mM. AFMK formation inhibition was also found in human peroxidase (myeloperoxidase, MPO). Beyond the in vivo crosstalk, new IDO and MPO inhibitors in immunomodulatory therapy would be proposed by the compounds shown in this study. Given our interest in IDO and MPO, we also evaluated their intracellular localization in both resident and concanavalin A (Con A) activated mice peritoneum cells. Con A stimulation is a IFN-γ mediated T lymphocytes activation and was our experimental model to evaluate activated cells. In light microscopy we observed IDO and MPO localization near the membrane and MPO only had a dispersed localization in Con A activated cells. Cytoplasm, nucleus and vesicles were the intracellular localization of both enzymes. Interestingly, we found MPO in isolated cells and in cell clusters of two or more cells. MPO was founded on macrophages, B1 cells and cell clusters by flow cytometry. The MPO mobilization during cell activation, the presence of MPO in lymphocytes and the presence of MPO and IDO in nuclei are new informations to suggest new activities for these enzymes.

O controle de respostas imunes patológicas (autoimunidade, alergia, rejeição de transplantes) tem sido um dos principais objetivos dos imunologistas. Apesar dos avanços recentes, a maioria dos tratamentos atuais ainda procura diminuir a imunidade e inflamação em vez de restabelecer o estado saudável da tolerância imunológica. Sepse é uma doença desencadeada pela presença de bactérias e/ou produtos bacterianos como lipopolissacarídeos (LPS), componente principal da membrana externa de bactérias gram-negativas, ativando a resposta imune do hospedeiro. A caracterização do perfil de linfócitos na resposta à tolerância ao LPS são de extrema importância para a contribuição do estudo da imunodepressão na sepse. O objetivo deste estudo foi investigar se a comprovada redução de mortalidade previamente vista em modelo de sepse animal através tolerância ao LPS, pode ser associada com o aumento da população de linfócitos T CD4+ regulatórios e Th17. Camundongos machos C57/6, receberam por via subcutânea ( s.c.) injecções de LPS ( 1mg/kg ) durante 5 dias , seguido por perfuração e ligadura cecal (CLP ) . Citocinas e linfócitos marcados foram medidos durante, após a tolerância e o desafio CLP. Ambos os subtipos de células T analisados Treg e Th17 , mostrou aumento destas células no baço durante e após a tolerância. Este estudo demonstrou que a mortalidade reduzida depois de tolerância previamente constatada pode ser associada com o aumento da população de células T regulatórias e Th17 devido a imunorregulação do hiperinflamação e recrutamento de neutrófilos / The control of pathological immune responses (autoimmunity, allergy, transplant rejection) has been a major goal of immunologists. Despite recent advances, most current treatments still seeks to reduce immunity and inflammation rather than restore the healthy state of immune tolerance. Sepsis is a disease triggered by the presence of bacteria and / or bacterial products like lipopolysaccharide (LPS), the main component of the outer membrane of gram-negative bacteria, activating the immune response of the host. The characterization of lymphocyte profile in response to LPS tolerance is extremely important for the study of immunosuppression in sepsis contribution. The aim of this study was to investigate whether the proven reduction in mortality seen previously in animal sepsis model by tolerance to LPS, can be associated with the increase in population of CD4 + regulatory and Th17. Mice C57 / 6 mice received subcutaneous (s.c.) injection of LPS (1mg / kg) for 5 days, followed by cecal ligation and puncture (CLP). Cytokines and marked lymphocytes were measured during after tolerance and CLP challenge. Both subtypes of T cells Treg and Th17 analyzed showed an increase of these cells in the spleen during and after tolerance. This study demonstrated that reduced mortality after previously seen tolerance may be associated with increasing the population of regulatory T cells and Th17 because immunoregulation of the hiperinflamação and neutrophil recruitment

A gengivite crônica e intratável observada em gatos infectados pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um problema bastante freqüente na clínica de pequenos animais. O papel do FIV na etiologia da estomatite persistente ainda está por ser determinado. As manifestações orais são freqüentemente os primeiros sintomas observados em pacientes humanos infectados pelo HIV e podem ser usadas como indicadores da progressão da doença. O objetivo do presente estudo foi quantificar os linfócitos T CD4+, T CD8+ e a razão CD4+/CD8+ em uma colônia de gatos com gengivite crônica e naturalmente infectados pelo FIV. Para tanto, foram utilizados 20 gatos, todos apresentando gengivite com graus variando de 1 a 4. Desse total, 10 gatos não eram infectados pelo FIV e os outros 10 felinos eram infectados pelo FIV. Utilizou-se como controle 20 gatos sem gengivite, sendo 10 infectados pelo FIV e outros 10 não infectados pelo Retrovírus. As contagens dos linfócitos T CD4+ e CD8+ foram realizadas utilizando-se a técnica de citometria de fluxo. Os resultados obtidos demonstraram que os gatos com gengivite e infectados pelo FIV apresentaram uma contagem significativamente menor de linfócitos T CD4+ quando comparado aos gatos com gengivite e não infectados pelo FIV. Não houve diferença significativa na contagem de linfócitos T CD8+ entre os gatos com gengivite, infectados ou não pelo FIV. A razão CD4+/CD8+ também se mostrou em declínio nos gatos com gengivite e infectados pelo FIV. Concluiu-se que nas condições do presente estudo, a infecção pelo FIV compromete a resposta imunológica de felino diante da inflamação gengival. / Chronic and intractable gingivitis in FIV-infected cats is a relatively common clinical problem in veterinary practice. The role of FIV in the etiology of persistent stomatitis is still undetermined. Oral manifestations often found in HIV-infected people are frequently the first clinical sign of the infection and can be considered as an indicator of the progression of the HIV infection. The purpose of this study was to evaluate the CD4+ and CD8+ T-lymphocytes count and CD4+:CD8+ ratio in a colony of cats with chronic gingivitis. To achieve these goals, a colony of twenty domestic shorthair cats was used. All cats had some degree of gingival inflammation with scores ranging from 1 through 4. Ten cats were FIV-positive and ten were FIV-negative. As a control, twenty cats without gingivitis were used (ten cats were FIV-positive and ten were FIV-negative). CD4+ and CD8+ T-lymphocytes counts were performed by means of flow cytometry in all forty cats and results compared. The results showed that cats with gingivitis and FIV-infected had a lower CD4+ T cells count than cats with gingivitis but not FIV-infected. There was no difference in CD8+ T lymphocytes count among the cats with gingivitis infected or not with the FIV. The CD4+:CD8+ ratio was lower in cats with gingivitis and FIV-infected. One can conclude that FIV infection induces immunological disorders in cats with gingival inflammation.

Sabe-se que o feto é vulnerável a modificações do millieu materno, especificamente, a exposição a um estressor ativa sistemas neuroendócrinos (expoentes o eixo hipotálamo-hipófise-adrenais HPA e o sistema nervoso autônomo simpático SNAS). Quando no terço final da gestação, essas mudanças podem interferir com o desenvolvimento/ maturação neuroimune. Estudos prévios de nosso grupo demonstraram que, o estresse pré-natal diminuiu significativamente a imunidade inata e aumentou o turnover de noradrenalina hipotalâmica de camundongos, dados que somados a outros de literatura levaram aos objetivos deste trabalho: analisar os efeitos de um estresse pré-natal sobre parâmetros de linfócitos de camundongos. Os resultados obtidos mostraram que a aplicação de choques nas patas (0,2 mA, 10 choques/sessão), tanto no terço final gestacional quanto após desafio agudo pós-natal, contudo, não modificou significativamente os parâmetros linfocitários avaliados. Baseado nisto, levantamos hipóteses: 1- a existência de vias de redundância fisiológica capacitaria o organismo a manter sua homeostasia frente aos estressores empregados; 2- inaptidão do modelo de estresse empregado; 3- ausência de desafio imune prévio à análise de um sistema que é responsivo (adaptativo). A primeira hipótese confirmou-se quando desenvolvemos como estresse pós-natal o modelo do estresse do metrô de Nova Iorque; a segunda hipótese confirmou-se também verdadeira através de desafio em modelo experimental de a asma OVA-induzida; finalmente, a terceira hipótese foi confirmada por estudos de outros autores. / As a consequence of his fast development, the fetus is vulnerable to modifications from the hormonal maternal millieu. This is explained mainly by the permeability of the placentary barrier to several hormones and substances. Specifically, it is known that the maternal exposition to a stressor activates neuroendocrine systems (exponents, the hypothalamus-pituitary-adrenal axis HPA, and the sympathetic autonomic nervous system SANS), causing an exaggerated production of neuropeptides, which have the potential to change the motherly-fetus homeostasis. When this unbalance occurs in the final three months of pregnancy, it may impact fetal systems that are still being developed/matured, as the immune and nervous systems. According to previous studies, the prenatal-stress proposed in this work was able to produce a significant decrease on innate immunity as assessed by the evaluation of the activity of peritoneal macrophages; it was also, a significant increment in hypothalamic noradrenaline turnover. Such prenatal events, could be derived and/or reflect a lost in adaptative immunity homeostasis. The objective of this work was, thus, to analyze lymphocyte parameters of prenatal stressed mice. A footshock stress (0,2 mA, 10 shocks of 5 seconds each/session) was applied both in the final third of gestation and/or in the postnatal adult life. Those stressors was anable to affect the lymphocytes viability and their subpopulation patterns token from peripheral blood; the esplenic lymphocytes proliferation ratio were also not changed. Those results suggested that: 1- the stress model was not effective; 2- the obtained results reflected the absence of an immune challenge applied previous by the experiments performedb; 3- the existence of physiologic redundancies turns the organisms able to react in a homeostatic way even exposed to stress situations.

A leptospirose é a zoonose mais comum, distribuída em todas as regiões do mundo e causada por bactérias virulentas do gênero Leptospira spp. A apresentação clínica da leptospirose varia de uma doença febril inespecífica a quadros graves com insuficiência renal aguda, icterícia, hemorragias graves, choque cardiovascular e falência de múltiplos órgãos. Pouco se sabe sobre a resposta imune do hospedeiro e os mecanismos patogênicos associados com a leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. O baço tem sido estudado e considerado nos últimos anos como um órgão essencial na fisiopatologia da sepse/choque séptico, uma vez que nele ocorre perda de células da imunidade, secundária à apoptose. Objetivos: descrever os achados histológicos e a resposta imune in situ do baço de pacientes falecidos por leptospirose com hemorragia pulmonar e choque refratário, comparando-os com dois grupos controles, um formado por pacientes falecidos por choque séptico causado por bactérias Gram-positivas/-negativas e um segundo, formado por vítimas de trauma. Metodologia: retrospectivamente, 11 baços de pacientes com leptospirose grave e 10 baços de pacientes com choque séptico foram obtidos por necrópsia e comparados com 12 baços de vítimas de trauma abdominal fechado (controles normais), obtidos por esplenectomia. Os achados histológicos da polpa vermelha e da polpa branca esplênica foram analisados por meio de escore semi-quantitativo. A reação de imunohistoquímica (IH) foi empregada para a marcação de células NK, S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+ e CD20+, bem como para células expressando caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL-10, IL-4 e TGF. A contagem de células marcadas foi realizada utilizando-se gratículo sobre 10 campos da polpa vermelha e 10 campos da polpa branca, escolhidos aleatoriamente. IH também foi realizada nos baços dos casos de leptospirose para a detecção de antígenos de Leptospira spp. Resultados: os baços de pacientes do grupo leptospirose e do grupo choque séptico demonstraram similaridades na análise histológica, divergindo do grupo trauma, com as seguintes alterações: congestão difusa da polpa vermelha com infiltração moderada a intensa de plasmócitos e polimorfonucleares e folículos da polpa branca com atrofia. A IH para antígenos de Leptospira foi positiva em oito (72,7%) amostras de baços do grupo leptospirose. Pela análise quantitativa das células marcadas pela IH, os seguintes resultados foram estatisticamente significantes: alta contagem de células S100+ no grupo leptospirose; alta densidade de células CD68+ no grupo choque séptico; baixa quantidade de células NK e TCD4+ nos grupos leptospirose e choque séptico; baixa quantidade de células TCD8+ nos casos de choque séptico e alta contagem de células CD20+ nos grupos leptospirose e choque séptico. Quanto às células expressando citocinas, encontrou-se alta quantidade de TNF nos pacientes do grupo leptospirose e grande número de células positivas para IL-10 nos grupos leptospirose e choque séptico. A expressão de IL-6, IFN, IL-1 e IL-2r foi insignificante nos baços dos três grupos estudados. Células expressando IL-12 foram encontradas apenas na polpa vermelha de casos de leptospirose. Conclusões: Semelhantes clinicamente aos casos de choque séptico, pacientes com leptospirose grave com choque apresentam disfunção endotelial difusa no baço, esplenite aguda e sinais de comprometimento da imunidade inata e adaptativa in situ no baço, caracterizado por uma baixa densidade de células NK, de células TCD4+ e baixa expressão de IL-6, IL-1, IL-2r, IFN e IL-12, com alta expressão de IL-10. Estes resultados sugerem que um estado de imunossupressão pontua a resposta imune do hospedeiro no estágio terminal da leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. A presença de antígenos de Leptospira nos baços de casos de leptospirose sugere que o agente etiológico contribui diretamente para a patogênese das lesões / Leptospirosis is the most common worldwide zoonosis caused by virulent bacteria from the genus Leptospira spp. The clinical presentation of leptospirosis ranges from unspecific febrile illness to severe forms with acute renal failure, jaundice, hemorrhages, shock and multi organ failure. Little is known about the hosts immune response and the pathogenic mechanisms involved in severe leptospirosis. In recent years the spleen has been considered a pivotal organ in the patophysiology of the sepsis/septic shock because immune cells are lost due to apoptosis in this organ Objectives: describe and compare the splenic histological features and the immune response in situ in patients who died of pulmonary hemorrhage and shock caused by leptospirosis, with spleens from patients who suffered from Grampositive/- negative septic shock and abdominal trauma. Methodology: in retrospect, 11 spleen tissue samples from patients with leptospirosis and 10 spleens from patients with septic shock were obtained by necropsy, and compared with 12 spleens obtained by splenectomy from patients with abdominal trauma. The histological features in the red pulp and white pulp were analyzed by a semi quantitative score. Immunohistochemistry (IH) methods for NK , S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+, CD20+ cells, caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL- 10, IL-4 and TGF were carried out and the stained cells were counted using a grid scale in ten fields of red pulp and white pulp chosen randomly. Also, IH was performed for Leptospira antigens in the leptospirosis patients. Results: the trauma group was totally different from the leptospirosis and septic shock patients which demonstrated strong similarities in the histological analysis: diffuse congestion in the red pulp with a moderate to intense infiltration of plasma cells, and polymorph nuclear cells, and follicles with marked atrophy. The Leptospira antigen was positive in eight (72,7%) spleen tissue samples from the leptospirosis group. By the IH methods and quantitative analysis, the following results reached statistical significance: high account of S100+ cells in the leptospirosis group; high density of CD68+ cells in the septic group; low density of NK and TCD4+ cells in the leptospirosis and septic groups; low quantities of TCD8+ cells in the septic group; high density of CD20+ cells in the leptospirosis and septic groups; high expression of TNF in the leptospirosis group and a strong expression of IL-10 in the leptospirosis and sepsis groups. The expression of IL-6, IFN, IL-1 and IL-2r was insignificant in all groups. IL-12 was only expressed in the red pulp of leptospirosis cases. Conclusion: similar to patients with septic shock, cases of severe leptospirosis (with pulmonary hemorrhage and shock) are associated with a splenic diffuse endothelial dysfunction, splenitis and signs of splenic disturbance in the innate and adaptative immunity in situ, characterized by an low density of NK cells, TCD4+ cells and low expression of IL-6, IL-1, IL-2r, IFN and IL-12 with a high expression of IL-10. These results suggest that an immunosuppressive state develops in the hosts immune response at the terminal stage of severe leptospirosis with pulmonary hemorrhage and shock. Also, the presence of leptospiral antigens in the spleen of the leptospirosis patients suggests the ethyological agent contributes directly to the pathogenesis of the lesions

A resposta imune ao P. chabaudi se caracteriza pela ativação policlonal de linfócitos B na fase aguda da doença, que resulta em uma intensa produção de anticorpos IgM e IgG de baixa afinidade e autoanticorpos. Apesar de esses anticorpos contribuírem para o controle da infecção, pode retardar a geração de anticorpos de alta afinidade que garantem a destruição dos parasitas e a proteção contra infecções subseqüentes. O nosso objetivo foi caracterizar os mecanismos envolvidos na ativação policlonal dos linfócitos B na infecção pelo P. chabaudi AS. Os nossos resultados mostraram que a cooperação T-B e importante nessa fase da infecção. Os ensaios in vitro mostraram que os linfócitos T da fase aguda da infecção são capazes de estimular linfócitos B naives, aumentando a expressão do CD69 e induzindo proliferação e produção de anticorpos. A molécula de classe II do MHC é importante na ativação policlonal dos linfócitos B, aumentando a expressão do CD69 e induzindo a proliferação de anticorpos, devido ao seu envolvimento na ativação dos linfócitos T. Assim, moléculas como CD28, CD40L e ICOS são importantes na ativação, proliferação e produção de anticorpos. / Polyclonal B cell activation is a feature of the early spleen B cell response to human and murine malaria, which results in intense production of parasite low-affinity IgM and IgG and autoantibodies. Although this response may contribute for the initial parasite control, it may also hinder the generation of high-affinity IgG that guarantees parasite elimination and protection against secondary infections. To characterize the mechanism involved in the polyclonal B cell response to P. chabaudi AS, we have analyzed in vivo and in vitro the role of several molecules known to be involved in antibody production. According to our in vivo results, this response depends on the cooperation of CD4+ T cells with B cells. The in vitro assays shows that the expression of MHC class II molecules is crucial for B cell activation in terms of CD69 expression, proliferation and antibody production, apparently due to their requirement for T cell activation. Signaling pathways mediated by the co-stimulatory receptor CD28, CD40L and ICOS has a central role for B cell proliferative response and antibody production. This study may help to clarify the molecular basis of polyclonal B cell activation induced during acute malaria.

A paracoccidioidomicose (PCM), doença sistêmica de caráter granulomatoso, é causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb). A gp43 secretada pelo Pb, possui um trecho específico de 15 aminoácidos designado como (P10), é reconhecido por linfócitos T. No presente trabalho, avaliamos a ativação da resposta imune e o efeito aditivo da imunização com o peptídeo P10, em camundongos induzidos à imunossupressão com dexametasona. Os resultados indicam um efeito aditivo da imunização com P10 e o tratamento com as drogas em camundongos BALB/c imunossuprimidos e infectados; associado a redução da carga fúngica no pulmão, baço e fígado desses animais, detectamos aumento de citocinas proinflamatorias, no homogenato de pulmão e no sobrenadante de cultura celular. Animais imunossuprimidos e imunizados com P10 apresentaram um aumento significativo na produção de Óxido Nítrico (NO). A eficiencia na resposta levou a um aumento na sobrevida de 100%. Estes resultados sugerem que o P10, representa uma alternativa promisoria na geração de uma vacina anti-PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides brasiliensis (Pb). The gp43 secreted by Pb has a 15-mer peptide designated as P10 that is recognized by T lymphocytes. In the present work we evaluated the activation of immune response and the additive effect of P10 immunization in BALB/c mice induzed to immunossupression with Dexamethasone. Results indicate an additive effect of P10 immunization and the treatment with drugs in BALB/c mice immunosuppressed and infected; associated with a significant reduction in fungal burden in the lung, spleen and liver of these animals. Also, we detected an increase of proinflammatory cytokines such as IFN-<font face=\"symbol\">g, TNF-<font face=\"symbol\">a e IL-12, in lung homogenates and cell culture supernatant. Immunosuppressed animals that were immunized with P10 showed an increase in the Nitric Oxide production. The efficiency of response led to a 100% survival in animals immunized with P10 and treated with antifungal drugs. Our results suggest that P10 represents a promising alternative of anti-PCM vaccine generation.

Neste trabalho, investigamos os mecanismos da resposta imune estimulados por PAS-1 para o desencadeamento do seu efeito modulatório na inflamação alérgica pulmonar. Para tanto, camundongos C57BL/6 selvagens, IL-12-/-, IFN-<font face=\"Symbol\">g-/- e IL-10-/- foram imunizados e desafiados com OVA ou PAS-1 ou OVA + PAS-1. Ainda, camundongos C57BL/6 imunizados e desafiados com OVA receberam transferência adotiva de células CD19+, B220+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD25-, CD4+CD25+ PAS-1-primadas. Nossos resultados demonstraram que o efeito imunomodulatório de PAS-1 é mediado por IFN-<font face=\"Symbol\">g e IL-10, mas não por IL-12, e que somente camundongos que receberam células CD8+ ou CD4+CD25+ não desenvolveram inflamação pulmonar e produziram, respectivamente, IFN-<font face=\"Symbol\">g e IL-10/TGF-ß. Em conjunto, estes resultados demonstraram que o efeito imunomodulatório de PAS-1 é devido à estimulação de células T CD8+ produtoras de IFN-<font face=\"Symbol\">g e por CD4+CD25+ secretoras de IL-10 e TGF-ß. / In this work, we investigate the immune response mechanisms triggered by PAS-1 to promote its immunomodulatory effect in the lung allergic inflammation. For that, wild type, IL-12-/-, IFN-<font face=\"Symbol\">g-/- and IL-10-/- C57BL/6 mice were immunized and challenged with OVA or PAS-1 or OVA + PAS-1. Moreover, wild type C57BL/6 mice were adoptively transferred with PAS-1-primed CD19+, B220+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD25-, and CD4+CD25+ lymphocytes. Our results demonstrated that the immunomodulatory effect induced by PAS-1 is mediated by IFN-<font face=\"Symbol\">g and IL-10, but not by IL-12, and only mice which received CD8+ or CD4+CD25+ T cells did not present lung allergic inflammation and produced IFN-<font face=\"Symbol\">g and IL-10/TGF-ß, respectively. Taken together, these results demonstrated that the imunomodulatory effect induced by PAS-1 is due to stimulating CD8+ T cells, which secrete IFN-<font face=\"Symbol\">g, and CD4+CD25+ T cells, which secrete IL-10 and TGF-ß.

As lesões periapicais são induzidas por uma infecção crônica da polpa dental. Antígenos microbianos estimulam a resposta imune específica e inespecífica nos tecidos apicais. Como consequência desse processo, diante da incapacidade das defesas do hospedeiro para erradicar a infecção, uma lesão periapical é formada, com o objetivo de restringir a invasão microbiana. O desenvolvimento da periodontite apical crônica depende de uma fina regulação da ativação dos linfócitos. A ativação das células T requer dois sinais, um mediado pelo complexo TCR, após o reconhecimento do antígeno, e o outro mediado pela interação dos receptores coestimulatórios. CD28 é um receptor coestimulatório, enquanto CTLA-4 e PD-1 induzem um sinal inibitório para a ativação de células T. Para compreender o envolvimento de células T na periodontite apical crônica, avaliamos a presença destas células na lesão periapical e os fatores coestimulatórios, citocinas e espécies reativas do oxigênio que estas células estariam produzindo. As amostras analisadas foram de tecido gengival para o grupo controle (n = 20) e lesões periapicais para o grupo com periodontite apical crônica (n = 20). Quanto ao perfil celular das lesões periapicais, os resultados mostraram que linfócitos T (59,3 ± 3,7%) foram as células predominantes, sendo a subpopulação CD4+ (72,7 ± 3,4%) a mais encontrada. A seguir, verificou-se a expressão de moléculas de superfície em células T. Observou-se que a expressão de CD28 (0,5 ± 0,5%) foi significativamente mais baixa em amostras de lesões periapicais que no grupo controle principalmente para linfócito T CD8+. Já CTLA-4 foi identificado em altos níveis para pacientes com periodontite apical tanto para CD3+CD4+ (86,1 ± 2,6%) quanto para CD3+CD8+ (59,8 ± 8,6%). PD-1 (73,5 ± 5,6%) e PD-L1 (59,8 ± 8,6%) apresentaram alta positividade para CD3+CD4+. Esses resultados indicaram um possível envolvimento da via de sinalização de PD-1 e PD-L1 na modulação da resposta de células T de pacientes com periodontite apical crônica. A dosagem de citocinas revelou alta positividade para todas as citocinas investigadas (TGF-; TNF-; IFN- e IL-10). Óxido Nítrico e mieloperoxidase produzidas por neutrófilos e responsáveis pela degradação tecidual também foram detectadas em altas doses nas amostras de pacientes com periodontite apical. O conhecimento sobre o papel das moléculas coestimulatórias na imunopatogênese da periodontite apical crônica servirá de base para o direcionamento de novas estratégias de prevenção, assim como o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos. / Periapical lesions are induced by the chronic infection of dental pulp. Microbial antigens stimulate both non-specific and specific immune response in periapical tissue. As a consequence of these processes and the inability of host defense mechanisms to eradicate infection, chronic periapical lesion are formed, with the aim of restricting microbial invasion. Negative co-stimulatory signals mediated via cell surface molecules such as cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and programmed death-1 (PD-1) play a critical role in down- modulation immune responses and maintaining peripheral tolerance. Both CTLA-4 and PD-1 are induced on actived T cell, and these are involved in the immunophatogenesis of periapical lesions. Inhibitory signals mediated via molecules such as programmed-death-1 (PD-1) play a critical role in down-modulating immune responses and maintaining peripheral tolerance. We investigated the involvement of cytokines and PD-1 engagement in mediating the T cell activation in chronic periapical diseases. Gingival samples from healthy individuals (n= 20) and patients with chronic periapical periodontitis (n= 20) were collected and used for the subsequent assays. The leukocytes in the lesion site were evaluated using flow cytometry. The production of cytokines interferon-gamma (IFN-), interleukin (IL)-10, tumor necrosis factor-alpha (TNF-) and transforming growth factor-beta (TGF-) was evaluated by ELISA. We observed a significant increase in the total number of leukocytes from periapical lesions as compared with healthy group. Our results for the composition of infiltrating cell in periapical lesion showed that the predominant cells were lymphocytes T (59,3 ± 3,7%) and contained a higher proportion of CD4+ cells (72,7 ± 3,4%). T cells from patients with periapical lesions expressed significantly higher levels of PD-1 (73,5 ± 5,6%) and PD-L1 (59,8 ± 8,6%). The levels of CTLA-4 were higher in CD3+CD4+ (86,1± 2,6%) and CD3+ CD8+ (59,8 ± 8,6%) cells, but in contrast the expression of CD28 was lower than control group. In addition, CD4+ and CD8+ T cells expressing PD-1 accumulate in lesions with chronic periapical periodontitis. Moreover, PD-L1 expression was intense in macrophage from patients. Our data clearly showed that lesions samples contained elevated amounts of TGF-, IL-10, TNF- and IFN- when compared with healthy gingival tissue from control individuals. These data show that PD-1 and CTLA-4 engagement could be involved in the modulation of T cells activation in patients with chronic periapical periodontitis.