Listeria monocytogenes é um bastonete Gram-positivo, anaeróbio facultativo, psicrotrófico, patogênico a humanos e transmitido por alimentos. É causador da listeriose, doença severa que acomete grupos de risco específicos, tais como idosos, imunocomprometidos, gestantes, crianças e recém-nascidos. Neste trabalho foi investigada a expressão diferencial de L. monocytogenes na presença de óleo essencial extraído de Baccharis psiadioides, planta da família Asteraceae popularmente chamada de “alecrim-do-campo”, “vassoura” ou “erva formiga”, utilizada pela população como planta medicinal. Além disso, os genomas de dois diferentes sorotipos de L. monocytogenes, frequentemente associados a surtos de listeriose, foram sequenciados através de plataforma MiSeq Illumina, sequências estas depositadas no GenBank, e comparados com genomas de referência. Anteriormente à execução das análises genômica e transcriptômica, foi determinada a composição do óleo essencial extraído de B. psiadioides utilizado nos experimentos, através de cromatografia gasosa com espectrômetro de massa (GC – MS), a qual demonstrou uma maior quantidade de β-pineno na fração composta majoritariamente por monoterpenos, composto este frequentemente encontrado em plantas medicinais aromáticas e apontado como um dos responsáveis pelo potencial antimicrobiano das mesmas. Os demais resultados obtidos no presente trabalho indicam que o óleo essencial testado apresenta potencial ação bacteriostática na concentração estudada, sendo que genes relacionados à virulência do microrganismo foram menos transcritos na sua presença, ao contrário do que foi observado para genes de resposta ao estresse, que apresentaram maiores níveis de transcrição nesta condição. A comparação genômica entre os genomas bacterianos sequenciados neste trabalho e as cepas referência sugere um maior número de proteínas expressas em L. monocytogenes do sorotipo 4b relacionadas à defesa e metabolismo do microrganismo, indicando mecanismos que podem estar envolvidos com a capacidade deste sorotipo estar mais envolvido nos casos humanos de listeriose. / LLiisstteerriiaa mmoonnooccyyttooggeenneess is a Gram-positive rod-shaped microorganism, facultative anaerobic, psychrotrophic, pathogenic to humans and transmitted by food. It causes listeriosis, a severe disease that affects specific risk groups such as elderly, immunocompromised, pregnant women, children and newborns. In this study, differential expression of LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess in the presence of essential oil extracted from BBaacccchhaarriiss ppssiiaaddiiooiiddeess, a plant from AAsstteerraacceeaaee family popularly named as "alecrim-do-campo", "vassoura" or "erva formiga" used by population as a medicinal plant, was investigated. In addition, the genomes of two different LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotypes, often associated with listeriosis outbreaks, were sequenced through the MiSeq Illumina platform. These sequences were deposited in GenBank and compared with reference genomes. Prior to the execution of genomic and transcriptomic analyzes, composition of the essential oil extracted from BB.. ppssiiaaddiiooiiddeess used in the experiments was determined by gas chromatography with mass spectrometer (GC-MS), which demonstrated a higher amount of β-pinene in the fraction composed mainly by monoterpenes. This compound is often found in aromatic medicinal plants and also pointed as one of those responsible for their antimicrobial potential. The other results obtained in the present study indicate that the essential oil tested has a potential bacteriostatic activity at the concentration studied, and genes related to the virulence of the microorganism were less transcribed in its presence, contrary to what was observed for stress response genes, which presented higher transcription levels on that condition. Comparative genomics between the bacterial genomes sequenced in this work and the reference strains suggests a higher number of proteins expressed in LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotype 4b related to the defense and metabolism of the microorganism, indicating mechanisms that may be involved with the greater ability of this serotype to cause human listeriosis.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-21Bitstream added on 2015-04-09T12:47:55Z : No. of bitstreams: 1 000816229.pdf: 479415 bytes, checksum: 4bb81de48800a0db8439726b0244f3da (MD5) / As esteiras condutoras de cortes são muito utilizadas nas áreas de manipulação de alimentos, sendo uma exigência da portaria n°210/MAPA a limpeza com água preferencialmente morna sob pressão. O uso de água neste processo tem sido questionada quanto a possibilidade de disseminação de micro-organismos. O presente trabalho teve por objetivo comparar as populações microbianas nas superfícies das esteiras condutoras (seca e úmida), com seus respectivos cortes de coxa com sobrecoxa desossada, colhidas em dois momentos diferentes e em dois pontos, no início e final das esteiras, quanto a população de micro-organismos heterotróficos aeróbicos mesófilos e psicrotróficos, enterobactérias e Staphylococcus spp. e presença de Listeria spp. e Listeria monocytogenes, assim como mensurar a quantidade de água utilizada durante a desossa pelo sistema autolimpeza das esteiras condutoras. Para tal, foram obtidos 80 chiffonettes das superfícies das esteiras condutoras, sendo 40 da seca e 40 da úmida e em cortes de coxa com sobrecoxa desossada foram colhidas mais 80 amostras, sendo 40 conduzidos pela esteira seca e 40 pela úmida. Para micro-organismos mesófilos, psicrotróficos e enterobactérias foram observadas diferenças significativas entre as populações encontradas na superfície da esteira úmida, o mesmo não foi observado para populações de Staphylococcus spp.. Para Listeria spp. foi observado um isolamento maior na esteira seca. Ao comparar os dois momentos e pontos de colheita, a população de psicrotróficos foi superior no final das esteiras, para os demais micro-organismos não foram observadas diferenças significativas. Entre os cortes conduzidos pelas esteiras seca e úmida, entre os momentos e pontos de colheita não foram observados diferenças significativas entre as populações dos diversos micro-organismos avaliados, somente para população de psicrotróficos a diferença foi signiticativa nos cortes ... / In poultry slaughterhouses, conveyor belts are common in meat handling areas. According to Brazilian legislation, cleaning of this equipment has to be done with heated and pressurized water. However, this process has been questioned based on the hypothesis that water might be responsible for propagation of microorganisms. This work aimed to compare microbial populations on the surface of conveyor belts (dry and wet) and on boneless chicken legs (consisting of thigh and drumsticks) in respect of heterotrophic aerobic mesophilic and psychrotrophic microorganisms, enterobacteria, Staphylococcus spp., Listeria spp. and Listeria monocytogenes. The samples were collected at two different moments and two points, at the beginning and end of the conveyor belts. Another objective of this study was to measure the amount of water used by the conveyor belts self-cleaning system during deboning. For such, 80 chiffonettes were collected from the conveyor belts surface (40 from dry equipment and 40 from wet equipment); and 80 samples, from boneless leg cuts (40 that were on the dry conveyor belt and 40 that were on the wet conveyor belt). Regarding mesophilic and psychrotrophic microorganisms, and enterobacteria, statistically significant differences were observed in terms of the populations found on the surface of the wet conveyor belt. The same was not observed for Staphylococcus spp. populations. It was also noticed greater isolation of Listeria spp. in samples from the dry conveyor belt. Comparing the two periods and sampling points, population of psychrotrophics was superior at the end of the conveyor belts and there were no statistically significant differences for the other microorganisms. Among cuts transported on dry or wet conveyor belts, in all moments and collecting points, statistically significant differences were not observed for the populations of the various microorganisms evaluated. Only for the psychrotrophic population ...

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes. / This project was developed at the Pathology Experimental Laboratory of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), after approval by the local Research Ethics Committee, and received partial financial support from the Research Incentive Fund (FIPE) of HCPA. The first experiment (or pilot scheme) aimed at implementing the immunohistochemistry (IHC) technique for the identification of Listeria monocytogenes (L.m.), by way of anti-listeria polyclonal antibody (Biodesign ). Several tests were performed in order to find the correct dilution (1:1000), which was different from that which had been recommended by the manufacturer. Paraffin-embedded blocks of placentas obtained from premature birth or abortion were used for the histological sections, and the slides were prepared for hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemistry. The slides were labeled with numbers in order to preserve patient anonymity. The result of HE staining revealed inflammatory disorders in eight placentas and L.m. was identified by IHC in five of them. The aim of the second experiment was to identify L.m. in the brain tissue of ruminants by employing the technique implemented in the pilot scheme. The material used in this study was provided by the Division of Veterinary Pathology of the Department of Pathology of Universidade Federal de Santa Maria. The animals studied (2 sheep, 1 goat and 2 cows) exhibited several clinical suspicions and the necropsy results were suggestive of the disease. The five cases were confirmed by IHC, highlighting the importance of this technique to the diagnosis of listeriosis in the CNS of ruminants. The aim of the third experiment was to identify L.m. in placentas and abortion specimens that had been referred to the Division of Pathology of HCPA in year 2000. As with the first experiment, the slides were numbered. After surveying the registries of pathoanatomical exams (PAs), we noted that 714 PAs corresponded to placentas, obtained from abortion, premature delivery and full-term birth, examined during that period. Two hundred fifty- four PAs were randomly selected (drawn out) for HE staining, and 148 of these PAs showed evidence of inflammatory disorders (chorioamnionitis, villitis and deciduitis). The blocks of these placentas were used for preparing the slides and carrying out IHC. The analysis of medical records in the cases with inflammatory disorders allowed us to observe that one of the records contained bacteriological confirmation of L.m. in the placenta (positive control). The negative control was chosen among the drawn-out PAs that did not present inflammatory disorders. L. m. was detected in 33.78% of the placentas analyzed by IHC. Chorioamnionitis and villitis showed significant statistical difference in the positive placentas. L. m. occurred in the 1st, 2nd and 3rd trimesters of pregnancy. The age of pregnant women, the cases of abortion and/or premature births were not statistically different as to the presence or absence of L. m. in the placentas. Habitual abortions occurred in patients with or without L. m in the placental tissue. Conclusion: Immunohistochemistry may be used to confirm the histopathological diagnosis of listeriosis in placentas and brain tissue of ruminants.

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-03-19T13:47:26Z No. of bitstreams: 1 PGCA17MA224.pdf: 1064233 bytes, checksum: 031ba44fb55de3f4ff7bd6dc82539958 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-19T13:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA17MA224.pdf: 1064233 bytes, checksum: 031ba44fb55de3f4ff7bd6dc82539958 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / FUMDES / Listeriosis is a disease caused by bacteria of the genus Listeria spp, especially Listeria monocytogenes, the nervous form is the most important and frequent manifestation, characterized by a fatal meningoencephalitis, which mainly affects ruminants. We describe the epidemiological data, clinical signs and lesions of 27 outbreaks of listeriosis nerve in sheep and two in goats, diagnosed in the Laboratory of Animal Pathology (LAPA/CAV) between january 2007 and november 2015, in Santa Catarina. During this period, the disease occurred in the regions of Planalto Serrano, Alto Vale do Itajaí, North, Midwest, West and Florianópolis region. The animals affected were evaluated clinically and after worsening the clinical condition, were euthanized and necropsied with subsequent evaluation of macroscopic lesions, collection of viscera samples for histopathological examination and submission of refrigerated central nervous system samples for bacterial isolation. Silage samples from the properties where the outbreaks occurred were also sent with the same purpose. Sheep and goats presented clinical neurological signs such as incoordination, tournament, torticollis, salivation, protrusion and flaccidity of the tongue, unilateral palpebral, atrial and labial ptosis, as well as congestion of ocular mucosa and hyperthermia. The clinical condition varied from 5 to 10 days. All animals died even treated with antibiotics. At necropsy, small areas of dark and/or yellowish color were observed in the midbrain and hyperemia of the piamater. Histological lesions were characterized by perivascular mononuclear infiltrate and multifocal neutrophils in the central nervous system. The bacterial isolation was positive for the species Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria welshimeri and Listeria grayi / Listeriose é uma enfermidade provocada por bactérias do gênero Listeria spp, especialmente Listeria monocytogenes, sendo a forma nervosa a manifestação mais importante e frequente, caracterizada por um quadro de meningoencefalite fatal, que acomete principalmente ruminantes. Descrevem-se os dados epidemiológicos, sinais clínicos e lesões de 27 surtos de listeriose nervosa em ovinos e dois em caprinos, diagnosticados no Laboratório de Patologia Animal (LAPA/CAV) no período entre janeiro de 2007 a novembro de 2015, no estado de Santa Catarina. Durante este período, a doença ocorreu nas regiões do Planalto Serrano, Alto Vale do Itajaí, Norte, Oeste, Meio Oeste e Grande Florianópolis. Os animais acometidos foram avaliados clinicamente e após agravamento do quadro clínico, foram eutanasiados e necropsiados com posterior avaliação das lesões macroscópicas, coleta de amostras de vísceras para processamento histopatológico e envio de amostras refrigeradas de sistema nervoso central para isolamento bacteriano. Amostras de silagem provenientes das propriedades onde ocorreram os surtos também foram enviadas com a mesma finalidade. Os ovinos e caprinos apresentaram sinais clínicos neurológicos como incoordenação, torneio, torcicolo, salivação, protrusão e flacidez de língua, ptose palpebral, auricular e labial unilaterais, além de congestão de mucosa ocular e hipertermia. O quadro clínico variou de 5 a 10 dias. Todos os animais morreram mesmo tratados com antibióticos. Na necropsia foram observadas pequenas áreas de coloração escura e/ou amareladas no mesencéfalo e hiperemia da piamáter. As lesões histológicas foram caracterizadas por infiltrado mononuclear perivascular e de neutrófilos, multifocal, no sistema nervoso central. O isolamento bacteriano foi positivo para as espécies Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria welshimeri e Listeria grayi

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 781465 bytes, checksum: 3b08d22f3a340c15fbd55a6c93d948c6 (MD5) Previous issue date: 2011-02-22 / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen and differs from other pathogens by its psycrotrophic characteristic, due to its ability of growing at refrigerator temperatures. This pathogen is also known as resistant to pH changes and different concentrations of NaCl. However, its main form of resistance is conferred by its ability to adhere and form biofilms. In this work, besides studying the adhesion of L. monocytogenes in different culture conditions, we performed a molecular technique, pulsed‐field gel electrophoresis (PFGE), to characterize distinct cultures isolates from beef processing plants. First, tests were conducted to evaluate the adhesion of L. monocytogenes cultures using a method with microtiter plates considering distinct inoculums concentrations. In a second step, the adhesion ability was evaluated considering distinct culture media (brain‐heart infusion ‐ BHI, trypticase soy broth ‐ TSB, beef extract ‐ BE, all at their usual composition and diluted at 1:10), carbohydrate sources (rhamnose, glucose, fructose and maltose), NaCl concentrations (0.5%, 2.5%, 5.0%, 7.5% and 10.0%), pH (5.0, 7.0 and 9.0), and incubation temperatures (4 °C, 10 °C, 25 °C and 35 °C). After assessing the adhesion of Listeria monocytogenes, will be performed pulsed field gel electrophoresis to assess the genetic profile of each isolate. With this technique, we can classify the isolates according to their profiles and to correlate the enzymatic capacity to adhere to the origin in the processing of beef. Considering the initial results, all cultures were tested at 108 CFU/mL e classified as their adhesion ability: weak (8 cultures), moderate (17) and strong (4). The cultures presented higher adhesion ability at non‐diluted cultures media (mainly brain and heart infusion), pH 7.0, incubation at 25 and 37 °C, and NaCl concentrations of 5 and 7%. No relevant differences were observed for adhesion considering the distinct carbohydrate sources. The cultures were characterized by PFGE, using AscI and ApaI as restriction enzymes. The analysis identified two clusters for serotypes 4b and 1/2a with similarities of 48% and 68% respectively, evidencing the persistence of some strains in the environment of beef production and processing. The obtained results indicated that the adhesion of L. monocytognes is related to their optimal growing conditions, despite a wide variation of characterized pulsotypes. / Listeria monocytogenes é um patógeno alimentar e se diferencia dos demais patógenos por apresentar características psicotróficas, podendo se desenvolver em temperaturas de refrigeração. Este patógeno também é conhecido por resistir a variações de pH e diferentes concentrações de NaCl. Entretanto, sua principal forma de resistência é conferida pela sua capacidade de adesão e de formar biofilmes. Neste trabalho, a capacidade de adesão de 29 culturas de L. monocytogenes isoladas de plantas de processamento de carne bovina foi avaliada considerando diferentes condições de cultivo, e caracterizadas através da técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Inicialmente, as culturas foram avaliadas quanto a capacidade de adesão pelo método com placas de microtitulação considerando diferentes concentrações populacionais dos inóculos. Em seguida, as culturas foram avaliadas quanto a capacidade de adesão pelo mesmo procedimento considerando diferentes meios de cultura (infusão cérebro‐coração ‐ BHI, caldo tripticase de soja ‐ TSB, caldo de carne ‐ CC, todos em suas composições usuais e diluídos 1:10), fontes de carboidratos (rhamnose, glicose, frutose e maltose), concentrações de NaCl (0.5%, 2.5%, 5.0%, 7.5% e 10.0%), pH (5.0, 7.0 e 9.0), e temperaturas de incubação (4 °C, 10 °C, 25 °C e 35 °C). Considerando os resultados iniciais, todos os testes foram conduzidos com as culturas em concentração aproximada de 108 UFC/mL, e classificadas quanto a sua capacidade de adesão: fraca (8 culturas), moderada (17) e forte (4). Em geral, as culturas apresentaram maior taxa de adesão em meio de cultura BHI, com pH 7,0, incubação a 25 e 37°C, e em concentrações de NaCl a 5,0 e 7,0%. Não foram observadas diferenças relevantes entre as taxas de adesão considerando diferentes fontes de carboidrato. A caracterização molecular das culturas foi realizada pela técnica de PFGE utilizando as enzimas de restrição AscI e ApaI. PFGE produziu clusters para os sorotipos 4b e 1/2a, com similaridades de 48% e 68% respectivamente, e evidenciou a persistência de algumas cepas no ambiente de produção e manipulação de carne bovina. Os resultados obtidos evidenciam que a capacidade de adesão de L. monocytogenes está relacionada às suas condições ideais de desenvolvimento, além de grande variação nos pulsotipos caracterizados.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1233057 bytes, checksum: 7aee1afa76fe5f068f40317eabe22e61 (MD5) Previous issue date: 2011-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine meat production is a fundamental sector of land business in Brazil. Brazil is the second world producer of beef and the first world exporter, to over one hundred countries worldwide. The preservation of these markets depend on the compliance to a broad set of laws established by the importing countries in order to preserve their herds health, consumer protection and to promote the consolidation of international market relationship. Importers countries legislation have always been a model for development of such norms in Brazil. European laws have always been an important model for Brazil, as Europe has been, until the end of the decade of 1990 the most important importer of Brazilian beef. Still today, even if Europe is no longer the most relevant market for Brazilian bovine meat, it requires attention as it pays more than the others to have Brazilian beef. Generally food safety laws are based on the application of worldwide known procedures such as the good handling procedures (GHP) and the Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP). The guarantee of microbiological safety of exported beef is certified through the direct search for pathogenic microorganisms or through the indirect search for hygiene indicating bacteria. The most commonly searched bacteria are the mesophilic aerobic count (AM), Enterobacteriaceae (EB), total coliforms (CT) and Escherichia coli (EC). For what concerns to pathogenic bacteria, Listeria monocytogenes stands out for its association to beef products and its high pathogenicity. From September, 2009, until November, 2010, we analysed 103 bovine carcasses slaughtered in 3 abattoirs in the state of Minas Gerais. In any carcass we collected swab samples after bleeding (A), after hide removal (B), after evisceration and carcass splitting (C) and after final washing, before chilling (D). The samples were analysed for the counting of indicating bacteria (AM, EB, CT, EC, using Petrifilm platesTM) and for the presence of Listeria spp. And L. monocytogenes, according to ISO 11.290-1 protocol. Those isolates, suspected to be Listeria spp. Were submitted to a multiplex PCR protocol for the confirmation of genus and the identification of L. monocytogenes. All indicating bacteria showed significant different concentration (P < 0,05) between the point A and the followings. AM also showed significant different concentration between point C ant the others (P < 0,05) and CT showed significant differences between points B and C (P < 0,05). We found Listeria spp. In 28 carcasses. Among these, 4 were positive for L. monocytogenes. The contamination for Listeria spp. was significant concentrated at point A (P < 0,05). For the low number of isolates we couldn t find significant contamination points for L. monocytogenes (P > 0,05), even if it was more concentrated at point A than at the others. The indicating bacteria count and the prevalence of Listeria spp. and L. monocytogenes were lower than found in literature, indicating that in the abattoirs we analysed, good hygienic procedures are adopted during slaughtering and carcass processing, helping to obtain a proper reduction of indicating bacteria, Listeria spp. and L. monocytogenes. / A produção de carne bovina é um elemento fundamental do setor agropecuário no Brasil. Atualmente o país é o segundo maior produtor e o primeiro exportador deste alimento para mais de cem países no mundo inteiro. A manutenção desses mercados requer o cumprimento das leis, estabelecidas pelos países importadores, com o fim de proteger a saúde do rebanho, dos consumidores e promover a consolidação dos parceiros comerciais internacionais. As legislações dos países importadores sempre foram um modelo para o desenvolvimento das normas no Brasil. As legislações européias possuem grande destaque, uma vez que a Europa foi principal mercado de carne bovina para o Brasil até a década de 1990. Atualmente a Europa já não é mais o maior importador, mas sempre tem destaque pela alta valorização da carne bovina brasileira. Geralmente as legislações relacionadas à segurança dos alimentos são baseadas na análise dos riscos e na aplicação de ferramentas de controle, como as boas práticas de produção e análise de perigos e pontos críticos de controle. A garantia da segurança microbiológica das carnes exportadas é certificada realizando a pesquisa direta dos patógenos ou a pesquisa indireta, avaliando a contaminação por microrganismos indicadores de higiene. Os grupos microbianos mais frequentemente pesquisados são aeróbios mesófilos (AM), enterobactérias (EB), coliformes totais (CT) e Escherichia coli (EC). Em relação a patógenos, Listeria monoctyogenes possui grande destaque devido a sua alta associação com produtos cárneos e alta patogenicidade. De Setembro de 2009 a Novembro de 2010, foram analisadas 103 carcaças de bovinos abatidos em 3 abatedouros fiscalizados pelo Serviço de Inspeção Federal no estado de Minas Gerais. Em cada carcaça foram coletadas amostras superficiais pela técnica do esfregaço depois da sangria (ponto A), depois da esfola (ponto B), depois da evisceração e divisão da carcaça ao meio (ponto C) e antes da entrada na câmara de refrigeração (ponto D). As amostras foram submetidas a análises microbiológicas para enumeração de microrganismos indicadores de higiene (AM, EB, CT e EC, usando placas Petrifilm ), e pesquisa de Listeria spp. e L. monocytogenes (ISO 11.290-1). Os isolados caracterizados como suspeitos de Listeria spp. foram submetidos a um protocolo de PCR multiplex para confirmação do gênero e identificação da espécie L. monocytogenes. Para todos os microrganismos indicadores enumerados foram verificadas diferenças significativas (P < 0,05) entre as contagens observadas no ponto A e as demais. AM apresentaram diferenças significativas (P < 0,05) de contaminação entre o ponto C e os outros pontos de coleta. CT mostraram diferenças significativas de contaminação (P < 0,05) entre os pontos B e C. Foram encontradas 28 carcaças positivas para Listeria spp. Entre estas, 4 foram positivas por L. monocytogenes. Houve uma significativa concentração da contaminação por Listeria spp. no ponto A (P < 0,05), sem diferenças significativas de contaminação entre os pontos considerando L. monocytogenes (P > 0,05). A ocorrência observada de Listeria spp. e L. monocytogenes foi menor que a observada na literatura consultada, assim como as contagens dos microrganismos indicadores de higiene. Esses resultados indicam que os frigoríficos analisados aplicam procedimentos higiênicos adequados nos processos de abate de bovinos e obtenção de carcaças, auxiliando a redução dos níveis de contaminação por microrganismos indicadores de higiene e ocorrência de Listeria spp. e L. monocytogenes.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1420227 bytes, checksum: 6a4ef5b8564c78036999d045362d4595 (MD5) Previous issue date: 2013-07-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen often associated to beef cuts and meat products. Its presence in beef cuts is usually related to cross contamination during processing, once L. monocytogenes is naturally part of its environmental microbiota. The consumption of food contaminated with this pathogen, mainly ready-to-eat products, can determine listeriosis, a severe disease specially to risk groups such as pregnant women, children, elderly, and immune-compromised adults, leading to mortality rates of 20 to 30% in cases of systemic infection. Despite listeriosis being considered as an infrequent disease, its high severity and mortality and consequent economic losses determine a wide range of studies focusing on L. monocytogenes. The present study aimed the assessment of the occurrence of Listeria spp. and L. monocytogenes in a beef processing plant and beef cuts, and the characterization of the obtained isolates by phenotypic and molecular methodologies. A total of 272 environmental, utensils and beef cuts samples was collected between 2009 and 2012 in a slaughterhouse located in Minas Gerais state, Brazil. Samples were obtained by surface swabbing (400 cm²) and subjected to Listeria spp. and L. monocytogenes detection according protocols ISO 11290-1 and ISO 11290-2. Suspect isolates were subjected to biochemical identification, molecular serotyping, sequencing of atypical PCR products, pulsed field gel electrophoresis (PFGE), detection of virulence genes by PCR (inlA, inlB, inlC, inlJ, plcA, hlyA, actA e iap), and phenotypic tests of antimicrobials resistance. Listeria spp. was identified in 61 samples (22.4%), being L. monocytogenes in 23 (8.5%), L. innocua in 46 (16.9%), and L. seeligeri in 1 (0.37%). A total of 231 isolates was obtained and identified as L. monocytogenes (96), L. innocua (129), and L. seeligeri (6). Among L. monocytogenes isolates, 1/2c or 3c serotype was the most prevalent (74/96), being present in 21 of the 23 positive samples; 15 isolates were identified as serotype 4b atypical and 7 as serotype 1/2b, 3b or 7. PFGE demonstrated the genetic diversity of the isolates and indicated possible contamination routes in the beef processing environment. The isolates were clustered in 6 major groups and 20 pulsetypes after macro-restriction by ApaI and AscI. Isolates with distinct serotypes were grouped in same groups, but never in a same pulsetype. Isolates obtained from distinct samples presented identical genetic profile, as observed in isolates obtained from distinct sampling visits. All tested virulence genes were identified in all L. monocytogenes isolates. Based on PFGE, 20 isolates were selected and tested by phenotypic tests to identify their resistance profiles against 15 antimicrobials; the isolates presented sensitivity to all tested antimicrobials, but 19 isolates were resistant to sulfamethoxazole and 2 also to trimethoprim. Other 2 isolates presented multidrug resistance (gentamicin, tobramycin, clindamycin, trimethoprim, and sulfamethoxazole) and 8 isolates presented intermediary resistance to erythromycin. The obtained data indicate the persistence of L. monocytogenes strains in the beef environment processing of the studied slaughterhouse, possible contamination routes, and the occurrence of multi-drug resistant isolates, to antimicrobials usually considered in the listeriosis treatment. / Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar frequentemente associado à carne bovina e produtos cárneos. A presença de L. monocytogenes em cortes cárneos normalmente está associada a contaminações cruzadas durante o processamento, já que esta bactéria está naturalmente presente no ambiente industrial. O consumo de alimentos contaminados por L. monocytogenes, principalmente alimentos prontos para consumo, pode causar a listeriose, considerada uma doença grave que acomete principalmente indivíduos de grupos de risco como gestantes, crianças, idosos e adultos imunocomprometidos, levando a uma alta taxa de mortalidade (20 a 30%) nos casos de infecção sistêmica. A listeriose é considerada uma doença rara, mas L. monocytogenes tem sido alvo de muitas pesquisas nas últimas décadas devido à severidade da doença, da alta taxa de mortalidade e aos prejuízos econômicos causados. Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar a ocorrência de Listeria spp. e L. monocytogenes em uma planta de processamento de carne bovina e cortes cárneos e caracterizar por técnicas fenotípicas e moleculares os isolados obtidos. Um total de 272 amostras de ambiente, utensílios e cortes cárneos foi analisado entre os anos de 2009 e 2012, todas coletadas em um frigorífico localizado no Estado de Minas Gerais. Todas as amostras foram obtidas por swab superficial (400 cm²) e submetidas à detecção de Listeria spp. e L. monocytogenes pelos protocolos ISO 11290-1 e ISO 11.290-2 (2004) e isolados suspeitos foram submetidos a identificação bioquímica, sorotipagem molecular, sequenciamento dos produtos atípicos, eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE), detecção de genes de virulência (inlA, inlB, inlC, inlJ, plcA, hlyA, actA e iap) e testes de resistência a antimicrobianos. Listeria spp foi identificada em 61 (22.4%) das amostras analisadas, L. monocytogenes em 23 (8.5%), L. innocua em 46 (16.9%), e L. seeligeri em 1 (0.37%). Um total de 231 isolados foi obtido e identificado como L. monocytogenes (n = 96), L. innocua (n = 129), L. seeligeri (n = 6). Entre os isolados de L. monoytogenes, sorotipo 1/2c ou 3c foi o mais prevalente (74/96), estando presente em 21/23 amostras, seguido pelo sorotipo 4b atípico (15/96) e sorotipo 1/2b, 3b ou 7 (7/96). PFGE mostrou a diversidade genética entre os isolados e indicou possíveis rotas de contaminação dentro do ambiente de processamento de carne bovina. Os 96 isolados foram agrupados em 6 grupos subdivididos em 20 pulsotipos através da combinação dos padrões de restrição das enzimas ApaI e AscI. Diferentes sorotipos compartilharam mesmos grupos genéticos, mas não o mesmo pulsotipo. Ainda foi verificado que isolados recuperados de diferentes origens apresentaram mesmo perfil genético, e alguns isolados obtidos em diferentes visitas também foram agrupados no mesmo pulsotipo. Todos os genes de virulência (inlA, inlB, inlC, inlJ, plcA, hlyA, actA e iap) investigados foram detectados em todos os isolados de L. monocytogenes. De maneira geral, os 20 isolados testados (um representante de cada pulsotipo) apresentaram sensibilidade à maioria dos antimicrobianos, entretanto 19 isolados foram resistentes a sulfametoxazole e dois também foram resistentes a trimetropim. Outros dois isolados apresentaram múltipla resistência (gentamicina, tobramicina, clindamicina, trimetoprim, e sulfametoxazole) e oito mostraram resistência intermediária a eritromicina. Os dados obtidos indicam a persistência de cepas de L. monocytogenes no ambiente de processamento de carne bovina, possíveis rotas de contaminação, e a ocorrência de isolados multi-resistentes a antimicrobianos usualmente utilizados no tratamento de listeriose.

Orientador: Ana Maria Centola Vidal Martins / Coorientador: Karina Paes Bürger / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Rachel Zoccal Saba / Resumo: As esteiras condutoras de cortes são muito utilizadas nas áreas de manipulação de alimentos, sendo uma exigência da portaria n°210/MAPA a limpeza com água preferencialmente morna sob pressão. O uso de água neste processo tem sido questionada quanto a possibilidade de disseminação de micro-organismos. O presente trabalho teve por objetivo comparar as populações microbianas nas superfícies das esteiras condutoras (seca e úmida), com seus respectivos cortes de coxa com sobrecoxa desossada, colhidas em dois momentos diferentes e em dois pontos, no início e final das esteiras, quanto a população de micro-organismos heterotróficos aeróbicos mesófilos e psicrotróficos, enterobactérias e Staphylococcus spp. e presença de Listeria spp. e Listeria monocytogenes, assim como mensurar a quantidade de água utilizada durante a desossa pelo sistema autolimpeza das esteiras condutoras. Para tal, foram obtidos 80 chiffonettes das superfícies das esteiras condutoras, sendo 40 da seca e 40 da úmida e em cortes de coxa com sobrecoxa desossada foram colhidas mais 80 amostras, sendo 40 conduzidos pela esteira seca e 40 pela úmida. Para micro-organismos mesófilos, psicrotróficos e enterobactérias foram observadas diferenças significativas entre as populações encontradas na superfície da esteira úmida, o mesmo não foi observado para populações de Staphylococcus spp.. Para Listeria spp. foi observado um isolamento maior na esteira seca. Ao comparar os dois momentos e pontos de colheita, a população de psicrotróficos foi superior no final das esteiras, para os demais micro-organismos não foram observadas diferenças significativas. Entre os cortes conduzidos pelas esteiras seca e úmida, entre os momentos e pontos de colheita não foram observados diferenças significativas entre as populações dos diversos micro-organismos avaliados, somente para população de psicrotróficos a diferença foi signiticativa nos cortes ... / Abstract: In poultry slaughterhouses, conveyor belts are common in meat handling areas. According to Brazilian legislation, cleaning of this equipment has to be done with heated and pressurized water. However, this process has been questioned based on the hypothesis that water might be responsible for propagation of microorganisms. This work aimed to compare microbial populations on the surface of conveyor belts (dry and wet) and on boneless chicken legs (consisting of thigh and drumsticks) in respect of heterotrophic aerobic mesophilic and psychrotrophic microorganisms, enterobacteria, Staphylococcus spp., Listeria spp. and Listeria monocytogenes. The samples were collected at two different moments and two points, at the beginning and end of the conveyor belts. Another objective of this study was to measure the amount of water used by the conveyor belts self-cleaning system during deboning. For such, 80 chiffonettes were collected from the conveyor belts surface (40 from dry equipment and 40 from wet equipment); and 80 samples, from boneless leg cuts (40 that were on the dry conveyor belt and 40 that were on the wet conveyor belt). Regarding mesophilic and psychrotrophic microorganisms, and enterobacteria, statistically significant differences were observed in terms of the populations found on the surface of the wet conveyor belt. The same was not observed for Staphylococcus spp. populations. It was also noticed greater isolation of Listeria spp. in samples from the dry conveyor belt. Comparing the two periods and sampling points, population of psychrotrophics was superior at the end of the conveyor belts and there were no statistically significant differences for the other microorganisms. Among cuts transported on dry or wet conveyor belts, in all moments and collecting points, statistically significant differences were not observed for the populations of the various microorganisms evaluated. Only for the psychrotrophic population ... / Mestre

Este estudo objetivou analisar o potencial de deterioração da microbiota psicrotrófica presente em presunto cozido fatiado comercializado entre Maio e Junho de 2015 e Fevereiro e Março de 2016 no mercado público da cidade de Porto Alegre/RS e avaliar a influência de fatores ambientais na qualidade microbiológica do mesmo. Os presuntos foram coletados em 4 bancas desse local e foram realizadas contagens de bactérias psicrotróficas de 8 amostras e pesquisa de Listeria monocytogenes. Selecionaram-se 134 colônias de psicrotróficos isolados de presunto fatiado, 71 deles apresentaram atividade proteolítica, 58 atividade lipolítica e 12 apresentaram produção de exopolissacarídeo. Selecionaram-se 2 bactérias com a presença dessas atividades para identificação molecular, as quais foram identificadas como Kluyvera sp. e Carnobacterium sp. Além delas, mais 2 Listeria monocytogenes isoladas nesse trabalho foram submetidas ao teste de produção de biofilme, resultando como fracas formadoras e também ao teste de aderência em aço inoxidável, todas apresentando capacidade de adesão. A pesquisa de Listeria monocytogenes nos presuntos fatiados mostrou 100% de presença, sendo que 50% foram identificadas como L. monocytogenes, as quais pertenceram aos sorotipos 1/2a (1), 1/2b (2), 1/2c (2). Realizou-se análise de presunto cozido inteiro, em sua embalagem original, sendo que não foram encontrados micro-organismos Tratou-se o presunto fatiado com extrato de hibisco a 40% e pediocina a 0,5% e 1,0% e realizou-se contagem de mesófilos, psicrotróficos, Listeria spp., S. aureus e E.coli. O extrato de hibisco reduziu a carga desses micro-organismos. Pediocina 0,5% e 1% apresentaram pouca ação frente ao controle de mesófilos, psicrotróficos e E. coli, mas mantiveram a carga de S. aureus controlada e foram eficazes contra Listeria spp. Foram realizadas também contagens para Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesófilos e psicrotróficos em suabes oriundos de fatiador de alimentos, superfície de contato e utensílio utilizados nas bancas do mercado público. Em conclusão grande parte dos psicrotróficos apresentou atividade proteolítica e lipolítica, as quais alteram organolepticamente o alimento. Alguns apresentaram produção de biofilme e capacidade de aderência, fato indesejado, pois sua remoção é mais difícil no ambiente industrial, com isso nota-se que a legislação brasileira apresenta carência na contagem de psicrotróficos em produtos cárneos. / This study aimed to evaluate the microbiota present in sliced cooked ham sold in the public market in Porto Alegre/RS and evaluate the ability of compounds with antimicrobial activity of hibiscus extract and pediocin to control the microbiota found. Ham collected was stored refrigerated until to arrive the laboratory for analysis. Psychrotrophic bacteria counts were performed. Were selected 134 colonies of psychrotrophic microorganisms isolated for sliced ham and 71 of them showed proteolytic activity, 58 lipase activity, 12 showed production of exopolysaccharide. Two of these bacteria were selected for molecular identification which were identified as Kluyvera sp. and Carnobacterium sp. These two bacteria plus two Listeria monocytogenes isolated for sliced ham were subjected to testing of biofilm production (resulting as weak forming of biofilm) and were tested for adhesion in stainless steel and all showed this property. The research of Listeria spp. in sliced cooked ham showed 100% of presence, which 50% were identified as L. monocytogenes to serotypes 1/2a (1) 1/2b (2), 1/2c (2). Analysis was carried out of a whole piece of cooked ham in its original packaging and none microorganisms were found. The sliced ham was treated with hibiscus extract of 40% and pediocin of 0.5% and 1.0% and has been mesophilic, psychrotrophic, Listeria spp., S. aureus and E. coli counts The hibiscus extract reduced the quantity of these microorganisms. Pediocin 0.5% and 1,0% had little action against the control of mesophilic, psychrotrophic and E. coli, but in S. aureus counts were controlled bacteria charge and were effective against Listeria spp.. Also counts of Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesophilic and psychrotrophic bacteria were performed from swabs of slicer food, contact surface and food tool (knife or spatula) used in public market stalls. In conclusion, most of the psychrotrophs presented proteolytic and lipolytic activity, which alter organoleptically the food. Some of them have presented biofilm production and adhesion capacity, undesirable fact because when the biofilm is formed is more difficult to remove it in the industrial environment. With this it is showed that the brazilian legislation presents a lack in the research of psychrotrophs in meat products kept refrigerated.

Listeria monocytogenes é um bastonete Gram-positivo, anaeróbio facultativo, psicrotrófico, patogênico a humanos e transmitido por alimentos. É causador da listeriose, doença severa que acomete grupos de risco específicos, tais como idosos, imunocomprometidos, gestantes, crianças e recém-nascidos. Neste trabalho foi investigada a expressão diferencial de L. monocytogenes na presença de óleo essencial extraído de Baccharis psiadioides, planta da família Asteraceae popularmente chamada de “alecrim-do-campo”, “vassoura” ou “erva formiga”, utilizada pela população como planta medicinal. Além disso, os genomas de dois diferentes sorotipos de L. monocytogenes, frequentemente associados a surtos de listeriose, foram sequenciados através de plataforma MiSeq Illumina, sequências estas depositadas no GenBank, e comparados com genomas de referência. Anteriormente à execução das análises genômica e transcriptômica, foi determinada a composição do óleo essencial extraído de B. psiadioides utilizado nos experimentos, através de cromatografia gasosa com espectrômetro de massa (GC – MS), a qual demonstrou uma maior quantidade de β-pineno na fração composta majoritariamente por monoterpenos, composto este frequentemente encontrado em plantas medicinais aromáticas e apontado como um dos responsáveis pelo potencial antimicrobiano das mesmas. Os demais resultados obtidos no presente trabalho indicam que o óleo essencial testado apresenta potencial ação bacteriostática na concentração estudada, sendo que genes relacionados à virulência do microrganismo foram menos transcritos na sua presença, ao contrário do que foi observado para genes de resposta ao estresse, que apresentaram maiores níveis de transcrição nesta condição. A comparação genômica entre os genomas bacterianos sequenciados neste trabalho e as cepas referência sugere um maior número de proteínas expressas em L. monocytogenes do sorotipo 4b relacionadas à defesa e metabolismo do microrganismo, indicando mecanismos que podem estar envolvidos com a capacidade deste sorotipo estar mais envolvido nos casos humanos de listeriose. / LLiisstteerriiaa mmoonnooccyyttooggeenneess is a Gram-positive rod-shaped microorganism, facultative anaerobic, psychrotrophic, pathogenic to humans and transmitted by food. It causes listeriosis, a severe disease that affects specific risk groups such as elderly, immunocompromised, pregnant women, children and newborns. In this study, differential expression of LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess in the presence of essential oil extracted from BBaacccchhaarriiss ppssiiaaddiiooiiddeess, a plant from AAsstteerraacceeaaee family popularly named as "alecrim-do-campo", "vassoura" or "erva formiga" used by population as a medicinal plant, was investigated. In addition, the genomes of two different LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotypes, often associated with listeriosis outbreaks, were sequenced through the MiSeq Illumina platform. These sequences were deposited in GenBank and compared with reference genomes. Prior to the execution of genomic and transcriptomic analyzes, composition of the essential oil extracted from BB.. ppssiiaaddiiooiiddeess used in the experiments was determined by gas chromatography with mass spectrometer (GC-MS), which demonstrated a higher amount of β-pinene in the fraction composed mainly by monoterpenes. This compound is often found in aromatic medicinal plants and also pointed as one of those responsible for their antimicrobial potential. The other results obtained in the present study indicate that the essential oil tested has a potential bacteriostatic activity at the concentration studied, and genes related to the virulence of the microorganism were less transcribed in its presence, contrary to what was observed for stress response genes, which presented higher transcription levels on that condition. Comparative genomics between the bacterial genomes sequenced in this work and the reference strains suggests a higher number of proteins expressed in LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotype 4b related to the defense and metabolism of the microorganism, indicating mechanisms that may be involved with the greater ability of this serotype to cause human listeriosis.