L’Hypertensions Artérielle Pulmonaire (HTAP) résulte de l’obstruction progressive des artères pulmonaires de petits calibres due à un remodelage de la paroi vasculaire ainsi qu’à une vasoconstriction. Cette thèse repose sur 3 piliers de la physiopathologie de l’HTAP : l’inflammation, l’épigénétique et la susceptibilité génétique de la maladie.Le premier projet démontre que les cellules dendritiques des patients atteints d’HTAP sont moins sensibles à l’action immunomodulatrice des glucocorticoïdes et orientent la réponse des lymphocytes T vers une réponse Th17, souvent impliquée dans les maladies autoimmunes.Le second projet a pour but de comparer le profil de méthylation des cellules endothéliales d’artères pulmonaires (CE-AP) de patients atteints d’HTAP comparé aux CE-AP de patients contrôles. Nous avons mis en évidence des clusters de gènes ayant un profil de méthylation différents entre les CE-HTAP comparé aux CE-CTR. Un gène différentiellement méthylé s’est dégagé durant l’étude bioinformatique : ABCA1 (ATP binding cassette 1). L’altération de son expression prédite par l’étude bioinformatique a été validée chez l’homme et le modèle de rat monocrotaline.Enfin, le dernier projet décrit la caractérisation d’un nouveau modèle animal de susceptibilité génétique à l’HTAP liée à des mutations dans le gène Bmpr2 chez le rat, au niveau hémodynamique, histologique, vasculaire, moléculaire et électrophysiologique. Nous avons démontré que ce modèle reproduit des schémas physiopathologiques pertinents vis-à-vis de la maladie humaine, ces résultats font de ce modèle un nouveau outil d’étude de la physiopathologie de l’HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by a progressive pulmonary arterial obstruction due to pulmonary vascular remodeling of distal arterioles as well as abnormal vasoconstriction. This project allowed to study three biological process clearly establish to be implicated in physiopathology of PAH.The first project demonstrated a dendritic cells dysfunction and a Th17 immune polarization of idiopathic PAH patients.The objective of the second project was to study the epigenetic variations in pulmonary endothelial cells (PEC) through a specific pattern of DNA methylation. We identified clusters of probes that discriminates controls and PAH patients. During bioinformatics study, ABCA1 (ATP binding cassette 1) gene was emphasized. Alteration of ABCA1 expression predicted during bioinformatics study has been validated in human and in monocrotaline rat model.The last project described the validation of a new PAH model by a hemodynamic, histological, vascular, molecular and electrophysiological characterization of heterozygous rat mutated to Bmpr2 gene. Whole functional and molecular dysregulation define this animal model like a useful tool in the study of BMPRII signaling alteration in PAH physiopathology.

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique qui touche principalement les personnes âgées. Le seul traitement curatif de cette maladie est la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques, souvent difficile à mettre en oeuvre. Les patients qui ne peuvent être greffés et dont la maladie présente des critères de gravité se voient proposer un agent déméthylant de l'ADN. Chez 30 à 40% d'entre eux, ce traitement induit une réponse objective dont le bénéfice en termes de survie n'est pas démontré. Le séquençage de gènes candidats a identifié une trentaine de gènes mutés de façon récurrente. Il s'agit de gènes codant des régulateurs épigénétiques, des facteurs d'épissage, des facteurs de transcription, et des protéines de la signalisation intracellulaire. Cette approche ne donnait qu'une vision partielle des événements génétiques associés à la maladie.Le premier objectif de cette thèse a été de recenser l'ensemble des mutations touchant les régions codantes et non codantes de l'ADN dans les cellules leucémiques des patients.Le séquençage de l'exome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 49 patients. Nos analyses ont montré qu'en moyenne, un patient porte 14 mutations somatiques dans les régions codantes. Nous avons confirmé que les mutations récurrentes les plus fréquentes affectaient les gènes TET2, SRSF2 et ASXL1. Nous avons aussi identifié 8 nouveaux gènes mutés de façon récurrente à une faible fréquence. En moyenne, 3 des 14 mutations affectent des gènes touchés de façon récurrente.Le séquençage du génome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 17 patients. L'analyse réalisée a détecté 475 mutations par patient dans les régions non répétées du génome. Dans l'exome, comme dans le reste du génome, les altérations principales sont des transitions. Deux signatures mutationnelles ont été identifiées et sont observées dans de nombreux cancers, traduisant probablement des altérations de la méthylation des cytosines au cours du vieillissement. Une troisième signature, jamais observée jusqu'alors et de signification indéterminée, a été détectée chez 2 patients.Nous avons alors répété l'analyse de l'exome dans les monocytes triés de 17 patients prélevés de façon séquentielle sur plus de 2 années : 6 n'ont pas été traités et 11 ont été traités par un agent déméthylant, parmi lesquels 6 sont restés stables et 5 ont montré une réponse clinique et biologique objective. L'analyse montre que 1) l'accumulation de mutations est un événement rare ; 2) l'hétérogénéité génétique du clone malade est limitée ; 3) la charge allélique des mutations reste inchangée, même chez les répondeurs ; 4) de nouvelles mutations peuvent apparaître alors que le patient est répondeur.Nous avons alors sélectionné 9 patients, 3 non traités, 3 stables sous traitement sans réponse objective, et 3 répondeurs. Nous avons collecté leurs monocytes avant tout traitement et quelques mois plus tard, alors que 6 d'entre eux étaient traités par un agent déméthylant. Nous avons analysé l'expression des gènes et la méthylation globale de l'ADN à ces deux temps. Chez les patients non traités, nous avons observé une remarquable stabilité de l'expression des gènes et de la méthylation de l'ADN. Chez les patients répondeurs, le traitement induit un changement significatif du niveau d'expression d'environ 500 gènes et la déméthylation d'environ 35,000 régions de l'ADN. Chez les patients stables sous traitement, le traitement induit un changement d'expression d'une soixantaine de gènes et du niveau de méthylation d'une centaine de régions seulement. Ces résultats suggèrent que les agents déméthylants n'affectent l'expression des gènes et la méthylation de l'ADN que chez les répondeurs, fournissant un argument important pour un effet essentiellement épigénétique et très peu cytotoxique de ces médicaments. / Chronic myelomonocytic leukemia is a clonal disorder of the hematopoietic stem cell, affecting mainly the elderly. The only curative therapeutic is allogeneic stem cell transplantation, which is rarely feasible. When transplantation is not an option, patients with a severe disease can be treated with a demethylating agent. Thirty to 40% of these patients show hematological improvement, but it remains unknown if these drugs increase overall survival. Analysis of candidate genes by Sanger sequencing, then by New Generation Sequencing, identified about thirty genes that are frequently mutated. These genes encode epigenetic regulators, splicing factors, transcription factors and cell signalling regulators. However, this approach catched only part of the genetic events that characterize this disease.The first objective of this study was to determine the mutational landscape of CMML cells by analyzing the coding and non coding regions of leukemic cell genome.We first performed whole exome sequencing analysis of leukemic and control cells in 49 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 14 somatic mutations in its coding regions. We confirmed that the most frequent mutations were in TET2, SRSF2 and ASXL1 genes. We identified also recurrent mutations in 8 new genes, these recurrent mutations occurring at a low frequency. In average, 3 out of the 14 mutations identified in each patient affected recurrently mutated genes.Secondly, we performed whole genome sequencing of leukemic and control cells in 17 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 475 somatic mutations in the non repeated regions of the genome. In both the coding and non coding sequences, alterations were observed to be mainly transitions. As a signature of CMML, two mutational processes were identified in all 17 patients and are found in various other cancer types, most likely resulting from the cytosine methylation observed with ageing. A third process, never seen before and without known significance, was also detected in two patients.We collected several samples from 17 patients on a more than two year period: 6 of these patients remained untreated whereas 11 were treated with demethylating agent, among which 6 showed a stable disease and 5 fulfilled criteria of hematological improvement. These sequential analyses showed that 1) the occurence of new mutations is a relatively rare event ; 2) the genetic heterogeneity of the malignant clone is limited ; 3) the mutation allele burden remains unchanged under treatment, whatever the response ; 4) new mutations can appear, even in responding patients.We selected 9 patients, 3 untreated, 3 stable on therapy and 3 responders. We collected monocytes before treatment and a few months later and we analyzed gene expression and DNA methylation in sorted monocytes at these two time points. We did not detect any significant change in gene expression and DNA methylation pattern in untreated patients. In those who responded to treatment, we noticed significant changes in both gene expression, with about 500 deregulated genes, and the DNA methylation pattern, with about 35,000 demethylated regions. In stable patients, the treatment had a limited effect with changes in the expression of about 60 genes, and in the DNA methylation pattern of about 100 regions. These results show that demethylating agents affect gene expression and DNA methylation of responding patients only, suggesting they have mostly an epigenetic effect rather than a cytotoxic one.

Le domaine de l'épigénétique couvre l'ensemble des phénomènes héritables et transmissibles qui interviennent dans l'expression du génome sans modifier la séquence nucléotidique. L'information épigénétique est régulée par les modifications de la chromatine impliquant les histones et l'ADN. La méthylation de l'ADN est un phénomène réversible jouant un rôle crucial dans l'expression des gènes puisque la méthylation des promoteurs de gènes empêche leur transcription. La modulation aberrante de cette marque épigénétique est associée à diverses pathologies telles que le cancer. Cette méthylation étant réversible, elle peut être ciblée afin de reprogrammer la cellule cancéreuse. Les méthyltransferases d'ADN (DNMT), étant les enzymes responsables de la méthylation, représentent la cible principale de notre stratégie de recherche. Leur inhibition par des petites molécules est au centre de nos recherches de thérapies anticancéreuses dont les bases sont représentées par deux catégories d'inhibiteurs de DNMT existant. Les premiers sont des analogues de cytosine qui est la cible de la méthylation. Ils sont connus pour s'intégrer dans l'ADN et former un complexe covalent irréversible avec l’enzyme (complexe suicide) mais ils souffrent d'un manque de stabilité et de certains effets indésirables dus à leur incorporation dans l’ADN. Les seconds sont les inhibiteurs non nucléosidiques qui sont divers et parfois connus pour cibler d’autres enzymes. Ils ont l’avantage de pouvoir être utilisés comme sondes pour comprendre plus précisément le mécanisme d'inhibition mais ils manquent de spécificité et de sélectivité. Au cours de cette thèse, une banque de molécules a été criblée à partir de la combinaison d'un test enzymatique et d'un test cellulaire visant à inhiber ces enzymes. Les synthèses de trois familles de molécules potentiellement inhibitrices de DNMT issus de ce criblage sont décrites en expliquant le chemin de drug design emprunté pour obtenir des informations mécanistiques d’inhibition de la méthylation d’ADN, notamment de réactivité avec la cible. Les découvertes ont été inspirées par des études de modélisation permettant de mettre en évidence une sélectivité de certains inhibiteurs. La synthèse chimique a également abouti à une nouvelle voie de synthèse d’accès aux diaminopyrimidines dont l’impact permet de faciliter les études chimiques de dérivés quinazolines comme inhibiteur non nucléosidiques utiles pour les thérapies anticancéreuses. / Epigenetic is defined as the study of heritable changes in the genes expression without altering the DNA sequence. Two main processes are implicated in this field, the histones modifications and the DNA methylation. By introducing an acetyl or a methyl group on the histone tails or by methylation of DNA, the chromatin state is modified and the gene expression is controlled. Aberrant epigenetic modifications are associated with several diseases, in particular with cancer. In cancer cells, the whole DNA is hypomethylated, thus promoting genome instability, while the promoter region is hypermethylated, inducing silencing of these genes. Overall, these observations indicate that DNA methylation is a central epigenetic process in cancerogenesis. Since DNA methylation is reversible, it is possible to target the methylation process in order to reactivate tumor suppressor genes. The DNA methyltransferases (DNMTs), the enzymes responsible for DNA methylation, use the SAM co-factor at specific CpG sites to product 5-methylcytosine. Three main isoforms (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) are described to ensure efficient methylation process during replication. Two families of DNMT inhibitors already exist, the nucleosidiques analogues are cytidine derivatives and are toxic molecules because of their incorporation into DNA, and the non-nucleosidic analogues are less toxic but also less potent. Our strategy of drug design is based on docking study and high throughput screening (HTS) information. First, novel potent derivatives of reference inhibitors are designed from molecular modelling. Then, three different families of compounds from HTS are described with appropriate structure-activity relationship studies. Mechanistic information on DNA methylation process are described through the discovery of a reactive inhibitor of DNMT3A. The study on a family of hydrazone derivatives of gallic acid is depicted and shows its selectivity for DNMT3A, compared to DNMT1, based on docking study. An alternative chemical pathway to diaminopyrimidines is described and extended to the synthesis of quinazolone in order to synthesize new quinazoline derivatives as potent inhibitors of DNMT. Promising informations are described in this thesis to enrich epigenetic knowledge of tumor genesis and to provide new molecules for anticancer therapy.

La progression du cancer du sein repose principalement sur la signalisation des œstrogènes et de la progestérone, et les traitements modulant l’action des œstrogènes ont amélioré la survie des patientes atteintes d’un cancer à récepteurs œstrogéniques (ERα). Des études récentes convergent sur le concept selon lequel, dans les cancers du sein ER+, PR (Progesterone Receptor) peut inhiber les fonctions favorisant la croissance induite par l'œstrogène en reprogrammant directement la liaison d'ERα sur de nouveaux gènes cibles. Les données cliniques montrent que cette signature génique est associée à un bon pronostic dans une cohorte de 1.959 patientes atteintes de cancer du sein et qu’un agoniste de la progestérone améliore l'activité antiproliférative des thérapies anti-oestrogéniques1. Ainsi, ces données démontrent qu’ER n’est pas le seul acteur de la tumorigénèse mammaire et qu'il existe une interférence fonctionnelle entre ces deux voies hormonales, soulignant le besoin d’une meilleure compréhension de la signalisation de PR. D’un point de vue mécanistique, l’activité de PR est étroitement liée à l’interaction avec les nucléosomes. En effet, PR fonctionne comme un facteur « pionnier » et se lie à la chromatine au sein de complexes protéiques, régulant son activité transcriptionnelle. Sans progestérone, PR forme un complexe répressif associé à des enzymes modificatrices de la chromatine comme LSD1, HDAC1/2 et la protéine de l'hétérochromatine HP1γ2. En réponse au traitement hormonal, ce complexe est déplacé, ce qui permet de recruter des coactivateurs et des cofacteurs associés, qui modifient la structure de la chromatine locale et entraînent l'activation ou la répression des gènes cibles de PR. Nous avons identifié un nouveau régulateur de la signalisation de la progestérone, l'arginine méthyltransférase PRMT1, enzyme souvent surexprimée dans les cancers mammaires3,4. Par diverses approches in vitro et in vivo, nous avons montré une interaction directe entre PR et PRMT1, dans le noyau des cellules tumorales mammaires, et à la fois en absence d’hormone et après 1h de stimulation à la progestérone. De plus, PRMT1 apparaît comme un nouveau membre du complexe répressif sur la chromatine, associé à PR et à ses partenaires, dans un sous-ensemble de gènes inductibles par la progestérone. Nos résultats indiquent également que l’expression de PRMT1 affecte l’activité transcriptionnelle de PR et que son inhibition perturbe l’activation rapide de la voie de la protéine kinase après une stimulation progestative. Nous montrons pour la première fois que PR est méthylé sur un résidu arginine, conservé parmi les récepteurs nucléaires (R637), localisé dans son domaine de liaison à l'ADN. La production d’un anticorps dirigé contre la forme méthylée de PR nous a permis de préciser qu’elle se localisait dans le noyau des cellules et n’était retrouvée qu’après traitement progestatif. En outre, la mutation de R637 de PR entraine une diminution de l’expression d'un sous-ensemble de cibles de PR, ce qui entraine un retard de croissance cellulaire. En conclusion, ces résultats confirment l'implication de PRMT1 et de son activité méthyltransférase dans la signalisation de PR et plus particulièrement dans son activité transcriptionnelle. Nous démontrons donc que la méthylation sur résidus d'arginine est un nouveau mécanisme de contrôle lors de la réponse à la progestérone dans les cellules tumorales mammaires / Breast cancer progression is mainly driven by estrogen and progesterone signalling and therapies modulating oestrogen‘s action have improved the survival of ER+ cancer patients. As progesterone receptor (PR) is an ER target gene, its expression in breast cancer was considered as a predictive marker of ER functionality. However, recent studies are converging on the concept that PR can directly affect ER functions in breast cancer cells1. Activated PR can redirect ER to novel chromatin binding sites associated with cell differentiation and apoptosis, leading to a potential improvement of the tumour response to anti-oestrogen therapies. In considering the differential effects of progesterone in breast cancer, it is important to define the variable might influence progesterone pathway and the downstream mediators involved in this signalling. Recently, Beato and al reported that, in breast cancer cells, the unliganded form of PR (non-activated with progesterone) bind to genomic sites and target a repressive complex containing enzyme modifying chromatin as the demethylase LSD1 or the Heterochromatin Protein 1 (HP1γ)2. Under hormonal treatment, this complex is displaced, which makes it possible to recruit coactivators and associated cofactors, which modify the structure of the local chromatin and cause the activation or repression of the target genes of PR. In addition, cellular response to progesterone is also regulated by receptor post-translational modifications that may affect its stability, its subcellular localization and its interactions with regulators. In our study, we demonstrated for the first time that PR is methylated on arginine residues, by the arginine methyltransferase PRMT1. We identified as target the arginine 637 (R637), a conserved arginine among nuclear receptor superfamily, located in the DNA-binding domain of the receptor. By in vitro and in vivo approaches, we are studying the impact of PRMT1 on PR signalling pathways. In T47D breast cancer cells, we demonstrated that PR interacts with PRMT1, mainly in the nucleus. Of interest, PRMT1 interacts with PR in the nucleus in absence of hormone stimulation and it appears as a new member of the repressive complex on a subset of progesterone inducible genes. Our results also indicate that PRMT1 expression affects PR transcriptional activity and PRMT1 knockdown disrupts the rapid activation of protein kinase pathway after progestin stimulation. The production of an antibody directed against the methylated form of PR allowed us to specify that methylated-PR is localized in the nucleus of cells and was found only after progesterone treatment. Furthermore, PRMT1 depletion and mutation of R637 resulted in an inhibition of a subset of PR-regulated genes which led to retarded cell growth.Our data reveal the impact of PRMT1 expression on PR pathways and provide evidence for the asymmetric arginine dimethylation of PR. We therefore demonstrate that methylation on arginine residues could be a novel control mechanism in the response to progesterone in mammary tumor cells

No description available.

No description available.

La pollution atmosphérique et les évènements météorologiques sont reconnus pour avoir des graves conséquences sur la santé telles que la mortalité cardiovasculaire et respiratoire, et par conséquent représentent un enjeu majeur de santé publique. Des travaux plus récents ont suggéré un effet des expositions à ces facteurs environnementaux durant la période intra-utérine. La vie fœtale est déterminante pour le bon développement de l’enfant. L’exposition maternelle aux facteurs environnementaux pendant la grossesse pourrait avoir des conséquences sur les issues de grossesse et la santé à court ou long terme. Par ailleurs, les mécanismes biologiques qui pourraient expliquer l’effet des expositions environnementales sur les issues de grossesse indésirables sont à l’heure actuelle très peu connus. Les objectifs de la thèse étaient : 1) d’étudier les associations entre d’une part la température et l’humidité relative pendant la grossesse et d’autre part le poids de naissance, la durée de gestation et la prématurité ; 2) d’étudier les associations entre l’exposition maternelle aux polluant de l’air et aux évènements météorologiques pendant la grossesse et la méthylation de l’ADN placentaire en utilisant A) une approche agnostique et B) une approche avec a priori basée sur l’intégration de connaissances biologiques. Le premier objectif s’est appuyé les données issues de deux cohortes mère-enfant, EDEN (avec un recrutement à Poitiers et Nancy en 2003-2006) et PELAGIE (Bretagne, 2002-2006) soit au total 5185 couples mère-enfant ; le deuxième objectif s’est appuyé sur un échantillon de 668 femmes de la cohorte EDEN chez qui le placenta a été prélevé et le niveau de méthylation de son ADN caractérisé. Les données quotidiennes de température et d’humidité ont été obtenues de Météo-France et l’exposition à la pollution atmosphérique a été estimée par un modèle de dispersion atmosphérique. Différentes fenêtres d’exposition au cours de la grossesse ont été considérées. Des échantillons de placenta centraux ont été collectés à l’accouchement et la méthylation de l’ADN a été analysée en utilisant la puce Illumina 450K. Pour répondre au premier objectif, des modèles de régression linéaire et des modèles de Cox ont été réalisés. Pour répondre au second objectif, des modèles de régression linéaire robuste, notamment à l’échelle du génome entier, ont été réalisés en appliquant des méthodes de correction de tests multiples telles que Bonferroni et Benjamini-Hochberg. Nos résultats suggèrent un effet délétère de la température et l’humidité sur le poids de naissance et ne mettent pas en évidence d’association entre pollution atmosphérique et issues de grossesse. L’exposition aux polluants atmosphériques (NO2 et PM10) pendant la grossesse était associée à une diminution de la méthylation de l’ADN placentaire pour les gènes ADORA2B et ADARB2 ; le premier gène étant connu pour être potentiellement impliqué dans la pré-éclampsie et l’hypoxie de la femme enceinte et le deuxième étant potentiellement impliqué dans les troubles métaboliques chez l'adulte tels que la circonférence abdominale et l'IMC. Les résultats des approches agnostique et avec a priori étaient cohérents pour le gène ADORA2B. Nous n’avons pas identifié d’association entre les conditions météorologiques et la méthylation de l’ADN placentaire. A notre connaissance, nous sommes les premiers à avoir étudié l’association entre la méthylation de l’ADN dans le tissu placentaire et l’exposition prénatale aux polluants de l’air et aux conditions météorologiques en utilisant des données de l’épigénome entier. Ce travail de thèse ouvre de nouvelles voies possibles concernant les mécanismes d’actions des polluants environnementaux et fournit des pistes quant aux effets à long terme possibles de ces expositions. / Nowadays, air pollution and weather conditions represent a major public health issue. It is recognized that they may have serious consequences for health especially in the most sensitive populations such as pregnant women. More recent studies have suggested an effect of exposure to these environmental factors during the fetal period. Fetal life is a critical period for the healthy development of the child. Maternal exposure to environmental exposures during pregnancy could have serious consequences on pregnancy outcomes and short- and long- term health. Furthermore, the biological mechanisms that could explain the effect of environmental exposures on adverse pregnancy outcomes are largely unknown up to now. The objectives of the thesis were: 1) to study the association between maternal exposure to temperature and relative humidity during pregnancy and birth weight, gestational duration and preterm birth; 2) to study the association between maternal exposure to air pollutants and meteorological conditions during pregnancy and placental DNA methylation using A) an agnostic approach and B) a priori approach based on integration of biological knowledge. The first part of this work relied on data from two mother-child cohorts EDEN (Poitiers and Nancy, 2003-2006) and PELAGIE (Britain, 2002-2006) corresponding to 5185 mother-infant pairs analyzed; and the second part relied on a sample of the EDEN cohort for which methylation data were available (n = 668). Daily data of temperature and humidity were obtained from Météo-France and pollution data were obtained using a dispersion model. Their exposure was averaged over different periods during pregnancy. Central placenta samples were collected at delivery and DNA methylation was analyzed using Illumina 450K chip. For the first objective, linear regression models and Cox models were used. For the second objective, robust linear regression models, especially across the genome-wide, were used and correction methods for multiple testing such as Bonferroni and Benjamini-Hochberg were applied. Our results suggest a deleterious effect of temperature and relative humidity on birth weight and did not show an association between air pollution and pregnancy outcomes. Exposure to air pollutants (NO2 and PM10) during pregnancy was associated with a decrease in placental DNA methylation for ADORA2B and ADARB2 genes; the first gene is known to be potentially involved in preeclampsia and hypoxia of the pregnant woman and the second being potentially involved in metabolic disorders in adults such as abdominal circumference and BMI. The results of agnostic and a priori approaches were consistent for ADORA2B gene. We did not found association between weather conditions and placental DNA methylation. To our knowledge, we are the first to study the association between DNA methylation in the placental tissue and prenatal exposure to air pollutants and weather conditions using data from the entire epigenome. This work opens up new possible pathways regarding mechanisms of action of environmental pollutants and provides pointers as to the possible long-term effects of these exposures.

Malgré la stabilité historiquement associée à la méthylation de l’ADN, cette modification épigénétique subit des changements rapides importants dans les types cellulaires plus plastiques. Par exemple, l’infection de cellules dendritiques humaines est associée à des milliers de changements dans le paysage de méthylation, principalement des pertes de méthylation dans les amplificateurs. Cette déméthylation est corrélée à l’apparition de marques actives d’histones et à l’activation des gènes à proximité. Dans la présente thèse, le rôle plus précis de cette déméthylation active a été investigué. Une étude temporelle de l’infection de cellules dendritiques par Mycobacterium tuberculosis a révélé que les changements d’expression génique et la liaison des facteurs de trancription classiquement activés en réponse à une infection bactérienne, comme les familles de NF-B et AP-1, étaient préalables aux changements de méthylation, suggérant un rôle minimal de la déméthylation dans la réponse à l’infection. D’autres résultats allaient dans le même sens, soit en inhibant TET2, une enzyme participant à la déméthylation active de l’ADN dans les cellules dendritiques via sa conversion en intermédiaires. En effet, l’impact d’une telle inhibition sur la réponse transcriptionnelle à l’infection par Salmonella typhimurium était minime. Cependant, l’inhibition de TET2 entraîne un niveau basal d’expression de cytokines pro-inflammatoires plus élevé, ce qui m’entraîne à proposer que la déméthylation puisse participer au retour à la normale post-infection. Elle pourrait également avoir une fonction dans la mémoire immunitaire innée en permettant une réponse plus rapide à une seconde infection, un phénomène surtout démontré dans les monocytes et les macrophages, mais mis en évidence dans les cellules dendritiques dans la présente thèse. Ainsi, cette étude ouvre de nombreuses perspectives dans la thérapie épigénétique contre les maladies auto-immunes, le développement de vaccins ciblant le système immunitaire inné, et l’utilisation de la méthylation de l’ADN comme biomarqueur d’infections. / DNA methylation has historically been perceived as a highly stable epigenetic modification. However, rapid and important changes in its landscape occur in cells with higher plasticity. For example, human dendritic cells infection associated with thousands of changes of DNA methylation, majoritarily losses in enhancer regions. This demethylation is correlated with gain of active histone marks and nearby gene upregulation. The present dissertation investigated the precise role of this demethylation. Firstly, a temporal study of dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis revealed that gene expression changes and the classical immune transcription factors binding, such as members of the NF-B or AP-1 families, occurred prior to DNA methylation changes. This suggests a minimal function of demethylation in response to infection. Results from a TET2 inhibition an enzyme participating to active demethylation by converting 5-methylcytosine to intermediates were concordant with this hypothesis. Indeed, this inhibition has a very small impact on transcriptional response to an infection by Salmonella typhimurium. Nevertheless, the pro-inflammatory cytokine production of TET2-inhibited non-infected cells is higher. I therefore propose that demethylation might play a role in the return to basal state after an infection is cleared. It could also participate to innate immune memory by allowing cells to respond faster to a second infection. This phenomenon has especially been demonstrated in monocytes and macrophages but is also highlighted in dendritic cells in the present work. This dissertation opens numerous perspectives in epigenetic therapy of auto-immune diseases, the development of vaccines targeting the innate immune system and the use of DNA methylation as a biomarker.

Objective: To determine the association between smoking and occupational exposures, and DNA methylation levels in the lung cancer-related genes, AHRR and F2RL3. Methods: CARTaGENE is the largest ongoing prospective cohort study in Quebec, Canada. Currently, a nested case-control study in CARTaGENE is examining the association between AHRR and F2RL3 gene methylation and lung cancer risk (200 cases; 400 controls). Using the methylation data measured from this nested case-control study, information on participants’ smoking behavior and longest-held occupation were obtained from questionnaires. Information on smoking status and, where applicable, the average number of cigarettes smoked, duration of smoking, and time since cessation, was parameterized into a cumulative smoking index (CSI, continuous). Occupational exposures were estimated using the Canadian Job Exposure Matrix. Eighteen agents present in the occupational environment that are also found in cigarette smoke were of interest. In DNA isolated from blood samples collected at baseline, methylation ratios of 40 CpG sites in the AHRR and F2RL3 genes were measured using the Sequenom Epityper. In each gene, average methylation levels across all CpG sites were calculated and parametrized as a continuous variable. Separate least squares regression models were used to estimate the associations between smoking and occupational exposures, and AHRR and F2RL3 methylation levels while adjusting for potential confounders identified using directed acyclic graphs. Results: In both genes, smoking was associated with lower average methylation levels after adjusting for confounding factors (AHRR: -0.014 per standard deviation increase in CSI, 95% CI: -0.019, -0.010; F2RL3: -0.019 per standard deviation increase in CSI, 95% CI: -0.025, -0.012). No association was found between the selected occupational exposures and average DNA methylation levels in the two genes. Conclusion: Our findings support the hypothesis that tobacco smoking is associated with DNA hypomethylation of the AHRR and F2RL3 genes. / Objectif: Déterminer l’association entre le tabagisme et les expositions professionnelles, et les niveaux de méthylation dans les gènes AHRR et F2RL3, deux gènes impliqués dans le cancer du poumon. Méthodes : CARTaGENE est la plus grande étude de cohorte prospective au Québec, Canada. Actuellement, une étude de cas-témoin nichée dans CARTaGENE examine l’association entre la méthylation des gènes AHRR et F2RL3 et le risque de cancer du poumon (200 cas; 400 témoins). En utilisant les données de méthylation mesurées à partir de cette étude de cas-témoin nichée, les informations à propos du comportement tabagique et de l’emploi avec la plus longue durée des participants ont été obtenues à partir de questionnaires. Les informations concernant le statut tabagique, le nombre moyen de cigarettes fumées, la durée du tabagisme et le temps depuis la cessation (quand applicable) ont été paramétrées sous la forme d’un index cumulatif de tabagisme (continu). Les expositions professionnelles ont été estimées à partir de la matrice canadienne de l’exposition professionnelle. Dix-huit agents présents dans les milieux professionnels et également présents dans la fumée de tabac ont été retenus. Les ratios de méthylation de 40 sites CpG dans les gènes AHRR et F2RL3 ont été mesurés avec le Sequenom Epityper. La moyenne des ratios de méthylation de tous les sites CpG a été calculée par gène et paramétrée comme une variable continue. Des modèles séparés de régression des moindres carrés ont été utilisés pour estimer les associations entre chacun des facteurs de risque et les niveaux de méthylation des gènes AHRR et F2RL3 tout en ajustant pour des variables confondantes identifiées à l’aide de graphes acycliques dirigés. Résultats : Le tabagisme est associé avec des niveaux moyens de méthylation plus faible dans chacun des gènes après ajustement pour les variables confondantes (AHRR : -0.014 par augmentation de l’écart-type de l’index cumulatif de tabagisme, 95% IC : -0.019, -0.010; F2RL3 : -0.019 par augmentation de l’écart-type de l’index cumulatif de tabagisme, 95% IC : -0.025, -0.012). Aucune association n’a été observée entre les expositions occupationnelles sélectionnéeset les niveaux de méthylation dans ces deux gènes. Conclusion : Nos observations indiquent que le tabagisme est associé avec une hypométhylation des gènes AHRR et F2RL3.

La fumée de tabac contient la nitrosamine 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) qui serait impliquée dans la cancérogenèse pulmonaire. L'?-hydroxylation de la NNK génère deux métabolites réactifs qui mènent à la méthylation et à la pyridyloxobutylation de l'ADN, et qui peuvent être générés respectivement par la N-acétoxynitrosométhylméthylamine et par la 4-(acétoxyméthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone. Nous avons observé que la fréquence et la distribution des dommages induits à l'ADN par la méthylation et la pyridyloxobutylation au niveau des gènes p53, ras et c-jun ne sont pas identiques. La fréquence et la distribution des dommages par la méthylation de l'ADN varient avec la classe et la structure chimique des agents méthylants. La pyridyloxobutylation de l'ADN induit des cassures monocaténaires caractérisées par un groupement hydroxyle à l'extrémité 5' et par un groupement bloquant à l'extrémité 3'. La formation de dommages causée par la NNK et la fréquence élevée de dommages à certaines positions nucléotidiques qui correspondent à des positions fréquemment mutées dans le cancer pulmonaire chez le fumeur constitueraient des arguments en faveur d'un rôle de la NNK dans la cancérogenèse pulmonaire associée à la fumée de tabac.