Le glycolipide Gb3/CD77 qui est fortement exprimé en surface des cellules de lymphome de Burkitt (LB) est le récepteur d’une toxine bactérienne la Vérotoxine-1 (VT-1). Notre équipe a montré précédemment que, dans les cellules de LB, la VT-1 induit une cascade apoptotique mettant en jeu les caspases et la mitochondrie. Mon travail a consisté à poursuivre l’analyse des bases moléculaires de ce processus, notamment en m’intéressant au rôle de la protéine pro-apoptotique Bid. Bid est un membre de la famille Bcl-2 qui est clivé par la caspase-8 au cours de l’apoptose et dont la forme tronquée (t-Bid) se relocalise à la mitochondrie. Grâce à l’utilisation de clones cellulaires de LB où Bid a été inhibée puis réexprimée sous forme non clivable et d’un inhibiteur de la caspase-8, nous avons montré que lors de l’apoptose induite par la VT1 : 1) la protéine entière Bid (full-length Bid ou FL-Bid) contrôle l’activation de protéines pro-apoptotiques Bax et de Bak ; 2) t-Bid et FL-Bid sont, toutes les deux, impliquées dans la libération des protéines pro-apoptotiques (cytochrome c et Smac/DIABLO) de l’espace intermembranaire de la mitochondrie vers le cytosol ; 3) FL-Bid contrôle l’homodimérisation de Bax et de Bak qui contribuerait à la libération initiale du cytochrome c et de Smac/DIABLO alors que t-Bid est nécessaire à l’hétérodimérisation de Bax et Bak qui permettrait l’amplification de cette libération. L’ensemble de ces résultats montre donc une coopération fonctionnelle entre Bax et Bak au cours de l’apoptose induite par la VT-1 et surtout met en évidence que l’activation de la voie caspase-8/t-Bid n’est absolument pas requise pour initier la mort cellulaire.Gb3/CD77 est aussi exprimé à la surface de certains lymphocytes B normaux, où il constitue un marqueur de différenciation mais sa fonction endogène reste encore indéterminée. Une deuxième partie de mon travail a consisté à essayer d’identifier le ligand physiologique de Gb3/CD77 pour comprendre son rôle biologique. Grâce à une analyse en spectrométrie de masse, nous avons identifié deux protéines potentiellement partenaires de Gb3/CD77 : la galectine-7 et la protéine S100A11. / The Gb3/CD77 glycolipid, which is strongly expressed in Burkitt's lymphoma (BL) cells, is a receptor for the bacterial toxin Verotoxin-1 (VT-1). Previously, our group has shown that VT-1 induces an apoptotic pathway in BL cells which is dependent on caspases and mitochondria. Here, we provide new insights into this pathway. A pro-apoptotic member in the Bcl-2 family, Bid is cleaved by caspase-8 and its truncated form t-Bid is translocated to mitochondria. Using LB cell clones where Bid was inhibited prior to being reexpressed as a non-cleavable mutated form (BID D59A) and a caspase-8 inhibitor to explore VT-1-induced apoptosis, we showed that 1) the full length Bid (FL-Bid) controls the activation of pro-apoptotic proteins Bax and Bak; 2) Both t-Bid and FL-Bid are involved in the release of pro-apoptotic proteins (cytochrome c and Smac/DIABLO) from the mitochondrial intermembrane space to the cytosol; 3) FL-Bid controls the homo-oligomerization of both Bax and Bak, likely contributing to the initial release of cytochrome c and Smac/DIABLO while t-Bid is needed for their hetero-oligomerization followed by amplification of the release. Together, these results reveal a functional cooperation between Bax and Bak during VT-1-induced apoptosis and, most importantly, that activation of caspase-8 and t-Bid is not required to induce the onset of cell death. Gb3/CD77 is also expressed in a proportion of normal B-lymphocytes where it constitutes a differentiation marker but whose function remains uncharacterized. In an effort to look for physiological ligands, we have used a biochemical approach followed by mass spectrometry analysis. Two proteins have been identified as potentially Gb3/CD77 partners, namely galectin-7 and protein S100A11.

c-MYC est un proto-oncogène surexprimé dans les lymphomes de Burkitt et une cible importante pour le traitement de ces maladies. La protéine à domaine BTB/POZ MIZ-1 est un partenaire direct de la protéine c-MYC. En effet, c-MYC via son structure hélice-boucle-hélice se lie précisément à la séquence entre le 12e et 13e doigt de zinc de MIZ-1. Notre groupe a démontré que l’expression de la protéine MIZ-1 tronquée de son domaine POZ (MIZ-1ΔPOZ) peut ralentir la lymphomagenèse. Pourtant, l’interaction directe entre c-MYC et MIZ-1 n’est pas affectée par la délétion du domaine POZ de MIZ-1. Ceci suggère que MIZ-1 est important pour l’activité oncogénique de c-MYC. Il a été observé que l’expression de MIZ-1ΔPOZ diminue le nombre de cellules B pré-tumorales dans les modèles murins de lymphomes Eμ-Myc et Igλ-Myc. De plus, les niveaux protéiques très élevés de c-MYC dans les cellules B Eμ-Myc sont diminués lorsque MIZ-1ΔPOZ est exprimé. Toutefois, l’activité du protéasome ne semble pas être responsable de la diminution de c-MYC. Une analyse des interactions protéiques de MIZ-1 par BioID effectuée par notre groupe a montré que MIZ-1 et MIZ-1ΔPOZ interagissent avec PP1ɣ, TOX4 et PNUTS, trois protéines du complexe PTW/PP1 qui est un complexe transcriptionnel dont c-MYC fait partie. Des résultats de co-IP confirment cette interaction ce qui suggère que MIZ-1 pourrait influencer l’activité de ce complexe. De plus, une lignée cellulaire dans laquelle MIZ-1ΔPOZ est exprimé a été établie ce qui permettra d’approfondir l’étude des interactions protéiques de MIZ-1 avec le complexe PTW/PP1 et d’étudier l’effet de MIZ-1ΔPOZ sur l’activité transcriptionelle de ce complexe. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action de MIZ-1 sur c-MYC permettra de mieux comprendre son rôle dans un contexte pathologique, ce qui pourrait permettre le design de nouvelles approches thérapeutiques. / c-MYC is a proto-oncogene overexpressed in Burkitt's lymphoma and an important target for the treatment of these diseases. The BTB/POZ domain protein MIZ-1 is direct a partner of c- MYC. Indeed, c-MYC via its helix-loop-helix structure binds precisely to the sequence between the 12th and 13th zinc finger of MIZ-1. We demonstrated that expression of MIZ-1 that lacks its POZ domain (MIZ-1ΔPOZ) can impair lymphomagenesis. However, the direct interaction between c-MYC and MIZ-1 is not affected by the deletion of the MIZ-1 POZ domain. This suggests that MIZ-1 is important for the oncogenic activity of c-MYC. We observed that expression of MIZ-1ΔPOZ decreases the number of pre-tumor B cells in lymphomas mouse models such as Eμ-Myc and Igλ-Myc. The high c-MYC protein levels observed in Eμ-Myc B cells are decreased when MIZ-1ΔPOZ is expressed. However, proteasome activity does not seem to be responsible for the decrease of c-MYC. After the analysis of MIZ-1 protein interactions by BioID, our group found that MIZ-1 and MIZ-1ΔPOZ interact with PP1ɣ, TOX4 and PNUTS, three proteins of the PTW/PP1 complex which also interact with c-MYC. Co-IP results confirmed these interactions suggesting that MIZ-1 could influence the activity of this complex. In addition, a MIZ- 1ΔPOZ cell line was established which will allow further studies of MIZ-1ΔPOZ protein interactions with the PTW/PP1 complex as well as its effect on the transcriptional activity of this complex. A better characterization of the mechanism of action of MIZ-1 on c-MYC will lead to a better understanding of its role in a pathological context, which could be the basis of new therapeutic approaches.

En France, les hémopathies lymphoïdes, se situant au sixième rang des cancers les plus fréquents, sontun problème majeur de santé publique. Ce travail a pour objectif d’étudier l’impact de la prise en charge thérapeutiquesur la survie et sur la qualité de vie (QdV) des patients atteints de ce type d’hémopathies. Le premierobjectif de ce travail est un état des lieux de l’épidémiologie des hémopathies lymphoïdes avec l’étudede l’évolution de l’incidence et de la survie nette en Côte d’Or entre 1980 et 2009. L’incidence, en nette augmentationdepuis 1980, semble se stabiliser depuis les années 2000 pour certaines entités, notamment pourles lymphomes folliculaires (LF) et les lymphomes B diffus à grandes cellules (LBDGC). Nous observons globalementune amélioration de la survie nette avec, toutefois, un pronostic à court et à long terme qui restedéfavorable pour certaines entités. Les LF et les LBDGC sont les premiers lymphomes à bénéficier de l’introductiondes anticorps monoclonaux dans leur prise en charge thérapeutique. Notre deuxième étude a pourobjectif demesurer l’impact du rituximab sur la survie globale des patients atteints d’un LF ou d’un LBDGC enCôte d’Or en utilisant une méthodologie basée sur le score de propension. Nos résultats confirment le bénéficesignificatif du rituximab sur la survie globale en population générale, sans critère de sélection. En vue de cesrésultats, nous avons étudié la QdV de ces patients pendant et à la suite de la prise en charge thérapeutique. LaQdV évolue différemment au cours du suivi en fonction du type de lymphome. / In France, hematologic malignancies, which are the sixthmost common cancers, are amajor public healthproblem. This work aimed to study the impact of the therapeutic management on survival and healt-relatedquality of life (HRQoL) in patients with these hematologic malignancies. The first objective of this work is topresent an overview of the epidemiology of lymphoid malignancies with a study of changes in the incidenceand net survival in the Côte d’Or department between 1980 and 2009. The incidence, which has increased since1980, seems to have stabilized since the 2000s for some entities, including follicular lymphoma (FL) and diffuselarge B-cell lymphoma (DLBCL). Overall, we observed an improvement in net survival, with, however, a lessfavorable prognosis in the short and long-term for some entities. FL and DLBCL were the first lymphomas tobenefit from the introduction of monoclonal antibodies in their therapeutic management. Our second studyaimed to assess the impact of rituximab on overall survival in patients with FL or DLBCL in the Côte d’Or departmentusing a methodology based on the propensity score. Our results confirmed the significant benefit ofrituximab on overall survival in an unselected population of patients. In view of these results, we studied theHRQoL of these patients during and after treatment. HRQoL evolved differently during follow-up dependingon the type of lymphoma.

Le PCK3145 est un peptide de 15 acides aminés inhibant la sécrétion de MMP-9 et démontrant une activité anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hématologiques sécrètent MMP-9, nous avons donc évalué l’effet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons démontré que les lignées humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de myélome multiple RPMI-8226 ainsi que la lignée murine de mastocytome P815 ont une prolifération réduite suite à une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue également la clonogénicité de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanées P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrôles (« scrambled peptide » (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de métastases au niveau du foie par rapports aux contrôles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traitées au PCK3145 sont similaires à ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le « scrambled peptide », les niveaux de MMP-9 étaient significativement plus élevés que dans les souris sans tumeur et les souris traitées au PCK3145 (p<0.05). De surcroît, dans un modèle de xénogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au « scrambled peptide » (p<0.001). Ces résultats indiquent que le PCK3145 possède une activité anti-tumorale et pourrait représenter un agent intéressant pour le traitement de plusieurs cancers hématologiques. / PCK3145 has been shown to exert anti-tumor activity against prostate cancer cells. In a Phase I clinical study, this peptide demonstrated low toxicity. To determine whether PCK3145 could exert cytotoxic activity against other marrow infiltrating cancers, we tested its activity against hematologic cancers. Interestingly, PCK3145 inhibited the proliferation of human NHL (SR) and myeloma (RPMI-8226) cell lines and murine mastocytoma (P815) cell line in vitro. Moreover, PCK3145 reduced the clonogenicity of these cell lines. To explore its activity in vivo, DBA/2 mice were injected with P815 cells. PCK3145 treatment significantly decreased P815 tumors growth in comparison to PBS (p<0.001), scrambled peptide (p<0.05) and PCK5266 (amino acids 52-66 of PSP-94) (p<0.01). Intraperitoneal PCK3145 treatment led to a decreased number of liver metastasis compared to PBS (p<0.05) and scrambled peptide (p<0.05). MMP-9 levels, measured by ELISA, in the peripheral blood of treated P815 bearing mice were similar to those obtained with healthy animals (12.83 1.890 (mean SD) ng/ml and 6.48 0.4070 ng/ml, respectively), while MMP-9 levels were elevated in mice treated with PBS and scrambled peptide (35.12 8.559 ng/ml and 22.60 3.944 ng/ml, respectively; p<0.05). In NOD/SCID mice PCK3145 treatment resulted in significant inhibition of human NHL SR growth compared to treatment with PBS (p<0.001) and scrambled peptide (p<0.01). Consequently, treatment with PCK3145 can reduce tumor cell proliferation of murine and human hematologic cancers. In addition, PCK3145 has the potential to inhibit tumor cells dissemination by lowering MMP-9 secretion. Thus, PCK3145 represents a unique peptide demonstrating sequence-specific anti-tumor activity hematologic malignancies.

L‟infection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le système immunitaire et conduit à une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par conséquent, entraîne un état d‟immunodéficience. Cette immunodéficience permet l'établissement d‟infections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associées au Sida. Ces patients peuvent aussi développer des lymphomes, lésions du système nerveux central et une atteinte rénale. L'ampleur et la sévérité des conditions associées observées chez les patients infectés par le VIH-1 ne peuvent être imputées seulement au processus infectieux et à la déplétion des cellules T CD4+. Ceci suggère que les produits des gènes de régulation pourraient avoir des effets cytopathogènes. Cependant, les études sur la physiopathogenèse induite par le VIH ou ses différents gènes ont été difficiles à mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infectés par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider à disséquer le rôle des différents composants du génome viral et les mécanismes pathogénétiques impliqués. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modèle de souris transgéniques pour le gène vpu. Vpu code pour une phosphoprotéine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions à la surface cellulaire, induit la dégradation des CD4, induit la régulation négative des CMH-1, augmente la susceptibilité à la mort cellulaire des lymphocytes T infectés par le VIH et favorise la réplication virale en empêchant les mécanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractérisé pathologiquement un modèle de souris transgéniques porteuses du gène vpu du VIH-1. Nos résultats démontrent que l‟expression de vpu chez les souris transgéniques induit le développement spontané d‟une hyperplasie lymphoïde pansystémique, une splénomégalie avec une hyperplasie lymphoïde folliculaire évoluant en lésions prémalignes et malignes qui présentent certaines similarités avec la maladie de Castleman et une iv glomérulonéphrite mesangioproliférative qui rappelle certaines altérations de néphropathie associée au VIH chez les patients infectés. L‟ensemble des altérations démontre que les souris Tg/vpu développent une activation chronique et non spécifique du système immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une dérégulation de l‟IL-6 et une hyperplasie du réseau de cellules métallophiliques pourraient être impliquées. D‟autres résultats obtenus sur les évaluations du fonctionnement du système immunitaire de la rate et du thymus mettent en évidence une susceptibilité augmentée des lymphocytes des tissus lymphoïdes aux effets apoptotiques de la dexaméthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules d‟organes lymphoïdes ainsi qu‟une réaction inflammatoire (Schwartzman) exacerbée et des anomalies dans la réaction d‟hypersensibilité retardée expérimentale. Ce modèle transgénique reproduit plusieurs anomalies rencontrées chez les patients infectés par le VIH et ouvre de nouvelles hypothèses sur la pathogenèse de l‟infection par le VIH. / The HIV-1 infection results in a severe immunodepression due to an increasing depletion of the CD4+T lymphocytes and in a neurodegeneration that leads to a motor/cognitive complex dysfunction. In addition to these pathological alterations, patients with AIDS may also develop additional complications including neoplasms, nephropathy, hematological abnormalities and opportunistic infections. None of these complications can be accounted for solely by the loss of CD4+T lymphocytes and several investigators have started to suspect the regulatory and accessory genes of possibly playing a role in the AIDS physiopathogenesis. However, studies on the pathological effects contributed by these genes have been hampered by the lack of laboratory animals susceptible to HIV-1 infection. These could have helped to dissect out the role of the different components of the viral genome and their pathogenetic mechanisms. To overcome this obstacle, several investigators have developed transgenic mice carrying either HIV-1 individual genes or partially deleted genome. The vpu gene, which is unique to HIV-1, encodes a membrane phosphoprotein with several known functions as determined by in vitro studies. It participates in virions release at the cell surface, induces CD4 degradation, MHC-1 downregulation, increases apoptosis susceptibility of infected T cells and promotes viral replication by inhibiting cellular antiviral mechanisms. In order to investigate the contribution of vpu to the complex pathogenesis associated with HIV-1 infection, our laboratory developed a transgenic mouse model carrying vpu under the RSV LTR promoter. Here, we described our results of the clinical and pathological investigation of this unique animal model. Our results demonstrate that the expression of vpu in the transgenic mice induces a pansystemic lymphoid hyperplasia, splenomegaly with follicular lymphoid hyperplasia that progress to premalignant and malignant lesions, with striking characteristics of Castelman like-disease, and a mesangial vi hyperplasia variant of HIVAN frequently observed in adult and pediatric AIDS. All lesions observed in this mouse model suggest that the vpu carrying mice develop a nonspecific chronic activation of the immune system with hyperplasia of perivascular metallophillic cells and deregulation of the IL-6 expression within the hyperplastic follicles. Following treatment with dexamethazone and LPS, we observed an increased apoptosis susceptibility of the lymphocytes of the spleen and thymus with slow lymphocyte repopulation of these lymphoid organs. In addition, the transgenic mice developed an exacerbated reaction to the induced Schwartzman reaction and demonstrated a more delayed experimental DTH reaction. Thus, this transgenic model reproduces several abnormalities present in HIV patients. It represents a very interesting and valuable model for studies on the pathology contributed by the vpu gene in the absence of the cumulative effects of the other HIV-1 genes and might help define new possible functions and mechanisms of vpu in the HIV-1 pathogenesis.

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Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Tumor-assozierten T-Zellepitopen (TATE) in kutanen T-Zelllymphomen (CTCL) und die Charakterisierung der Tumour-spezifischen zytotoxischen Immunabwehr. Zwei Tumor-spezifische T-Zellklone wurden aus den Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) eines CTCL-Patienten etabliert. Die potentiellen natürlichen T-Zellepitope und Mimotope (synthetische Epitope ohne natürliche Korrelate aber mit meist hohen T-Zellaktivitäten) für diese Klone wurden mit einer kombinatorischen Peptidbibliothek identifiziert. Die Qualität und Quantität der T-Zellaktivitäten waren bei den jeweiligen Peptiden unterschiedlich. Die funktionellen Aviditäten varierten dabei um 3 Größenordnungen. Bei den einzelnen Peptiden korrelierte die Zytolyse und Zytokinsekretion nicht immer. Mit einigen Mimotopen wurden CTCL-Patienten für therapeutische Zwecke vakziniert. Die Frequenzen der Mimotop-spezifischen T-Zellen erhöhten sich während der ersten Vakzinationszyklen und tumorizide Aktivitäten konnten nachgewiesen werden. Diese ersten klinischen Anwendungen der Mimotope zeigen die Möglichkeit solcher Mimotope die sonst unzureichende Immunabwehr zu modulieren. Die Identifizierung neuer TATE ermöglichte die weitere Untersuchung der Tumor-spezifischen T-Zellen in der Peripherie und im Tumor des Patienten. Diese Analysen zeigten, dass diese Zellen im peripheren Blut aktiv aber im Tumor inaktiv waren. Die TILs waren vom effektor-memory Phänotyp expremierten aber nur schwach oder z. T. keine der Moleküle mit Effektorfunktion. Das immunsuppressive Zytokin TGF-beta könnte eine wichtige Rolle bei dieser unzureichenden Immunabwehr bei CTCL spielen. / The major goals of this work was the identification of tumour-associated T cell epitopes (TATE) in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) and the characterisation of the tumour-specific cytolytic immune response. Two tumour-specific cytolytic T cell clones were established from the tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) of one CTCL-patient. The potential natural T cell epitopes and mimotopes (epitopes without natural correlates but with more T cell stimulating capacity) for these T cell clones were identified using a combinatorial peptide library. The quantity and quality of the T cell response was different. The functional avidity of the peptides differed more than 3 orders of magnitude. The cytolysis and cytokine release did not correlate for each peptide. Some of the mimotopes were injected into CTCL-patients for therapeutic purpose. The frequency of the mimotope-specific T cell increased during the first vaccination cycles and a tumouricidal capacity could be observed. This first clinical application of the mimotopes showed the capacity of the mimotopes for the modulation of weak anti-tumour immune response. The identification of the new TATE allowed further characterisation of the tumour-specific T cells in the periphery and in the tumour of the patient. High frequency of the tumour-specific T cells could be detected in the tumour but they failed to show effector functions in comparison to the tumour-specific T cells in the peripheral blood. The tumour-specific T cells had the effector memory phenotype but expressed none or less amount of the cytolytic effector molecules. The reason for the suboptimal anti-tumour response in CTCL could be the immunesuppressive cytokine TGF-beta.

L’outil génomique a considérablement modifié notre connaissance des hémopathies malignes, que ce soit sur le plan physiopathologique, diagnostique, pronostique ou thérapeutique. Dans la première partie de ce travail, nous avons travaillé sur une grande cohorte d’anémies réfractaires sidéroblastiques avec thrombocytose (ARS-T). Nous avons démontré qu’il s’agissait d’une entité indépendante, avec une présentation moléculaire particulière associant (i) des mutations de SF3B1 dans plus de 85% des cas, expliquant son versant myélodysplasique et (ii) des anomalies de JAK2 dans plus de 50% des cas, expliquant son versant prolifératif. La perspective de cette première partie est d’identifier la ou les mutation(s) responsables du caractère myéloprolifératif dans les ARS-T JAK2WT. Les lymphomes B-diffus à grandes cellules (LBDGC) représentent les lymphomes malins non-Hodgkiniens les plus fréquents chez l’adulte. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons réalisé l’analyse par SNP-array d’une série homogène d’échantillons issus de la cohorte CORAL, une étude prospective internationale portant sur les LBDGC en rechute. Notre objectif était d’identifier les anomalies de nombre de copies (ANC) associées à chacun des deux types de rechutes, précoces ou tardives. Les rechutes précoces sont associées à une forte proportion d’anomalies affectant les régulateurs du cycle cellulaire, de l’apoptose et de la transcription. Les rechutes tardives sont associées à des anomalies affectant les régulateurs de l’immunité et de la prolifération cellulaire. Cette étude permet de mieux comprendre les déterminants de la rechute dans les LBDGC et ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques / Genomics provided new insights in our knowledge of pathophysiology, diagnostic approach, prognosis and therapeutic perspectives in hematological malignancies. In the first part of this work, we studied a large cohort of Refractory Anemia with Ring sideroblasts and marked Thrombocytosis (RARS-T). We demonstrated that RARS-T can be considered as an independent entity, with a specific molecular pattern, associating : (i) SF3B1 mutations in more than 85% of cases, accounting for its myelodysplastic aspect and (ii) JAK2 mutations, accounting for its myeloproliferative aspect in more than 50% of cases. Future prospects of the first part of this work is to identify (the) mutation(s) responsible for the myeloproliferative part of JAK2WT RARS-T. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common subtype of non-Hodgkin lymphoma in adults. In the second part of this work, we performed SNP-array analysis of a homogeneous series of samples from the CORAL cohort, an international prognostic study on relapsed DLBCLs. Our purpose was to identify Copy Number Variations (CNV) associated ER or LR. ER DLBCLs are associated with high rates of CNVs affecting regulators of cell cycle, apoptosis and transcription. In LR DLBCLs, CNVs are related to immune response and cell proliferation. This study provides new insights into the genetic aberrations in relapsed DLBCLs and open up new therapeutic perspectives

Das Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) ist ein autosomal-rezessiv vererbtes Chromosomenbruchsyndrom, dem in > 90% der Patienten eine 5bp-Deletion im Nbs1-Gen zugrundeliegt. Klinisches Hauptmerkmal ist ein stark erhöhtes Krebsrisiko, insbesondere für B-Zell-Lymphome. Bereits bekannt ist die Funktion des entsprechenden Genprodukts, Nibrin, bei den für die Krebsprävention wichtigen Mechanismen der DNA-Reparatur und der Zellzykluskontrolle. Daneben spielt die Apoptose eine essentielle Rolle bei der Krebsentstehung. Zu untersuchen ob Nibrin auch hier Funktionen übernimmt war Gegenstand dieser Arbeit. Eine Störung der Apoptose könnte dabei mitverantwortlich für das hohe Krebsrisiko der NBS-Patienten sein. Kern der Arbeit war die Untersuchung von NBS-B-Lymphozyten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, nach einer DNA-Schädigung die Apoptose zu induzieren. Hierzu wurde in den entsprechenden Zellen mittels Bleomycin der Apoptoseprozess ausgelöst und die prozentualen Apoptoseraten durchflusszytometrisch bestimmt. Die Mehrheit der NBS-Zelllinien zeigte eine Störung in der Apoptoseinduktion im Sinne signifikant verminderter Apoptoseraten. Dies weist auf eine Funktion des Nibrins bei der Induktion der Apoptose hin. Andere NBS-Zelllinien zeigten normale Apoptoseindices. Dies könnte auf dem individuellen genetischen Hintergrund der Zellen beruhen, der auch für die erhebliche klinische Variabilität des Krankheitsbildes verantwortlich ist. Eine Korrelation der Apoptoseraten mit der Krebsinzidenz zeigte, dass alle Patienten mit reduzierten Apoptoseraten bereits Lymphome entwickelt hatten, während Patienten mit normalen Apoptoseindices bisher keine Lymphome aufwiesen. Möglicherweise gibt es also generell zwei Gruppen von NBS-Patienten - Patienten mit höherem und mit niedrigerem Entartungsrisiko, wobei eine verminderte Apoptoseinduktion als Risikofaktor für Krebs angesehen werden könnte. / The human genetic disorder, Nijmegen-Breakage-Syndrome (NBS), is characterised by an in increased risk for cancer, particularly B-cell-lymphoma. The Nbs1-gene codes for a protein, Nibrin, involved in the processing/repair of DNA double strand breaks and in cell cycle checkpoints - mechanisms relevant for cancer-prevention. As a third mechanism, apoptosis is important in preventing cancer. To evaluate whether Nibrin plays a role in this process was the aim of this study. Failure of apoptosis-induction could be another factor responsible for the high cancer risk in NBS. For this purpose we examined a set of NBS-B-cell-lines for their capacitiy to enter into apoptosis after a DNA-damaging treatment with Bleomycin. The majority of NBS-cell-lines showed a deficiency in apoptosis-induction. This may indicate a function of Nibrin in mechanisms of apoptosis-regulation. Some NBS-cell-lines showed a proficient apoptotic response, though. The reason may be found in the variable genetic background of the cell lines, also responsible for the high clinical variability of the disease. Correlation of apoptosis rates with cancer incidence showed that all patients deficient in apoptosis had already developed B-cell-lymphoma, whereas patients with normal rates had not developed lymphoma so far. Possibly there are two groups of NBS-patients- patients with higher and with lower risk of malignancy, with reduced apoptotic rates being a risk-factor for the development of cancer in NBS.

Zusammenfassung Die molekularbiologischen Untersuchungen der variablen Genabschnitte der Immunglobulingene von Lymphomzellen zweier Patienten mit kutanen B-Zell-Lymphomen wurden in der vorliegenden Arbeit mittels Einzel-Zell-PCR-Technik durchgeführt. Die erfolgte Analyse galt bevorzugt dem Aspekt der intraklonalen Diversität. Die Sequenzanalysen der Ig-Gene für die leichte Kette aus den insgesamt 100 untersuchten Tumorzellen des Patienten WS ergaben, daß zwischen den Zellen aus drei voneinander entfernt lokalisierten Gewebeproben intraklonale Diversität vorlag. Aufgrund der Mutationsanalysen und der Zuordnung der Subklone zu den Entnahmeorten ist eine evtl. antigengetriebene Entwicklung des Tumorklons zu vermuten. Bei Patient LB konnte trotz des großen Aufwandes, der Untersuchung von insgesamt 126 Zellen aus acht räumlich getrennten Biopsien, keine intraklonale Diversität für die schwere Kette der Immunglobulingene aufgezeigt werden. Die Sequenzunterschiede der leichten Kette beruhen auf einer einzigen stummen Mutation im Bereich der CDR 1, die keinen funktionellen Einfluß auf die Aminosäuresequenz hat und deshalb geringe prognostische Bedeutung besitzt. In beiden Fällen lagen hypermutierte Immunglobulingene vor. Die Tumorzellen des Patienten WS sind aus molekularbiologischer Sicht Keimzentrumszellen, die des Patienten LB eher Nachkeimzentrumszellen zuzuordnen. Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen, daß bei der Untersuchung und Erforschung der Pathogenese von kutanen B-Zell-Lymphomen eine gewonnene Gewebeprobe nicht repräsentativ für den gesamten Tumor sein muß. Veröffentliche Ergebnisse, bei denen Monoklonalität anhand einer Biopsie postuliert wurde, müssen daher initial überdacht werden (74;76;77;84). Es ist folglich in Betracht zu ziehen, daß bei einer exakten molekularbiologischen Zuordnung der Tumorzellen zu ihrem Entwicklungsstadium und ihrer Herkunft räumliche als auch zeitliche Faktoren zu beachten sind. Eine chronologische Untersuchung könnte aufzeigen, ob andauernde Mutationen in den Tumorzellen stattfinden. Die Mikromanipulation und die Einzel-Zell-PCR-Technik sind elegante Methoden, um intraklonale Sequenzunterschiede aufzuzeigen und einen Beitrag für die molekularbiologische Erforschung der Pathogenese von kutanen B-Zell-Lymphomen zu leisten. Eine Kontrolle von malignoproliferativen Krankheiten, ob es unter den heutigen Therapiemöglichkeiten gelingt, den malignen Tumorklon vollständig zu beseitigen oder Aussagen über Progredienz und Prognose zu treffen, wäre ein interessanter Einsatzbereich dieser Methode. / abstract The molecularbiological investigation of the immunoglobulin variable region genes of two patients suffering on primary cutaneous B-cell-lymphoma was carried out using single-cell- PCR technic. The main focus lay on the aspect on the aspect of detecting intraclonal diversity. The sequence nucleotid-analysises of the immunoglubulin light chain genes obtained from a total of 100 investigated tumor B-cells in patient WS revealed intraclonal diversity among cells isolated from three spatially separated tissue samples. Considering the mutational pattern and the subclones in dependence on the tumorcells, taken from different topographical tumorsides, an antigen-driven clonal expansion could be supposed. Despite extensive efforts and the analysis of altogether 126 tumor B-cells out of eight spatially different localised biopsies, no intraclonal diversity could be observed for the immunoglobulin heavy chain rearrangement of second patient LB. Sequence differences of the Ig light chain based on only a single silent mutation within the CDR1 region. This mutation has no functional affect of the amino acid sequence and therefore little prognostical significance. In both cases the immunoglobulin genes were somatically hypermutated in compromise to the germ-line gene. From the molecularbiological point of view, the tumor cells of patient WS descended from germinal center cells, whereas the tumor B-cells of patient LB rather can be characterized as post-germinal center cells. The results clearly demonstrate, that the investigation of a single tissue sample of primary cutaneous B-cell lymphoma using micromanipulation and single cell-PCR technic may not be representative for the whole tumor. Publications concluding monoclonality with no intraclonal diversity from the analysis of a single biopsie therefore have to be interpreted with caution (74;76;77;84). Accordingly, an appropiate molecularbiological characterization of tumor B-cells regarding their developmental stage and origin has to consider spatial and time dependant aspects. Only the investigation of sequential biopsies may reliably detect ongoing mutations in tumor B-cells. The combination of micromanipulation and single cell PCR represents an elegant method to observe intraclonal diversity. The technic will give contribution to molecularbiological investigation of the pathogenesis of primary cutaneous B-cell lymphomas. It could be of interest to apply this method to the evaluation of current therapies with respect to its capability to eradicating the malignant cell clone completely, and to draw conclusions on disease progression and prognosis.