Le système immunitaire comporte différents mécanismes de tolérance périphérique permettant de contrôler la réponse des cellules T CD8+. Dans certaines conditions encore peu connues, des cellules T potentiellement auto-réactives peuvent contourner les mécanismes de tolérance et se différencier en cellules effectrices, capables d’attaquer différentes organes de l’organisme, dans un processus d’auto-réactivité. En utilisant une souris transgénique exprimant un antigène modèle dans les cellules bêta du pancréas, j’ai étudié deux processus fondamentaux impliqués dans la différenciation des cellules T CD8+ en réponse aux antigènes du soi.1) Rôle de la translocation des lipopolysaccharides (LPS) dans la rupture de la tolérance. Nous avons préalablement démontré dans le laboratoire que des protocoles de lympho-déplétions, tels l’irradiation, étaient capables d’induire une rupture de la tolérance périphérique dans les cellules T CD8+. L’irradiation provoque la translocation des LPS des bactéries commensales vers la circulation sanguine, ce qui induit une activation du système immunitaire inné. Mes données ont montré que la translocation des LPS était corrélée avec l’activation systémique des cellules dendritiques (DC) CD11c+, en particulier les DC CD8+, responsables de la cross-présentation des auto-antigènes pancréatiques dans les tissus lymphoïdes. Alors que le traitement par des antibiotiques avant l’irradiation permet de prévenir la translocation des LPS, l’activation des DC n’est que partiellement affectée, et le développement de l’auto-immunité résultant d’une rupture de la tolérance périphérique des cellules T CD8+ ne peut pas être empêchée par le traitement.2) Visualisation de la coopération entre cellules T CD4+ et CD8+ effectrices dans la destruction des cellules bêta pancréatiques in vivo. En utilisant la microscopie intra-vitale à 2-photons, j’ai pu analyser, pour la première fois, la dynamiques des cellules T CD4+ et CD8+ auto-réactives exprimant un marqueur fluorescent, lors de l’infiltration du pancréas et du développement du diabète auto-immun. J’ai mis en évidence que l’infiltration des cellules T était accompagnée d’un remodelage de la matrice extracellulaire du pancréas, permettant la migration dirigée des lymphocytes. De plus, j’ai montré que l’arrêt MHC classe II-dépendant des cellules T CD4+, dû à des interactions avec des cellules présentatrices d’antigène recrutées au site d’inflammation et impliquant dans certains cas également les cellules T CD8+, contribuait au maintien des fonctions effectrices des cellules T CD8+. / The immune system has evolved multiple mechanisms of peripheral tolerance to control CD8+ T cell responses. Under particular conditions that are not yet well understood, potentially autoreactive T cells may override tolerance and differentiate into effector cells capable of targeting the own components of the organism resulting in self-reactivity. Utilizing transgenic mice expressing a model antigen in the beta cells of the pancreas, I have studied two important processes involved in CD8+ T cells differentiation in response to self-antigens. 1) Role of lipopolysaccharides (LPS) translocation in the breakdown of CD8+ T cell tolerance. It has been previously shown in our laboratory that lymphodepleting protocols, such as total body irradiation, promote breakdown of peripheral CD8+ T cell tolerance. Irradiation induces translocation of commensal bacteria LPS, a potent innate immune system activator, into the bloodstream. My data demonstrated that LPS translocation correlated with systemic activation of CD11c+ dendritic cells (DC), in particular CD8+ DC, responsible for pancreatic self-antigen cross-presentation, in lymphoid tissue. While antibiotic treatment of mice before irradiation prevented LPS translocation, DC activation was only partially affected, and onset of autoimmunity and breakdown of CD8+ T cell tolerance could not be prevented.2) Intra-vital visualization of effector CD8+ and CD4+ T cell cooperation in beta cell destruction in the pancreas. Using two-photon microscopy, I have been able, for the first time, to simultaneously analyze dynamics of fluorescently tagged autoreactive CD8+ and CD4+ T cells as they infiltrated the pancreas and induced autoimmune diabetes. I found that T cell infiltration promoted extracellular matrix remodeling in the pancreas, which in turn served as a scaffold for T cell migration. In addition, I showed that MHC class II dependent arrest of effector CD4+ T cells, due to interactions with antigen presenting cells, occasionally also implicating CD8+ T cells, provided help to effector CD8+ T cells in maintaining their effector functions.

L’autophagie est un mécanisme de dégradation lysosomale ubiquitaire impliqué dans la lutte contre les infections. Les agents infectieux ont développé des stratégies pour éviter ou utiliser l’autophagie à leur profit. Cette dégradation peut être hautement sélective grâce à l’intervention de « récepteurs autophagiques », comme p62/SQSTM1, chargés de l’adressage de substrats à la machinerie autophagique grâce à leur interaction avec les protéines de la famille ATG8. Notre équipe a montré que les protéines d’enveloppe du VIH‐1 (Env) déclenchent l’autophagie dans les lymphocytes T CD4. Lorsque ces cellules sont infectées de façon productive, le processus autophagique est bloqué par le virus. Au cours de ma thèse nous avons montré que l’autophagie exerce une fonction anti‐VIH en dégradant sélectivement son transactivateur Tat, via son interaction avec p62. Au contraire, lorsque les cellules cibles ne sont pas productivement infectées, car le cycle viral est interrompu après l’étape d’entrée, l’autophagie n’est pas contrôlée et conduit à la mort par apoptose, suggérant que l’autophagie dégrade sélectivement un facteur de survie cellulaire. Mes travaux de thèse montrent qu’Env induit un stress oxydatif impliqué dans la mort par apoptose des cellules cibles non infectées. Nos résultats préliminaires suggèrent que les peroxysomes seraient des cibles de l’autophagiedans ces conditions. Ces organelles étant chargées de détoxifier la cellule, nous avons donc formulé l’hypothèse que l’autophagie, induite par Env, conduit à la dégradation sélective des peroxysomes, entraînant l’accumulation espèces oxydées dans les cellules cibles et ainsi, leur mort par apoptose. / Autophagy is an ubiquitous degradation pathway involved in innate immunity. Numerouspathogens have therefore developed strategies to block or use the autophagy machinery to their own benefit. This degradation can be highly selective, thanks to the intervention of autophagy receptors, like p62/SQSTM1, involved in the specific targeting of substrates to autophagosomes after their interaction with the ATG8 family of autophagic proteins. Our team has demonstrated that the HIV‐1 envelope proteins (Env) are responsible for autophagy triggering in CD4 T lymphocytes. If the target cells become productively infected, the autophagy process is blocked by the virus. During my thesis, we report that autophagy exerts an anti‐HIV effect by selectively degrading the HIV‐1 transactivator Tat, via its interaction withp62. On the contrary, if the target cells are not productively infected because the viral cycle is interrupted after the entry step, autophagy is not controlled and leads to apoptosis. These results suggest that the degradation of cellular components could be responsible for the induction of apoptosis. My thesis work indicates that Env induces an oxidative stress in the uninfected target cells and that this stress is involved in their death. Our preliminary results suggest that the peroxisomes would be targeted to autophagic degradation in these conditions. As these organelles are involved in the detoxification of the cells, we have made the assumption that Env‐induced autophagy triggers the selective degradation of these peroxisomes that leads to the accumulation of reactive oxygen species, and ultimately to apoptotic cell death.

L'objectif de cette thèse a été d'étudier le mécanisme de la coopération entre les voies de signalisation du TCR et de l'interféron de type I qui est responsable de l'augmentation d'expression de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 dans les lymphocytes T CD45RA+CD4+ humains. En utilisant une approche transcriptomique et d'interférence d'ARNm, j'ai observé que les voies IFN et TCR contrôlent différemment l'expression des STATs et que les BATFs sont induits par l'IFN et augmentés par la costimulation TCR/IFN. STAT3 a été identifié comme régulateur majeur de l'IL-10 et il est recruté à proximité d'un site de liaison pour BATF au locus IL-10. Sur la base d'essais de co-silencing des trois BATFs, nous avons proposé que les BATFs contrôlent l'amplitude de la réponse IFN en agissant comme facteurs de transcription " pionniers ". D'autres résultats obtenus par une étude transcriptomique d'environ 200 gènes, montrent des contributions uniques et combinées des voies TCR et de l'IFN dans le programme d'expression de gènes des lymphocytes CD45RA+CD4+ activés et indiquent que d'autres facteurs de transcription pourraient réguler l'IL-10. Cette étude est susceptible d'apporter une connaissance plus large de mécanismes impliqués dans la régulation croisée entre les voies TCR et IFN. / In CD4 T cells several transcription factors (TFs) regulate expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10. I investigated how type I interferon (IFN) cytokines and T cell receptor (TCR) pathways cooperate toward early upregulation of IL-10 in human CD45RA+ CD4+ T cells. I interrogated the role of the STAT and BATF family by transciptomics and RNAi-mediated gene-silencing. IFN and TCR induced STAT2 and STAT3 expression, respectively, while the BATFs were induced early by IFN and further enhanced by TCR/IFN together. STAT3 was the major regulator of TCR- and TCR/IFN-mediated IL-10 while STAT2 contributed to the latter. STAT3 was recruited adjacent to a BATF-binding site at the IL-10 locus early in response to TCR/IFN. Co-silencing of the three BATFs led to a marked decrease in TCR- and TCR/IFN-mediated IL-10. We propose that the BATFs control the magnitude of the IFN response as pioneer factors. Additional results of transcriptional profiling of ± 200 genes, including TFs downstream of TCR and IFN and TFs involved in IL-10 regulation, revealed that TCR and IFN provide unique and combined contributions to the early CD45RA+CD4+ T cell gene activation program and identified other potential TFs involved in TCR/IFN-mediated IL-10 transcription. This study may provide broad mechanistic bases for crosstalk between the TCR- and IFN-pathways.

La mémoire immunologique est le mécanisme biologique fondamental à la base du développement de la vaccination. La compréhension de ce mécanisme ainsi que de ses interactions avec les différents acteurs du système immunitaire a permis l’élaboration de vaccins qui sont aujourd’hui les garants d’une protection accrue face à l’émergence de maladies infectieuses potentiellement mortelles. La voie d’injection et le mode de transfert de ces vaccins sont des paramètres majeurs à prendre en considération car ils définissent une modulation des réponses immunitaires et de leurs spécificités d’action. De nos jours, seule la voie intramusculaire demeure la voie majoritaire d’administration de vaccins lors de la prophylaxie primaire en santé humaine. Au cours de notre étude, nous nous sommes intéressés à comparer l’injection d’un antigène (l’ovalbumine) selon deux voies d’administration : la voie intramusculaire et la voie intradermique. Nous nous sommes également appuyés sur une technologie du laboratoire qui consiste à transférer des gènes par des vecteurs AAV2/1 recombinants. Nous disposions de deux constructions de ces vecteurs ayant une spécificité pour cibler les cellules musculaires et permettant l’apport d’un effet auxiliaire par les lymphocytes T CD4+ lors d’injections dans des souris femelles. De plus, une de ces constructions nous permettait d’éviter la voie de présentation directe de l’antigène par les cellules dendritiques (DCs) aux lymphocytes T CD8+. Les capacités modulatrices de ces vecteurs nous permirent de montrer pour la première fois que le vecteur AAV2/1 recombinant était capable de faire exprimer un transgène au sein de la peau et d’y générer une réponse cellulaire forte. Nous avons également montré qu’il existait une synergie d’action entre l’effet auxiliaire et la voie intradermique qui améliorait considérablement les réponses cellulaires issues de la présentation croisée d’antigène. Enfin, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD8+ générés suite à cette synergie d’action présentaient un profil phénotypique de cellules mémoires polyfonctionnelles et capables de protéger l’hôte face à un challenge pathogénique. / Immunological memory is the fundamental biological mechanism at the beginning of the development of vaccination. Understanding this mechanism and its interactions with the various players of the immune system has allowed the development of vaccines that are today the most effective barrier against the emergence of life-threatening infectious diseases. Route of injection and the nature of carriers of these vaccines are key parameters to be taken into consideration because they define a modulation of immune responses and their specific features. Nowadays, only the intramuscular injection route remains the major route of vaccines injection in the context of primary prophylaxis in human health. During our study, we were interested in comparing the injection of antigen (ovalbumin) following two routes of administration: intramuscular and intradermal routes. We also relied on a technology in the laboratory that involves the transfer of genes by rAAV2/1 vectors. We had two constructs of these vectors having specificity to target skeletal muscle cells and allowing us to provide a helper effect from CD4+ T cells during injections into female mice recipients. Moreover, one of these constructs enabled us to avoid the direct presentation of antigens by dendritic cells (DCs) to CD8+ T cells. The capacity of modulation of these vectors allowed us to show for the first time that the rAAV2/1 vector was able to trigger the expression of a transgene in the skin, and there to generate a strong cellular response. We have also shown that CD4+ T cell help and the intradermal route of immunization synergize to improve greatly cellular responses from the cross-presentation of antigens. Finally, we have demonstrated that CD8+ T cells generated following this synergism exhibited a phenotypic profile of polyfunctional memory cells and able to protect the host against a pathogenic challenge.

La mémoire immunologique est le mécanisme biologique fondamental à la base du développement de la vaccination. La compréhension de ce mécanisme ainsi que de ses interactions avec les différents acteurs du système immunitaire a permis l’élaboration de vaccins qui sont aujourd’hui les garants d’une protection accrue face à l’émergence de maladies infectieuses potentiellement mortelles. La voie d’injection et le mode de transfert de ces vaccins sont des paramètres majeurs à prendre en considération car ils définissent une modulation des réponses immunitaires et de leurs spécificités d’action. De nos jours, seule la voie intramusculaire demeure la voie majoritaire d’administration de vaccins lors de la prophylaxie primaire en santé humaine. Au cours de notre étude, nous nous sommes intéressés à comparer l’injection d’un antigène (l’ovalbumine) selon deux voies d’administration : la voie intramusculaire et la voie intradermique. Nous nous sommes également appuyés sur une technologie du laboratoire qui consiste à transférer des gènes par des vecteurs AAV2/1 recombinants. Nous disposions de deux constructions de ces vecteurs ayant une spécificité pour cibler les cellules musculaires et permettant l’apport d’un effet auxiliaire par les lymphocytes T CD4+ lors d’injections dans des souris femelles. De plus, une de ces constructions nous permettait d’éviter la voie de présentation directe de l’antigène par les cellules dendritiques (DCs) aux lymphocytes T CD8+. Les capacités modulatrices de ces vecteurs nous permirent de montrer pour la première fois que le vecteur AAV2/1 recombinant était capable de faire exprimer un transgène au sein de la peau et d’y générer une réponse cellulaire forte. Nous avons également montré qu’il existait une synergie d’action entre l’effet auxiliaire et la voie intradermique qui améliorait considérablement les réponses cellulaires issues de la présentation croisée d’antigène. Enfin, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD8+ générés suite à cette synergie d’action présentaient un profil phénotypique de cellules mémoires polyfonctionnelles et capables de protéger l’hôte face à un challenge pathogénique. / Immunological memory is the fundamental biological mechanism at the beginning of the development of vaccination. Understanding this mechanism and its interactions with the various players of the immune system has allowed the development of vaccines that are today the most effective barrier against the emergence of life-threatening infectious diseases. Route of injection and the nature of carriers of these vaccines are key parameters to be taken into consideration because they define a modulation of immune responses and their specific features. Nowadays, only the intramuscular injection route remains the major route of vaccines injection in the context of primary prophylaxis in human health. During our study, we were interested in comparing the injection of antigen (ovalbumin) following two routes of administration: intramuscular and intradermal routes. We also relied on a technology in the laboratory that involves the transfer of genes by rAAV2/1 vectors. We had two constructs of these vectors having specificity to target skeletal muscle cells and allowing us to provide a helper effect from CD4+ T cells during injections into female mice recipients. Moreover, one of these constructs enabled us to avoid the direct presentation of antigens by dendritic cells (DCs) to CD8+ T cells. The capacity of modulation of these vectors allowed us to show for the first time that the rAAV2/1 vector was able to trigger the expression of a transgene in the skin, and there to generate a strong cellular response. We have also shown that CD4+ T cell help and the intradermal route of immunization synergize to improve greatly cellular responses from the cross-presentation of antigens. Finally, we have demonstrated that CD8+ T cells generated following this synergism exhibited a phenotypic profile of polyfunctional memory cells and able to protect the host against a pathogenic challenge.

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est couramment utilisée pour traiter différents cancers hématologiques. Malheureusement, l’effet bénéfique de cette technique est limité par la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) qui demeure la cause principale de mortalité post-greffe. La GVHD endommage différents organes et retarde la reconstitution immunitaire des lymphocytes T (LT) ce qui augmente les risques d’infection et de rechute. Le développement de nouveaux traitements permettant d’accélérer la reconstitution immunitaire augmenterait donc les chances de survie des patients greffés. Il existe deux façons de régénérer des LT: via la thymopoïèse qui consiste à produire de nouveaux LT, ou par la prolifération homéostatique (PH) qui implique l’expansion rapide des LT matures retrouvés dans le greffon. La PH requiert deux signaux essentiels: l’interleukine-7 (IL-7) et la présentation d’antigènes du soi par les cellules dendritiques (DC) via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) I pour les LT CD8+ et le CMH II pour les LT CD4+. Dans un contexte d’ASCT, la chimiothérapie et la GVHD endommagent le thymus rendant la thymopoïèse inefficace. Par conséquent, la reconstitution immunitaire repose presque entièrement sur la PH des LT. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment la GVHD affecte la reconstitution des LT. Grâce à un modèle murin, nous avons démontré que la PH des LT CD4+ est absente durant la GVHD et ce, dû à de faibles niveaux d’IL-7 et une diminution du nombre de DC. La perte des DC est en grande partie causée par des niveaux réduits de stromal derived factor-1α (SDF-1α) et par l’absence de progéniteurs de DC dans la moelle osseuse des souris en GVHD. Le traitement des souris en GVHD avec du SDF-1α permet d’augmenter le nombre de DC, et lorsqu’administré avec l’IL-7, améliore significativement la PH des LT CD4+. Contrairement aux LT CD4+, l’administration d’IL-7 seule est suffisante pour restaurer la PH des LT CD8+ durant la GVHD et ce, même en absence des DC. Ces différences s’expliquent pour deux raisons : 1) l’expression du CMH I, contrairement au CMH II, n’est pas limitée aux DC mais est également exprimée par les cellules stromales du receveur ce qui est suffisant pour induire la PH des LT CD8+ et 2) les LT CD8+ répondent à des concentrations plus faibles d’IL-7 systémique comparativement aux LT CD4+. En conclusion, l’ensemble de ces résultats permettra de mettre en place des études translationnelles sur le potentiel thérapeutique du SDF-1α et de l’IL-7 dans la reconstitution immunitaire des patients greffés. / Hematological cancers are currently treated with allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (ASCT). Unfortunately, graft-versus-host disease (GVHD) greatly limits the health benefits of this procedure, as it is the main cause of mortality post-ASCT. GVHD damages various organs and delays the immune reconstitution of T lymphocytes (TL), which increases the risk of infections and relapse. Thus, developing new treatments modulating the immune reconstitution following ASCT would greatly enhance survival of the transplanted patients. TL can be regenerated by two ways: de novo production of TL by thymopoiesis; or homeostatic proliferation (HP), which consists of rapidly expanding mature TL already present in the graft. HP requires two crucial signals: interleukin-7 (IL-7) and self-antigen presentation by dendritic cells (DC) via the major histocompatibility complex (MHC) I for CD8+ TL and MHC II for CD4+ TL. During ASCT however, chemotherapy and GVHD induce damage to the thymus making thymopoiesis inefficient, and thus immune reconstitution relies almost entirely on HP of TL. The objective of this thesis was to understand how GVHD affects TL reconstitution. Using a mouse model, we demonstrate that CD4+ TL fail to undergo HP when transferred in GVHD hosts due to low levels of IL-7 and reduced numbers of DCs. Moreover, the loss of DCs is mostly caused by reduced levels of Stromal Derived Factor-1 alpha (SDF-1α) and the absence of DC progenitors in the bone marrow of mice suffering from GVHD. Treating GVHD hosts with SDF-1α resulted in increased DC counts and, when administered in combination with IL-7, significantly improved HP of CD4+ TL. Unlike CD4+ TL, administration of IL-7 alone was sufficient to restore HP of CD8+ TL in GVHD mice and this, regardless of the presence of DCs. These differences could be explained by two reasons: 1) MHC I expression is not limited to DCs but is expressed by stromal cells from the recipient, which is sufficient to promote HP in CD8+ TL and 2) CD8+ TL respond to lower doses of systemic IL-7 in comparison to CD4+ TL. In conclusion, these results can lead to future translational studies on the therapeutic potential of SDF-1α and IL-7 in the immune reconstitution of grafted patients.

La mémoire immunologique est le mécanisme biologique fondamental à la base du développement de la vaccination. La compréhension de ce mécanisme ainsi que de ses interactions avec les différents acteurs du système immunitaire a permis l’élaboration de vaccins qui sont aujourd’hui les garants d’une protection accrue face à l’émergence de maladies infectieuses potentiellement mortelles. La voie d’injection et le mode de transfert de ces vaccins sont des paramètres majeurs à prendre en considération car ils définissent une modulation des réponses immunitaires et de leurs spécificités d’action. De nos jours, seule la voie intramusculaire demeure la voie majoritaire d’administration de vaccins lors de la prophylaxie primaire en santé humaine. Au cours de notre étude, nous nous sommes intéressés à comparer l’injection d’un antigène (l’ovalbumine) selon deux voies d’administration : la voie intramusculaire et la voie intradermique. Nous nous sommes également appuyés sur une technologie du laboratoire qui consiste à transférer des gènes par des vecteurs AAV2/1 recombinants. Nous disposions de deux constructions de ces vecteurs ayant une spécificité pour cibler les cellules musculaires et permettant l’apport d’un effet auxiliaire par les lymphocytes T CD4+ lors d’injections dans des souris femelles. De plus, une de ces constructions nous permettait d’éviter la voie de présentation directe de l’antigène par les cellules dendritiques (DCs) aux lymphocytes T CD8+. Les capacités modulatrices de ces vecteurs nous permirent de montrer pour la première fois que le vecteur AAV2/1 recombinant était capable de faire exprimer un transgène au sein de la peau et d’y générer une réponse cellulaire forte. Nous avons également montré qu’il existait une synergie d’action entre l’effet auxiliaire et la voie intradermique qui améliorait considérablement les réponses cellulaires issues de la présentation croisée d’antigène. Enfin, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD8+ générés suite à cette synergie d’action présentaient un profil phénotypique de cellules mémoires polyfonctionnelles et capables de protéger l’hôte face à un challenge pathogénique. / Immunological memory is the fundamental biological mechanism at the beginning of the development of vaccination. Understanding this mechanism and its interactions with the various players of the immune system has allowed the development of vaccines that are today the most effective barrier against the emergence of life-threatening infectious diseases. Route of injection and the nature of carriers of these vaccines are key parameters to be taken into consideration because they define a modulation of immune responses and their specific features. Nowadays, only the intramuscular injection route remains the major route of vaccines injection in the context of primary prophylaxis in human health. During our study, we were interested in comparing the injection of antigen (ovalbumin) following two routes of administration: intramuscular and intradermal routes. We also relied on a technology in the laboratory that involves the transfer of genes by rAAV2/1 vectors. We had two constructs of these vectors having specificity to target skeletal muscle cells and allowing us to provide a helper effect from CD4+ T cells during injections into female mice recipients. Moreover, one of these constructs enabled us to avoid the direct presentation of antigens by dendritic cells (DCs) to CD8+ T cells. The capacity of modulation of these vectors allowed us to show for the first time that the rAAV2/1 vector was able to trigger the expression of a transgene in the skin, and there to generate a strong cellular response. We have also shown that CD4+ T cell help and the intradermal route of immunization synergize to improve greatly cellular responses from the cross-presentation of antigens. Finally, we have demonstrated that CD8+ T cells generated following this synergism exhibited a phenotypic profile of polyfunctional memory cells and able to protect the host against a pathogenic challenge.

Au cours d’une réponse immunitaire primaire, les lymphocytes T CD8 mémoires émergent à partir d'un environnement de forte activation immunitaire. Les cellules régulatrices T CD4 FoxP3+ (LTregs) jouent un rôle clé de suppression de la réponse immunitaire. Nous montrons que les LTregs sont nécessaires pour la génération d’une réponse mémoire T CD8 fonctionnelle. En absence de LTregs lors du priming, les LT CD8 mémoires générées prolifèrent faiblement et ne parviennent pas à se différencier après une réactivation antigénique en effecteurs cytotoxiques secondaires fonctionnelles. Nous suggérons que les LTregs agissent tôt, lors de la phase d'expansion des LT CD8, en réduisant l’exposition des précurseurs mémoires T CD8 à l'interleukine-2. Ce nouveau rôle crucial des LTregs a des implications pour le développement optimal de vaccin.Chez les patients sous traitement antirétroviral efficace et prolongée (ART), le VIH peut persister dans un petit pool de cellules T CD4 mémoires quiescentes de longue durée de vie infectées par du virus latent intégré. Ce réservoir latent comprend différentes sous-populations mémoires. Nos résultats suggèrent une contraction progressive de la taille du réservoir latent autour d'un noyau formé de sous-populations T CD4 mémoires moins différenciées (centrales mémoires TCM et souches mémoires TSCM). Ce processus très lent semble dépendre de la taille initiale et du taux de décroissance qui diffère entre les sous-populations mémoires infectées de manière latente. Nos résultats suggèrent également une extrême stabilité du sous-réservoir TSCM, dont la taille est directement liée à l'exposition cumulée au virus plasmatique avant le début du traitement ART, soulignant l'importance d'une initiation précoce du traitement antirétroviral efficace. La présence de cette dynamique intrinsèque dans le réservoir latent peut avoir des implications pour la conception de stratégies optimales de purge thérapeutique contre le VIH. / During the primary immune response, CD8 memory emerges from an environment of strong immune activation. The FoxP3 regulatory CD4 T-cell subset (Treg) is known as a key suppressive component of the immune system. We report that Tregs are required for the generation of functional CD8 memory. In the absence of Tregs during priming, the resulting memory cells proliferate poorly and fail to differentiate into functional cytotoxic secondary effectors following antigen reactivation. We find that the Tregs act early, during the expansion phase of primary CD8 effectors, by fine tuning interleukin-2 exposure of CD8 memory precursors. This crucial new role of Tregs has implications for optimal vaccine development. In patients who are receiving prolonged antiretroviral treatment (ART), HIV can persist within a small pool of long-lived resting memory CD4 T cells infected with integrated latent virus. This latent reservoir involves distinct memory subsets. We provide results that suggest a progressive reduction of the size of the blood latent reservoir around a core of less-differentiated memory subsets (central memory and stem cell-like memory).This process appears to be driven by the differences in initial sizes and decay rates between latently infected memory subsets. Our results also suggest an extreme stability of the TSCM sub-reservoir, the size of which is directly related to cumulative plasma virus exposure before the onset of ART, stressing the importance of early initiation of effective ART. The presence of these intrinsic dynamics within the latent reservoir may have implications for the design of optimal HIV therapeutic purging strategies.

L’infection par le cytomégalovirus est le plus souvent asymptomatique chez les sujets immunocompétents mais entraine une morbidité et une mortalité importantes chez les patients immunocompromis et en cas d’infection congénitale.<p>Après l’infection primaire, le virus persiste tout au long de la vie à l’état latent mais peut se réactiver de manière intermittente. Ceci est associé à l’expansion de lymphocytes T CD4+ fortement différenciés ayant des fonctions auxiliaires et cytolytiques. L’infection primaire est, par contre, caractérisée par une réplication virale intense qui dure plusieurs mois. Il a été montré que l’exposition prolongée à des concentrations élevées d’antigènes entraine une perte progressive de fonction par les lymphocytes T appelée épuisement et caractérisée par l’expression de récepteurs inhibiteurs. L’impact de la réplication virale intense observée au cours de l’infection primaire par le CMV sur la fonction des lymphocytes T CD4+ n’est pas bien connu.<p>La fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ a été explorée chez l’humain et le singe rhésus au cours de l’infection primaire et comparée à celle de sujets porteurs chroniques du virus.<p>Les résultats montrent que l’infection primaire par le CMV est associée à la détection de lymphocytes T CD4+ circulants ayant une faible capacité de prolifération et de production de cytokines et d’IL-2 en particulier.<p>L’impact de la différenciation sur la fonction des lymphocytes a été exploré en détail chez l’humain. Il a été observé qu’un degré de différenciation plus élevé des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV joue un rôle dans la production réduite d’IL-2. Toutefois, la fraction moins différenciée (exprimant la molécule CD28) présente également une sécrétion d’IL-2 moindre au cours de l’infection primaire. Ceci fait partie d’une diminution globale de la production de cytokines au cours de l’infection primaire qui affecte également la sécrétion d’IFNγ et TNFα, entraine une polyfonctionnalité réduite et est indépendante de la différenciation. L’épuisement des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV contribue à leur fonctionnalité moindre comme l’indique l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 et l’augmentation des réponses prolifératives en présence d’anticorps bloquant PD-1.<p>Le lien entre excrétion virale et fonction lymphocytaire a été étudié chez le macaque rhésus. L’infection par le CMV est observée chez les singes juvéniles et adultes mais pas chez les nourrissons. L’excrétion urinaire et salivaire est significativement plus fréquente et intense chez les singes juvéniles par rapport aux adultes. Comme chez l’humain au cours de l’infection primaire, les lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus sont moins<p>polyfonctionnels et prolifèrent moins efficacement chez les singes juvéniles par rapport aux singes adultes. Ceci est associé à l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 chez les singes juvéniles. La réponse proliférative des lymphocytes T CD4+ est accrue en présence d’anticorps bloquant PD-1 ou d’IL-2 exogène. Enfin, une association inverse entre fonction lymphocytaire et excrétion urinaire a été mise en évidence chez les macaques adultes.<p>Ces résultats indiquent que l’infection par le CMV présente des caractéristiques semblables chez l’humain et le singe rhésus. L’infection primaire est associée à la détection de lymphocytes T CD4+ ayant une fonctionnalité moindre qu’au cours de l’infection chronique. L’expression du récepteur inhibiteur PD-1 typique des cellules épuisées est l’un des mécanismes impliqués et pourrait être la cible de stratégies immunomodulatrices visant à améliorer les fonctions lymphocytaires et le contrôle de la réplication virale. Les résultats présentés indiquent que l’infection naturelle chez le singe rhésus constitue un modèle potentiellement utile à l’étude de la réponse immune au CMV humain et à l’évaluation de stratégies immunomodulatrices.<p>/<p>Cytomegalovirus infection is mostly asymptomatic in immunocompetent hosts but leads to severe morbidity and mortality in immunocompromised subjects and foetuses.<p>After primary infection, CMV establishes lifelong persistence but can reactivate intermittently. This is associated with the expansion of highly differentiated CD4+ T lymphocytes exhibiting helper functions and cytolytic activity.<p>Primary infection is characterised by an intense viral replication lasting several months. It has been shown that prolonged exposure to elevated antigen concentrations induces a progressive loss of function by T lymphocytes called exhaustion. This state of functional impairment is associated to the expression of inhibitory receptors. The consequence of the intense viral replication seen in primary CMV infection on CD4+ T cell function is unknown.<p>CD4+ T cell function has been studied in human and rhesus macaque during primary CMV infection. Chronic CMV carriers have been used as controls.<p>The results show that primary CMV infection is associated to the detection of circulating CD4+ T lymphocytes exhibiting weak proliferative capacities and reduced cytokine production affecting IL-2 in particular.<p>The impact of differentiation on lymphocyte function has been explored in detail in human. An increased proportion of terminally differentiated CD4+ T cells (CD28-) is observed during primary infection. These lymphocytes are unable to secrete IL-2 in response to CMV antigens. Interestingly, CD28+ CMV-specific CD4+ T cells also exhibit reduced IL-2 production during primary infection. This is part of a global reduction of cytokine production affecting IFNγ and TNFα as well. The impaired cytokine production is associated to reduced polyfunctionality and is independent of differentiation. Exhaustion of CMV-specific CD4+ T lymphocytes contributes to the reduced functionality as shown by an increased expression of the inhibitory receptor PD-1 and improved proliferative responses in the presence of PD-1 blocking antibodies.<p>The relationship between viral replication and lymphocyte function has been explored in rhesus macaques. CMV infection is observed in juvenile and adult monkeys but not in newborns. Excretion in urine and saliva is significantly more frequent and intense in juvenile monkeys than adults. As in primary infection in human, CMV-specific CD4+ T lymphocytes are less polyfunctional and have lower proliferative capacities in juveniles as compared to adults. This is associated with an increased expression of PD-1 in juvenile monkeys. CD4+ T cell proliferative responses are increased when PD-1 blocking antibodies or exogenous IL-2 are added to the culture medium. Finally, an inverse association between lymphocyte function and urinary excretion has been observed in adult macaques.<p>These results indicate that CMV infection shares common features in human and rhesus macaque. Primary infection is associated to the detection of CD4+ T lymphocyte displaying lower functional capacities as compared to chronic infection. Exhaustion contributes to the functional impairment and the inhibitory receptor PD-1 could be targeted by immunomodulatory strategies aiming at improving lymphocyte functions and controlling viral replication. Natural CMV infection in rhesus macaque might be useful as a model to evaluate the efficacy and safety of immunomodulatory approaches. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La vaccination muqueuse est un moyen efficace de lutter contre les pathogènes qui utilisent les muqueuses comme porte d’entrée. Cependant, la vaccination muqueuse avec des antigènes non réplicatifs nécessite l’utilisation d’adjuvants. Les molécules de la famille de la toxine du choléra, l’entérotoxine thermolabile d’E.coli (LT), la toxine du choléra (CT) ainsi que le mutant LT-R192G et les sous-unités B non toxiques de ces toxines (LTB et CTB) ont été montrées augmenter les réponses immunitaires contre des antigènes coadministrés par voie muqueuse. Cependant leur mécanisme d’action est complexe et reste encore mal connu et des différences entre molécules entières et sous-unités B ont été rapportées ainsi que, pour une même molécule, des différences selon le modèle utilisé. Dans ce travail, nous avons étudié les effets de ces cinq molécules sur les réponses anticorps ainsi que sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d’immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirus (VLP-2/6). Chez les souris non immunisées, nous avons montré que ces molécules, à l’exception de la CTB, diminuent in vitro les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+Foxp3+, probablement par un mécanisme d’apoptose. Chez les souris immunisées, toutes les molécules étudiées induisent une même réponse anticorps sérique et fécale spécifique des VLP-2/6, qu’il s’agisse des molécules entières connues pour leur fort pouvoir adjuvant ou des sous-unités B qui, elles, ont été rapportées avoir un plus faible effet adjuvant voire un effet tolérogène dans certaines études. Concernant la réponse T CD4, les réponses spécifiques de l’antigène et de l’adjuvant ont été analysées. Des différences importantes ont été mises en évidence entre ces molécules. Notamment, seules les molécules entières (LT, LT-R192G et CT) induisent la production d’IL-2 et l’activation de lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3- mémoires spécifiques de l’antigène tout en permettant la mise en place d’une régulation médiée par des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (boucle d’autorégulation), qui pourraient jouer un rôle majeur lors d’une réponse secondaire, afin d’éviter les réactions inflammatoires délétères. Malgré ces différences, toutes les molécules étudiées induisent la production d’IL-17, suggérant le rôle majeur de cette cytokine dans l’effet adjuvant.L’influence de la voie d’administration sur ces effets est en cours d’étude grâce à la comparaison avec la voie intranasale / Mucosal immunization is an important goal of vaccine development to protect against pathogens that use mucosa as portals of entry. However, the use of non-replicating antigens requires the addition of adjuvants.Cholera-like enterotoxins, cholera toxin (CT) from Vibrio cholerae and the heat-labile enterotoxin (LT) from toxinogenic strains of E. coli, as well as the mutant LR-192G and their B subunits (CTB and LTB) have been shown to increase immune responses against unrelated co-administered antigens by mucosal routes. However, their mechanism of action is very complex and not completely understood and differences exist between holotoxins and B subunits and within molecules, differences exist between the models used.In this work, we have studied the effects of these five molecules on antibody responses and on CD4+ T cell responses in a murine model of intrarectal immunization using rotavirus-like particles (2/6-VLP). In non-immunized mice, we have shown that all molecules, except CTB, decreased CD4+CD25+Foxp3+ natural regulatory T cells, probably by induction of apoptosis.In immunized mice, all molecules induced similar VLP-2/6 specific systemic and fecal antibody responses, teither he holotoxins, which are well known for their strong adjuvanticity or their B subunits with a less strong adjuvanticity but with also a tolerogenic effect in some studies.Regarding the CD4+ T cell response, antigen- and adjuvant- specific responses have been analysed. Important differences have been highlighted between the molecules. Among others things, only whole toxins (LT, LT-R192G and CT) trigger IL-2 production and activation of antigen specific memory CD4+CD25+Foxp3- T cells and at the same time antigen specific CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells are activated which may control the effector response (Feedback loop regulation) and avoid deleterious inflammation. In spite of these differences, all studied molecules triggered IL-17 production, suggesting the major role of this cytokine in adjuvanticity. We are currently comparing the intrarectal and intranasl routes in order to evaluate the role played by the route of immunisation in different effects of these molecules