Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les écosystèmes aquatiques se révèlent particulièrement exposés à des situations de contamination chronique par le tributylétain (TBT) et le mercure (Hg). Ces micropolluants métalliques, ubiquistes et persistants, sont présents dans l'environnement à l'état de traces, néanmoins suffisantes pour induire des implications écotoxicologiques graves. Les divers mécanismes de transformation et de transfert du TBT et du Hg, conditionnant leur dynamique biogéochimique, ont ainsi été étudiés au moyen d'outils analytiques et expérimentaux innovants et permettant une meilleure évaluation des risques. La première partie de ce travail porte sur l'étude mécanistique de la réactivité et du transfert du TBT et du Hg dans des écosystèmes aquatiques reconstitués. Ces expériences associent des techniques analytiques de spéciation performantes, basées en partie sur la quantification par dilution isotopique, à des outils expérimentaux simulant les conditions environnementales. Les cinétiques de distribution du TBT et du Hg (adsorption, bioaccumulation, biodégradation, dépuration) ont ainsi été caractérisées simultanément dans les différents compartiments des microcosmes présentant une organisation simple. Dans une seconde étape, les cinétiques de volatilisation du TBT aux interfaces naturelles ont été étudiées afin d'estimer les voies potentielles de remobilisation et d'élimination des butylétains. Enfin dans une troisième partie, des traceurs isotopiques stables du Hg ont été utilisés pour discriminer et quantifier les cinétiques couplées de méthylation et déméthylation dans des sédiments estuariens, en fonction de différents forçages environnementaux (oxygénation, activité microbienne).

Au vu de l'impact croissant du changement climatique global et en particulier de la sécheresse sur les forêts, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de réponse des arbres face à des variations de disponibilité en eau. Ces dernières années, des études ont montré un contrôle épigénétique et notamment par la méthylation de l'ADN de la plasticité phénotypique des plantes en réponse aux variations environnementales. Dans ce contexte, cette thèse visait à évaluer le rôle de la méthylation de l'ADN des cellules du méristème apical caulinaire dans la plasticité développementale de la tige feuillée en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier, un arbre modèle. A cette fin, le méthylome de la chromatine non condensée dans le méristème apical caulinaire de Populus trichocarpa a été caractérisé. Ensuite, l'impact de variations de disponibilité en eau sur la méthylation de l'ADN a été étudié dans l'apex caulinaire de différents hybrides (P. × euramericana). Les loci et les réseaux de gènes affectés pour leur expression et leur méthylation ont ainsi été identifiés. Ces travaux ont montré que dans le méristème apical caulinaire, la majorité des gènes étaient dans un état non condensé de la chromatine et méthylés dans leur corps. Ils ont également mis en évidence une forte variation de la méthylation globale de l'ADN selon les génotypes et en réponse à des variations de disponibilité en eau. De plus, des corrélations ont été établies entre les niveaux de croissance des arbres et de méthylation globale de l'ADN dans l'apex caulinaire. Enfin, les variations de la méthylation de l'ADN en réponse aux variations de la disponibilité en eau s'accompagnent de variations d'expression et ont ciblé particulièrement des gènes impliqués dans la signalisation par les phytohormones ou la morphogenèse. Ainsi, les travaux effectués lors de cette thèse suggèrent un rôle de la méthylation de l'ADN dans la plasticité phénotypique en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier via le contrôle de l'expression de réseaux de gènes dans le méristème apical caulinaire.

De par les centaines de milliers de données qui les caractérisent, les bases de données épigénétiques représentent actuellement un défi majeur. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer la performance d’outils statistiques développés pour les données de grande dimension, en explorant l’association entre facteurs alimentaires reliés au cancer du sein (CS) et méthylation de l’ADN dans la cohorte EPIC.Afin d’étudier les caractéristiques des données de méthylation, l’identification des sources systématiques de variabilité des mesures de méthylation a été effectuée par la méthode de la PC-PR2. Ainsi la performance de trois techniques de normalisation, très répandues pour corriger la part de variabilité non désirée, a été évaluée en quantifiant l’entendu de variabilité attribuée aux facteurs de laboratoire avant et après chaque méthode de correction.Une fois la méthode de normalisation la plus appropriée identifiée, la relation entre le folate, l’alcool et la méthylation de l’ADN a été analysée par le biais de trois approches : une analyse individuelle des sites CpG, une analyse de DMR et la régression fused lasso. Les deux dernières méthodes visent à identifier des régions spécifiques de l’épigénome grâce aux corrélations possibles entre les sites proches. La méthylation globale a aussi été utilisée pour étudier la relation entre méthylation et risque de CS.Grâce à une évaluation exhaustive d’outils statistiques révélant la complexité des données de méthylation de l’ADN, cette thèse offre un aperçu instructif de connaissances pour les études épigénétiques, avec une possibilité d’application de méthodologie similaire aux analyses d’autres types de données -omiques / Epigenetics data are challenging sets characterized by hundreds of thousands of features. The main objective of this thesis was to evaluate the performance of some of the existing statistical methods to handle sets of large dimension data, exploring the association between dietary factors related to breast cancer (BC) and DNA methylation within the EPIC study.In order to investigate the characteristics of epigenetics data, the identification of random and systematic sources of variability of methylation measurements was attempted, via the principal component partial R-square (PC-PR2) method. Using this technique, the performance of three popular normalization techniques to correct for unwanted sources of variability was evaluated by quantifying epigenetics variability attributed to laboratory factors before and after the application of each correction method.Once a suitable normalization procedure was identified, the association between alcohol intake, dietary folate and methylation levels was examined by means of three approaches: an analysis of individual CpG sites, of differentially methylated regions (DMRs) and using fused lasso regression. The last two methods aim at the identification of specific regions of the epigenome using the potential correlation between neighboring CpG sites. Global methylation levels were used to investigate the relationship between methylation and BC risk.By performing an exhaustive evaluation of the statistical tools used to disclose complexity of DNA methylation data, this thesis provides informative insights for studies focusing on epigenetics, with promising potentials to apply similar methodology to the analysis of other -omics data

La protéine UHRF1 est impliquée dans le maintien et la transmission des modifications épigénétiques. Lors du processus de réplication, elle recrute la méthyltransférase de l’ADN Dnmt1 au niveau des sites CpG hémi-méthylés via son domaine SRA (SET and RING Associated), favorisant la duplication des profils de méthylation. La structure tridimensionnelle du complexe SRA/ADN révèle que la protéine induit un basculement de la méthylcytosine qui permet un ancrage spécifique de la protéine sur les sites hémim éthylés, facilitant le recrutement de la Dnmt1 au niveau de ces positions stratégiques. Dans ce contexte, notre projet vise à comprendre les mécanismes d’interaction du domaine SRA de UHRF1 avec l’ADN hémi-méthylé. Des oligonucléotides doubles brins ont été marqués à la 2-aminopurine, un analogue nucléosidique fluorescent sensible à l’environnement, à différentes positions au voisinage d’un unique site de reconnaissance CpG hémi-méthylé. Les mesures de spectroscopie de fluorescence à l’état stationnaire et résolues en temps de ces duplexes liés au domaine SRA nous ont permis de caractériser de manière site spécifique les changements conformationnels induits par la liaison du domaine SRA. En accord avec la structure tridimensionnelle du complexe SRA/ADN, nos données suggèrent que le domaine SRA est capable de basculer la méthylcytosine tout en préservant la structure des autres bases dans le duplexe. Le domaine SRA semble se lier selon le même mécanisme aux duplexes hémi-méthylés, bi-méthylés et non-méthylés. La protéine UHRF1 jouerait ainsi un rôle de “lecteur“ capable de scanner la séquence d’ADN à la recherche de sites hémi-méthylés. / The UHRF1 protein plays a key role in the maintenance and transmission of epigenetic modifications. Duringthe replication process, it recruits the DNA methyltransferase Dnmt1 to hemi-methylated CpG sites via itsSRA (SET and RING Associated) domain, promoting the duplication of the methylation profiles. Thetridimensional structure of the SRA/DNA complex revealed that the protein induces a base-flipping of themethylcytosine that enables a specific anchoring of the protein to hemi-methylated sites facilitating therecruitment of Dnmt1 to this strategic position. In this context, our project was aimed to further understand themechanism of interaction of the SRA domain with hemi-methylated DNA. To this end, oligonucleotideduplexes were labeled by 2-aminopurine, a fluorescent nucleoside analogue sensitive to environment, atvarious positions close to the single hemi-methylated CpG recognition site. Steady-state and time-resolvedfluorescence spectroscopy measurements of these duplexes bound to the SRA domain enabled us to sitespecificallycharacterize the conformational changes induced by the binding of this domain. In agreement withthe tridimensional structure of the SRA/DNA complex, our data suggest that the SRA domain is able to flip themethylcytosine while preserving the structure of the surrounding bases in the duplex. The SRA domain wasshown to bind with the same mechanism to hemi-methylated, fully-methylated and non-methylated duplexes.Our data suggest the UHRF1 protein plays a role of “reader” that scans the DNA sequence for hemimethylatedsites.

La consommation répétée de drogues induit une plasticité cérébrale, qui pourrait sous-tendre le développement de la dépendance. La protéine phosphatase de type 1 (PP1) étant un acteur majeur de ces processus, nous nous sommes intéressés à sa régulation par la cocaïne. Nous avons montré qu’un traitement chronique par la cocaïne induit la répression du gène codant la sous-unitécatalytique β de PP1 (PP1Cβ), via l’hyperméthylation de sa région promotrice et le recrutement de la protéine de liaison à l’ADN méthylé, Mecp2. Cette répression, observée dans les principales structures du système de récompense du Rat, pourrait favoriser l’état phosphorylé des récepteurs NMDA et AMPA du glutamate et du facteur de transcription CREB, potentialisant ainsi les effets de la cocaïne. PP1 étant souvent considérée comme un régulateur négatif de la mémoire, sa répression pourrait également favoriser la ‘mémorisation’ du contexte et des habitudes liés à la drogue. L’expression de PP1Cβ a ensuite été analysée en réponse à des injections passives ou volontaires de cocaïne dans un test de conditionnement opérant, l’auto-administration intraveineuse. Étonnamment, une répression similaire de PP1Cβ est observée quel que soit le mode d’administration de la cocaïne. Son expression est par contre différente lorsque la cocaïne est remplacée par de la nourriture : elle est induite par le conditionnement opérant, sans être affectée par une distribution passive de nourriture. Le gène PP1Cβ participe donc sans doute aux neuroadaptations différentielles induites par les drogues et les récompenses naturelles, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives dans la compréhension des effets à long terme des drogues. / Repeated intake of drugs of abuse is known to induce brain plasticity, which may underlie the development of drug addiction. Protein phosphatase type-1 (PP1) is one of the key proteins involved in brain plasticity mechanisms. We therefore studied its regulation in response to repeated cocaine intake by rats. The gene encoding the β catalytic subunit of PP1 (PP1Cβ) was found to be repressed by chronic cocaine treatment, through a mechanism involving DNA methylation of the PP1Cβ 5’-end followed by the recruitment of the methyl binding protein Mecp2. This repression was observed in the major brain structures of the reward system and probably favors the phosphorylation state of NMDA and AMPA glutamatergic receptors and of CREB transcriptionfactor, thus further increasing cocaine effects. PP1 is also known as a negative regulator of memory formation. Its repression by cocaine may therefore potentiate the ‘memorization’ of cocaine-related habits and context. PP1Cβ expression was next compared in response to passive vs voluntary cocaine injections in an operant intravenous cocaine self-administration paradigm. Surprisingly, a similar repression of PP1Cβ was found, independently on the cocaine administration mode. A completely different pattern of expression was observed when cocaine administration was replaced by food intake, as PP1Cβ expression was increased during food operant self-administration, but not in response to passive food delivery. Taken together, our data suggest that PP1Cβ participates to the differential neuroadaptations induced by drugs of abuse and natural rewards. They shed somenew light on the long-term mechanisms induced by drugs of abuse.

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Les cancers du sein ont la particularité de développer un microenvironnement tumoral important où les fibroblastes associés au cancer (CAF) jouent un rôle crucial dans la tumorigénèse via la sécrétion de différents facteurs de croissance, cytokines, protéases et composants de la matrice extracellulaire. Ces différents facteurs secrétés par les CAFs sont impliqués dans de nombreuses voies de signalisation suggérant que la reprogrammation des cellules cancéreuses par les CAFs peut affecter de nombreux gènes.Le séquençage des ARN messagers (RNAseq) de lignées cellulaires de cancer du sein cultivées en présence de milieux conditionnés de CAF, nous a permis d'identifier 372 gènes surexprimés in vitro par les facteurs sécrétés par les CAF et in vivo selon la teneur en cellules stromales des tumeurs mammaires. De façon inattendue, nous avons pu constater que les facteurs sécrétés par les CAF ainsi que le contenu en cellules stromales des tumeurs n'induisent pas de changements significatifs de méthylation de l'ADN mais activent de manière spécifique des gènes caractérisés par une signature méthylation. Différentes approches expérimentales, telles que l'inhibition de la méthylation de l'ADN, l'inhibition de l'expression de la protéine MBD2 (protéines de liaison à l'ADN méthylé) et des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) ont permis de montrer l'implication de ces marques de méthylation et des protéines de liaison à l'ADN méthylé dans la réponse des cellules cancéreuses aux facteurs sécrétés par les CAFs. Ces résultats ont permis l'identification d'événements moléculaires impliqués dans la réponse des cellules tumorales aux signaux sécrétés par les cellules stromales dans les tumeurs mammaires mettant en lumière l'importance des marques épigénétiques dans la reprogrammation des cellules cancéreuses induites par les cellules stromales / Breast cancers develop in complex tissue environments where cancer associated fibroblasts (CAF) play a crucial role in tumorigenesis by secreting various growth factors, cytokines, proteases and extracellular matrix components. Soluble factors secreted by CAFs are involved in many pathways including inflammation, metabolism, proliferation, and epigenetic modulation suggesting that CAF-dependent reprograming of cancer cells affects a large set of genes. From RNAseq data obtained from breast cancer cell lines grown in presence of CAF-secreted factors, we identified 372 upregulated genes exhibiting an expression level positively correlated with the stromal content of breast cancer specimens. Furthermore, we observed that gene expression changes were not mediated through significant DNA methylation changes. Nevertheless CAF-secreted factors but also stromal content of the tumors remarkably activated specific genes characterized by a DNA methylation signature: hypermethylation at transcription start site (TSS) and shore regions. Experimental approaches (inhibition of DNA methylation, knockdown of MBD2, and ChIP assays) demonstrated the implication of DNA methylation and methyl DNA binding protein in the response of cancers cells to CAF-secreted factors. These data put in light the importance of epigenetics marks in the cancer cell reprogramming induced by stromal cell and indicate that the interpreters of the DNA methylation signal play a major role in the response of the cancer cells to the microenvironment

La Bruton tyrosine kinase ou Btk est une protéine dont le rôle dans la maturation des lymphocytes B est connu depuis plusieurs années. Par contre, son rôle dans le contrôle de l’immunité innée est moins établi. Nous avons montré que, en réponse à la voie des Toll like Receptors ou TLRs, Btk régule la stabilité de l’ARN messager du TNF-α par l’intermédiairede la protéine TTP ou Tristétraproline. Par ailleurs, nous avons montré que l’expression d’un microARN, le miR-346, régulait négativement la protéine Btk et donc la synthèse de TNF-α. L’amplification de l’expression de ce miR-346 par transfection permet d’avoir un effet anti-TNF-α et anti-Btk interessant notamment dans le modèle cellulaire de la polyarthrite rhumatoïde. Enfin, nous avons montré que, en réponse au TLRs, la modulation de l’expression du TNF-α en fonction de l’état de méthylation de l’ADN et d’acétylation des histones dépendait directement de l’expression du couple miR-346 et Btk. Btk est donc une protéine charnière dans le contrôle de l’inflammation par les mécanismes épigénétiques que sont les miARNs, la méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones. Sur le plan thérapeutique, l’inhibition de cette protéine par ces différents mécanismes de régulation semble donc être très interessante, à la fois dans les maladies inflammatoires et néoplasiques. / Bruton tyrosine kinase, or Btk, is a protein whose role in the maturation of B cells has been known for several years. However, its role in the control of innate immunity is less established. We have shown that, in response to Toll like Receptors pathway or TLRs, Btk regulates the stability of the mRNA of TNF-α via the TTP or Tristetraprolin protein. Furthermore, we showed that the expression of microRNA, the miR-346, negatively regulated the Btk protein and thus the synthesis of TNF-α. Upregulation of miR-346 by transfection act as an anti-TNF-α and anti-Btk drugs, especially in the cellular model of rheumatoid arthritis.Finally, we showed that, in response to TLRs, the modulation of the expression of TNF-α according to the state of DNA methylation and histone acetylation depended directly on crosstalk beetween miR-346 and Btk. Btk is a key protein in the control of inflammation by epigenetic mechanisms such as miRNAs, DNA methylation and histone acetylation. As therapeutic interest, inhibition of Btk by those different regulatory mechanisms seems to be very interesting, both in inflammatory and neoplastic diseases.

Les tauopathies sont des maladies neurodégénératives caractérisées par l’agrégation intracérébrale de protéines tau anormales. Cependant ces maladies sont très hétérogènes sur le plan clinique, anatomopathologique mais aussi biochimique avec l'agrégation de différentes isoformes de protéines tau. De nombreux axes de recherche existent à ce jour afin de mieux comprendre ces maladies incurables. Au cours de cette thèse d'université, nous avons étudié les modifications de l’épigénome qui constituent une piste nouvelle et très prometteuse dans la recherche sur les maladies neurodégénératives. L'épigénétique est un processus dynamique et réversible qui peut être modifié par de nombreux facteurs génétiques ou environnementaux et qui joue un rôle très important dans la régulation des gènes. De nombreuses études rapportent une association entre certaines marques épigénétiques et les maladies neurodégénératives. Par exemple, dans la maladie d’Alzheimer, il a été observé une hyperméthylation de l'ADN, au niveau du promoteur du gène MAPT qui code les protéines tau.Dans ce contexte, nos objectifs étaient de déterminer si des variations de l'épigénome impliquant le gène MAPT contribuent à l'expression différentielle des protéines tau qui est observée dans les différentes classes de tauopathies. Nous avons donc constitué et caractérisé une banque de prélèvements cérébraux de témoins et de patients atteints de différentes tauopathies. Puis nous avons analysé la méthylation de l'ADN dans 3 tauopathies : la maladie d'Alzheimer, la paralysie supranucléaire progressive et la DCB. Notre étude a permis de mettre en évidence chez les patients atteints de PSP une hypométhylation dans l’inton 0 du gène MAPT. Cette hypométhylation ne concernait que le cortex frontal, affecté par la pathologie tau, mais pas le cortex occipital qui est épargné par la pathologie tau. De plus, nous avons également mis en évidence dans le tissu cérébral des patients atteints de PSP une hyperexpression des ARNm de MAPT par rapport aux témoins. Nous démontrons avec ce travail que l’hypométhylation de l'ADN de l’intron 0 de MAPT constitue une signature épigénétique spécifique de la PSP. Cette première étude nous a conduits à suspecter l'existence d'un promoteur alternatif du gène MAPT situé dans cette région de l'intron 0. Nous avons donc testé in vitro l'activité de ce promoteur et cloné des transcrits issu de ce promoteur alternatif. Nous avons ensuite confirmé ces analyses par la mesure de l'expression des ARNm par qPCR. Au total, ces expériences prouvent l'existence et la fonctionnalité de ce promoteur alternatif dans le cerveau humain. De plus, l'activation de ce promoteur alternatif aboutit à la transcription d'ARNm plus courts codant pour de nouvelles protéines tau qui pourraient être impliquées dans la survenue des tauopathies. / Tauopathies are neurodegenerative diseases characterized by intracerebral aggregation of abnormal tau proteins. However, these diseases are heterogeneous clinically, pathologically but also biochemically with the aggregation of different isoforms of tau protein. Many lines of research exist to date to better understand these incurable diseases. During this university thesis, we studied the changes in the epigenome that constitute a new and very promising approach in research on neurodegenerative diseases. Epigenetics is a dynamic and reversible process which can be modified by numerous genetic or environmental factors and plays a very important role in gene regulation. Many studies report an association between some epigenetic marks and neurodegenerative diseases. For example, in Alzheimer\'s disease, it has been observed hypermethylation of DNA in the promoter of the MAPT gene which encodes the tau protein.In this context, our objective was to determine if changes in epigenomic involving MAPT gene contribute to the differential expression of tau protein which is observed in the different classes of tauopathies. So we have established and characterized a human brainbank of controls and patients with different tauopathies. Then we analyzed the DNA methylation in 3 tauopathies: Alzheimer\'s disease, progressive supranuclear palsy, and CBD. Our study highlighted in PSP patients hypomethylation in intron 0 of MAPT gene. This hypomethylation concerned only the frontal cortex, affected by the tau-pathology but not the occipital cortex which is spared by tau-pathology. In addition, we also shown in the brain tissue of patients with PSP an overexpression of mRNA of MAPT compared to controls. We demonstrate in this work that hypomethylation of DNA in intron 0 of MAPT is a specific epigenetic signature of PSP. This first study has led us to suspect the existence of an alternative promoter of the MAPT gene located in this region of intron 0. We tested the in vitro activity of this promoter and cloned transcripts derived from this alternative promoter. We then confirmed this analysis by measuring mRNA expression by qPCR. In total, these experiments prove the existence and the functionality of this alternative promoter in the human brain. Furthermore, activation of the alternative promoter results in shorter mRNA transcripts encoding novel tau proteins that might be involved in the onset of the tauopathies.