Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós Graduação em Química / Made available in DSpace on 2012-10-26T11:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 300459.pdf: 2794811 bytes, checksum: 737d06e08690153cb15eee8a4bb3c737 (MD5) / Melanina é um pigmento natural que é produzido a partir da oxidação da tirosina sob ação de enzimas. É um oligômero de grande importância, com inúmeras aplicações e, além disso, exibe uma grande afinidade por íons metálicos que induzem a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) nos melanócitos, em sistemas vivos. Sendo assim uma grande arma contra células com melanomas. Neste trabalho, foram extraídas melaninas naturais do cabelo negro (eumelaninas) pelo método enzimático de Prota com pequenas modificações e caracterizadas por diferentes métodos pectroscópicos e eletroquímicos. Em seqüência, foi realizado o estudo das interações com o íon Fe(III) em solução aquosa, por titulação potenciométrica, que nos revelou que em pH biológico, a interação majoritária é [Fe(Cat)(Qi)(OH)]-. Também foram obtidos sólidos Fe(III)-(eumelanina) isolados em três valores de pH diferentes e submetidos a análise de espectroscopia de IV e EPR que mostraram a coordenação do íon Fe(III) por esses mesmos grupamentos em estado sólido. Por fim foi realizado o estudo preliminar das interações do Fe(III) com as eumelaninas mediada por ácido gálico, um ligante de baixa toxidade que foi estudado com o objetivo de carrear o centro metálico para as melaninas, em solução a espécie majoritária em pH biológico é [Fe(Qi)(AG)]+ que compete com a espécie [Fe(Qi)(Cat)], mostrando que o ácido galico pode liberar o centro de Fe(III) para a melanina / Natural melanins extracted from hair (eumelanin) were characterized by elemental analysis, infrared spectroscopy, electronic microscopy # field emission gun, electron paramagnetic resonance and the redox systems were elucidate by electrochemistry technique. The acid/base and complexation equilibria of eumelanin in the absence and the presence of Fe(III) ion were characterized by potentiometric titrations. The pKa#s are: 4.35, 6.30, 10.50 e 12.81; corresponding to the: carboxylic, quinineimine and catechol groups, respectively. The constants of the detected interactions with Fe(III) ion are: log([Fe(Ac)2+]/[Fe3+][Ac-]) = 5.73 , log([Fe(Qi)2+]/[Fe3+][Qi-]) = 5.20 , log([Fe(Cat)(OH)/[Fe3+][Cat2-][OH-]) = 23.53 , log([Fe(Cat)(Qi) (OH)]/[Fe(Cat)(OH)][Qi-]) = 5.66 , log([Fe(Cat)(Qi)(OH)2]2-[H+]/Fe(Cat)(Qi)(OH-)] = -8.89 e log([Fe(Cat)2(OH)2 3-]/[Fe3+][Cat2-]2[OH-]2= 18.20. Theoretical calculations was employed with one, two and tree water molecules coordinated to the metal center in an octahedral configuration. The results are in good agreement with the species detected by potentiometric titration. In the ternary system, two kinds of interactions with iron(III) were detected, involving groups of eumelanin and gallic acid: log([Fe(Ac)(AG)+]/[Fe3+][Ac-][AG-]) = 4,60 ; log([Fe(Qi)(AG)+]/[Fe3+] [Qi)(AG)]) = 8,09. The distribution species curves show that gallic acid can be utilized to carry the iron(III) ion to eumelanin. The ternary species were elucidated in solid state (acid pH values) by IR and EPR

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:52:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 303750.pdf: 2060621 bytes, checksum: ee1b2d096083e28dfeb39421d30a6e79 (MD5) / A pesquisa científica sobre o câncer mostra que a tumorigênese é um processo multifatorial, onde cada evento é o resultado de alterações genéticas e epigenéticas que conduzem as células a uma transformação progressiva, convertendo-as de um padrão de linhagem normal em derivados celulares malignizados. Os produtos naturais de origem vegetal têm sido investigados em função de suas propriedades biológicas, nutricionais e farmacológicas. O conhecimento da biologia e das relações existentes entre determinados metabólitos obtidos de espécies vegetais, e a profilaxia ou terapêutica de doenças, refletem em melhorias na qualidade de vida. Estudos prévios sobre as atividades biológicas de carotenóides e polifenóis obtidos de tecidos de milho, espécie Zea mays, demonstraram a ocorrência de inibição do crescimento tumoral e estímulo à função imune, além de inibição da proliferação celular e indução de apoptose. O presente estudo in vitro avaliou a potencial ação antitumoral de extratos carotenoídico (ECa) e polifenólico (EPf) derivados de folhas de Z. mays da variedade crioula Rajado 8 Carreiras. A cromatografia líquida de alta eficiência revelou a presença de luteína e ácido clorogênico como compostos majoritários de EC e EPf, respectivamente. Foram avaliados a citotoxicidade dos extratos foliares ECa e EPf e dos compostos puros ?-caroteno (?C), luteína (Lut), ácido gálico (AG), ácido cafeico (AC) e ácido ferúlico (AF) sobre quatro linhagens neoplásicas e uma linhagem não-neoplásica. Além disso foram avaliados os efeitos de ambos os extratos e de compostos puros sobre a morfologia, proliferação e adesão de células da linhagem B16F10. Ambos os extratos e os compostos puros, com exceção do AF, reduziram a viabilidade (método colorimétrico do MTT) de todas as linhagens de células tumorais sob estudo. No entanto, a única linhagem não-neoplásica, de fibroblasto de camundongo (L929), foi a menos susceptível, tendo, inclusive, apresentado um aumento (ao invés de redução) de 10% na viabilidade celular no grupo tratado com Lut (0,5 µg/mL). Além disso, ambos os extratos e os compostos ?C, e Lut (principalmente) causaram efeito citotóxico tempo-dependente (12 - 48 h) sobre a linhagem celular B16F10. Os ECa e EPf (5 µg/mL) também produziram alterações na morfologia (diminuição do espraiamento) e, após 24 h de exposição, induziram morte apoptótica nas células dessa linhagem. Os resultados do ensaio de BrdU mostraram que ECa e EPf (5 µg/mL, 24h) não inibiram a proliferação celular. Em um ensaio complementar, confirmou-se que ambos os extratos bloquearam a proliferação celular em até 99,5%; quantificada com base na capacidade de formar colônias (ensaio de clonogenicidade). Os ensaios de imunocitoquímica para detecção de actina e vinculina mostrou ocorrência de alterações nessas microestruturas evidenciadas pela distribuição dos pontos de adesão das células B16F10 expostas aos extratos (ECa e EPf). Com estes resultados sugere-se que os extratos de carotenóides e de polifenóis sob estudo teriam promovido alterações na estrutura do citoesqueleto (refletidas na morfologia celular), mais do que efeitos específicos nos mecanismos de viabilidade, migração e proliferação celular, os quais seriam uma consequência daquelas alterações. / The scientific research about cancer shows that the tumorigenesis is a multifactorial process, where each event is the result of genetics and epigenetic alterations that conduct the cells to a progressive transformation, converting them from a pattern of normal line to maligned cell derivatives. The natural products have been investigated because of their biological, nutritional and pharmacological properties. The knowledge of the biology and the existing relations between determined metabolites obtained from vegetal species and the prophylaxy or therapy of diseases, reflect in life quality improvement. Previous studies on the biological activities of carotenoids and polyphenols obtained from maize tissues, species Zea mays, demonstrate occurrence of tumor growth inhibition and stimulation of the immune function, beyond the inhibition of cell proliferation and apoptosis induction. This study in vitro evaluated the potential antitumoral action of carotenoidic (ECa) and polyphenolic (EPf) extracts derived from leaves of Z. mays of the creole mayze variety Brindle 8 Careers. The high performance liquid chromatography revealed that lutein and chlorogenic acid were the major compounds of the ECa and EPf, respectively. It was evaluated the cytotoxicity of the extracts ECa and EPf and the pure compounds â-carotene (âC), lutein (Lut), gallic acid (AG), caffeic acid (AC) and ferulic acid (AF) assaying four neoplastic cell lineages and also a non-neoplastic cell line. Besides, the effects of treatment with the extracts and some pure compounds were evaluated on the morphology, proliferation and adhesion of the B16F10 cell line. Both the extracts and pure compounds, with the exception of AF decreased the viability (MTT colorimetric method) in all the cell lineages under study. However, the only cell line non-neoplastic (mice fibroblasts; L929 cells) was the less susceptible, showing an 10 % increase (instead of increasing) in the viability of the cell group treated by Lut (0.5 ìg/mL). Moreover, both the extracts and the pure compounds âC, AG and Lut (mainly) caused time-dependent cytotoxic effects (12 - 48h) in the B16F10 cell line. Eca and EPf (5 ìg/mL) also afforded morphological alterations (spreading decrease) and, after 24 h of exposure, those extracts induced apoptotic death in the B16F10 cells. The results attained by means of the BrdU assay show that ECa and EPf (5 ìg/mL, 24h) did not inhibit cell proliferation. By means of a complementary assay based in the cell capacity to form colonies (clonogenicity), we demonstrated that both the extracts blocked (until 99.5%) the cell proliferation. With these findings we suggest that the extracts of carotenoids and polyphenols under study possibly promoted alteration in the cytoskeleton structure (reflected in the cell morphology) rather than the specific effects in the mechanisms of survival, migration and cell proliferation, which would be a consequence from those alterations.

Melanoma is the most lethal type of skin cancer with over 132,000 cases occurring globally each year and continually rising incidence. BRAFV600E inhibitors have led to clinically significant improvements in outcomes for melanoma patients, yet many patients with metastatic melanoma rapidly succumb to the disease due to eventual chemoresistance or insensitivity to the drug. Thus, it is critical to identify new therapies that can act alone, or be combined with available treatments for enhanced efficacy and/or to overcome drug resistance. Evidence from human melanoma indicates that the melanocyte lineage is critical for melanoma survival and contributes to therapeutic resistance. MITF is a highly conserved “master melanocyte transcription factor” with a complex role in melanoma. Our lab has previously developed a temperature sensitive BRAFV600E mitfavc7 zebrafish melanoma model carrying a human oncogene and mitfavc7 splice site mutation that enables the conditional control of its endogenous activity by changes to water temperature. As part of my PhD project, I characterized and compared two new models developed since then: a very aggressive BRAFV600E mitfavc7p53M214K melanoma model with three driving mutations and a slower developing BRAF-independent mitfavc7p53M214K. I showed that the MITF activity is crucial for melanocyte survival in both models and that both mutated BRAF and p53 deficiency are oncogenic with low levels of MITF, and result in fish nevi and melanoma resembling the pathology of human disease. Both models are also relevant to a low-MITF subclass of human melanomas that emerged from a recent classification by The Cancer Genome Atlas Network. In addition, I established that, similarly to the BRAFV600Emitfavc7, complete inhibition of MITF activity leads to rapid tumour regression, but once its activity is restored the melanomas recur at the same site as the original tumour. I used histopathology studies and melanocyte lineage transgenes to identify and visualize subpopulations of cells remaining at the site of regression in these new zebrafish melanoma models. I hypothesised that these are the cells of origin for tumour recurrence (melanoma stem or progenitor cells), showed that some of them express a cancer stem cell marker aldehyde dehydrogenase, and attempted to target these subpopulations using 5-nitrofurans (a prodrug NFN1, shown previously by our lab to target ALDHhigh subpopulations in context of melanoma) in fish after melanoma regression. Finally, I also developed and described a new primary zebrafish melanoma cell line that I derived from one of these zebrafish tumours. This study is still in progress, but the cell line will be a useful tool for further investigation of these proposed melanoma progenitor cells in vitro, with potential applications for lineage tracing and transplantations.

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Orientador : Prof. Dr. Guilherme L. Sassaki / Co-orientadores : Profª. Drª. Sheila Maria B. Winnischofer, Dr. Lauro Mera de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/02/2013 / Inclui referências / Resumo: Biomarcadores capazes de diferenciar células tumorigênicas de não tumorigênicas são importantes, mas ainda existem em quantidades restritivas. Neste estudo, análises de RMN 2D do tipo HSQC-ed forneceram fingerprints dos extratos lipídicos obtidos de linhagens de melanoma humano, representando diferentes estágios de tumorigênese (RGP, VGP e MET), e linhagens de melanócitos e de melanoma de origem murina. Em relação às linhagens murinas, técnicas de análise multivariada demonstraram que o uso de agentes mitogênicos, como ésteres de forbol, podem influenciar significativamente o perfil lipidômico da linhagem de melanócitos, tornando-o mais semelhante ao perfil de linhagens de células mais proliferativas. Extratos aquosos também foram estudados e os metabólitos que mais influenciaram na discriminação entre as linhagens foram quantificados, esses dados, em conjunto com os obtidos da fração lipídica, permitiram caracterizar o metaboloma destas linhagens. A composição de ácidos graxos das linhagens celulares, analisada por GC-MS, foi diferenciada principalmente pelas proporções de ácidos graxos C14:0 e C16:0, em maior quantidade na linhagem de melanoma murino, e C18:1, presente em maior proporção na linhagem de melanócitos murina. Porém, a diferenciação das linhagens foi fortemente influenciada pelos metabólitos de baixo peso molecular creatina e creatinina. Análises de expressão gênica confirmaram que a via bioquímica deste metabólito está alterada entre as linhagens celulares. O lipidoma das linhagens de melanoma humano revelou que os ácidos graxos C14:0, C16:1, C18:0 e C20:4 aumentaram sua proporção nas linhagens com maior potencial tumorigênico (VGP e MET). Análises de GC-MS e de componentes principais apontaram derivados de inositol como os principais contribuintes para a diferenciação das linhagens, e análises de RMN 2D confirmaram que os níveis de lipídeos da classe dos fosfatidilinositóis possuem uma relação direta com o potencial tumorigênico das 3 linhagens de células de melanoma humanas analisadas. Os resultados demonstram que perfis lipidômicos podem ser utilizados para diferenciar linhagens de melanócitos de melanoma e também linhagens de melanomas em diferentes estágios de progressão do tumor, e a combinação das técnicas desenvolvidas pode fornecer novos métodos de diagnóstico e classificação deste carcinoma. / Abstract: Biomarkers that discriminate tumorigenic from normal cells are important but limited. In the present study, 2D HSQC-ed NMR lipid maps from human melanoma cell lines, having distinct tumorigenic potential (RGP, VGP and MET) and mouse melanocytes and melanoma cell lines were obtained. Regarding the mouse cell lines, we revealed through principal component analysis that the use of mitogenic agents, such as phorbol esters, can markedly influence the lipid profile of the melanocyte cell line, resembling the pattern of the most proliferative cell lines. Aqueous extracts were also characterized, and the metabolites that most indicated discrimination between the cell lines were quantified, allowing to characterize the metabolomic profile of the cell lines. The cell lines had different fatty acid compositions, as confirmed through GC-MS analysis, the melanocyte containing a lower proportion of C14:0 and C16:0, the opposite occurring with C18:1, when compared with the melanoma cell line, but the differentiation was mostly influenced to small-molecule metabolites: creatine and creatinine. Gene expression analysis confirmed that the synthetic pathway of these metabolites was altered between the cell lines. The human melanoma lipidome showed a fatty acid composition with C14:0, C16:1, C18:0 and C20:4 having a higher proportion on the VGP and MET cell lines than in RGP. Multivariate and GC-MS analysis pointed out inositol derivatives as main contributors to the differentiation of the cells, and 2D NMR analysis established that the levels of phosphoinositol derivatives are related to the carcinogenic stage of the 3 cell lines. These results demonstrate that lipidomic profiles were capable to discriminate melanocytes from melanoma cells and even melanomas on distinct tumorigenic stages. The combination of the applied techniques could be an efficient and convenient tool for early diagnosis and screening of melanoma disease.

Orientadora : Profª. Drª. Andrea Senff Ribeiro / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2017 / Inclui referências : f. 73-83 / Resumo: O tumor do tipo melanoma da pele apresenta baixa incidência contudo, sua letalidade é extremamente elevada. As linhagens B16 constituem um modelo de melanoma murino muito útil na oncologia experimental. A linhagem B16F10 apresenta alta capacidade de invasão e metastização enquanto que a linhagem B16-F1 apresenta menor motilidade in vitro e, portanto, baixo potencial metastático. A TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) é expressa em diversos organismos e tecidos, o que aponta um papel biológico fundamental. Diferentes estudos já estabeleceram seu envolvimento na regulação do ciclo e proliferação celular, bem como na malignidade e como fator protetor contra estresse e apoptose. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da TCTP em melanoma murino (B16F1 e B16F10). O perfil proteico bidimensional apresentado pelas linhagens foi diferente: a linhagem B16-F10 apresentou 201 spots e a linhagem B16-F1 126 spots. Essa diferença pode estar relacionada à complexidade celular da B16-F10, mais maligna e metastática. Em ambos os extratos foi identificada uma proteína com mobilidade eletroforética de 20 kDa e pI de 4,8 (valores esperados para TCTP). Além disso, a TCTP foi imunodetectada por western blotting. A linhagem B16- F1 apresentou um menor sinal de detecção quando comparada à B16-F10., Essa diferença poderia estar associada a uma maior expressão de TCTP em células tumorais mais metastáticas e invasivas e, consequentemente, a B16F10 apresentaria níveis superiores de TCTP. Esta hipótese foi confirmada por PCR em tempo real: B16-F10 apresentou níveis de RNAm para TCTP superiores aos encontrados para B16-F1. Esses dados corroboram com os resultados do western blotting e com dados da literatura que relacionam a TCTP à linhagens malignas, devido ao seu papel anti-apoptótico e seu antagonismo com a p53. A fim de avaliar o papel biológico da TCTP no melanoma, esta foi silenciada na linhagem B16-F10, utilizando a técnica de RNAi. O silenciamento diminuiu os níveis de TCTP em 50 a 70% quando utilizado 50 nM e 60 a 80% quando utilizado 100 nM do duplex após 24, 48 e 72 horas de transfecção. As linhagens transfectadas com RNAi para TCTP apresentaram menor proliferação, menor migração e maior adesão celular às moléculas da matriz extracelular quando comparadas às linhagens transfectadas com o controle negativo. Porém, não houve qualquer alteração significativa da viabilidade celular. O aumento da proliferação celular e do potencial migratório são dois eventos muito importantes para a tumorigênese, e estão intimamente relacionados à malignidade. Portanto, o silenciamento foi capaz de regredir o fenótipo de malignidade da linhagem B16-F10, deixando esse mais próximo da B16-F1. Dessa forma, nosso estudo caracterizou os perfis celulares das duas linhagens e demonstrou uma diferença no número de proteínas e parceiros moleculares entre ambas linhagens. Além disso, nossos dados sugerem que o silenciamento da TCTP tornou a linhagem B16-F10 menos metastática e maligna, com um fenótipo mais próximo ao de uma célula normal. Mais estudos são necessários com o intuito de identificar possíveis parceiros e melhor entender o papel dessa proteína multifuncional no melanoma murino. Palavras-chave: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, câncer / Abstract: Skin melanoma tumor displays low incidence, however, its lethality is extremely high. B16 cell lines typify a murine melanoma model very useful on the experimental oncology field. B16-F10 cell line exhibits high invasion and metastization capacities while B16-F1 cell line depicts lower in vitro motility and, therefore, low metastasis potential. TCTP (translationally controlled tumor protein) is expressed in several organisms and tissues, which suggests a fundamental biological role. Different studies have already settled its participation in cell cycle regulation and cell proliferation, as well as in malignancy and as a protective factor against stress and apoptosis. Thus, this study aimed to assess the TCTP role in in murine melanoma (B16-F1 and B16- F10). Two-dimensional electrophoresis profiles of proteins from the two cell lines were different: B16-F10 cells presented 201 electrophoresis spots while B16-F1 originated 126 spots. This difference may be related to the B16-F10 cell complexity, since this cell line is more malignant and metastatic. In both cell extracts was identified a protein with electrophoretic mobility about 20 kDa and deduced pI of 4.8 (expected parameters for TCTP). Furthermore, TCTP was immunodetected by western blotting analysis. B16-F1 cells produced low detection signals when compared to the B16-F10 cells. This difference may be associated to the higher TCTP expression in more metastatic and invasive tumoral cells and, consequently, B16-F10 would present higher TCTP levels. This hypothesis was confirmed by Real-Time PCR, since B16-F10 revealed RNAm levels for TCTP higher than the B16-F1. These data corroborate with western blotting results and the specific literature, which connect TCTP and malignant cell lines due to the anti-apoptotic function and its p53 antagonism. In order to evaluate the biological role of TCTP in melanoma, it was performed the TCTP silencing in B16-F10 cell line by using RNA interference (RNAi) method. The gene silencing reduced TCTP levels in 50% to 70% when used 50 nM and 60% to 80% when used 100 nm of the duplex after 24, 48 and 72 hours of transfection. The transfected cell lines with RNAi for TCTP presented lower proliferation, lower migration and higher cell adhesion to extracellular matrix molecules when compared to the cell lines transfected with negative control. However, there was no significant change in cell viability. Increasing cell proliferation and migration potential are two events very important for the tumorigenesis process and they are closely related to the malignancy. Therefore, gene silencing was able to recede the malignant phenotype of B16- F10 cell line, resulting in a similar aspect to the B16-F1 cells. Thus, this study characterized the profile of two cell lines and it demonstrated differences in protein number and molecular partners between these two cell lines. Moreover, the generated data suggest that TCTP gene silencing became B16-F10 cells less metastatic and malignant, resembling the normal cell phenotype. Further studies are necessary in order to identify possible partners and to better understand the TCTP role in the murine melanoma. Key-words: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, cancer.

Memoria para optar el título de Bioquímico / En Chile, la tasa de mortalidad por enfermedades oncológicas ha ido aumentando año a año, siendo las cifras cada vez más preocupantes. Es por eso, que cualquier aporte que pueda hacerse en este ámbito puede ser fundamental para combatir el cáncer. Uno de los frentes de lucha dentro de la ciencia es la Inmunología, que, mediante la comprensión de los procesos de defensa del cuerpo contra distintos patógenos o agentes causales de enfermedades, estudia como contrarrestar los mecanismos tumorales de evasión inmune. Dentro del Sistema Inmune (SI) una función fundamental la cumplen las células Natural Killers (NK), componentes principales de la respuesta inmune innata antitumoral. Distintos tumores han desarrollado estrategias para evadir esta respuesta. En este contexto, NKG2D representa uno de los receptores más importantes en la inducción de la respuesta de citotoxicidad por parte de NK humanas. Los principales ligandos de NKG2D humano, NKG2DL, son moléculas no clásicas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I, MICA y MICB, que corresponden a la cadena relacionada al MHC clase I (MIC), y se expresan en la superficie de tumores, células infectadas por virus y estresadas. Pese a la existencia de estos ligandos en la superficie del tumor, que alertan al SI de la existencia de éste, existen mecanismos oncológicos con los cuales se logra evadir la inmunovigilancia. Son varias las formas por las que ocurre este proceso. Se ha descrito la participación de citoquinas que estarían disminuyendo la expresión de los NKG2DL en la superficie, o metalopreoteasas que los cortarían liberándolos al medio, procesos que tendrían una relación directa con la disminución del ataque de las células NK al tumor. Al respecto, en nuestro laboratorio hemos detectado que IL-10 disminuye la expresión de MICA en la superficie de las células de melanoma. Además, creemos que otra forma por la cual el tumor podría estar evadiendo la inmunovigilancia por parte de las células NK, sería a través de la retención de los NKG2DL en el interior de la célula tumoral blanco. Al respecto creemos que una candidata a estar involucrada en el proceso es Calreticulina (Crt), que forma parte del complejo de proteínas chaperonas, Calnexina-Calreticulina-ERp57, involucradas en el procesamiento de las moléculas MHC-I. Crt es una molécula chaperona del Retículo Endopasmático (RE) presente en todas las células del organismo, y cuya función fundamental es unir Calcio y participar en el procesamiento de glicoproteínas. Se ha visto que la sobreexpresión de esta regula negativamente la expresión y capacidad funcional en superficie de algunas proteínas de membrana. Por ende, bajo la luz de los antecedentes, nuestro objetivo es determinar, en líneas celulares de melanoma, si Crt retiene o altera la expresión de MICA y MICB, y si esto es influenciado de alguna forma por IL-10, como mecanismo de evasión de la inmunovigilancia de las células NK. Para estudiar esto, en primer lugar, realizamos ensayos de Microscopía Confocal (MC) con el fin de estudiar en células de melanoma la distribución de los ligandos MICA y MICB, y su relación con Crt, además de ver si su comportamiento era o no influenciado por IL-10. Posteriormente, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación (IP) para verificar si existía una interacción directa de Crt con MICA y MICB. Finalmente, y con el fin de estudiar si Crt tenía alguna incidencia en la expresión de MICA y MICB en la superficie de las células, se realizó una mutagénesis sitiodirigida a Vasostatina, fragmento N-terminal de Crt que cumple la función de chaperona, de forma que no pudiese interactuar con ligandos, además de, en forma paralela, sobreexpresarla. Los productos resultantes fueron clonados y expresados en células HEK. Para detectar si existía alguna variación en el patrón de expresión superficial de MICA y MICB en las células, producto de la mutación o sobreexpresión de Vasostatina, se realizó un ensayo de Citometría de Flujo (CF), además de un ensayo de Western Blot (WB) para ver si era posible detectar Vasostatina sobreexpresada en las células a nivel proteico. En nuestros resultados logramos observar que MICA y MICB se co-expresan frecuentemente en líneas celulares de melanoma, detectándose compartimentalizados en el interior del citoplasma, RE, además de observarse su presencia en el núcleo. Mediante IP observamos que MICA y MICB tienen un patrón de migración de doble banda, además de una tercera banda de mucho menor tamaño, cuando se revela con anticuerpo específico. Lo anterior indicaría que MIC soluble se podría estar generando en el interior de la célula, en forma complementaria a su liberación desde la superficie celular por efecto de metaloproteasas. Por su parte, por IF, observamos que Crt colocaliza con MICA y MICB, en el interior de las células de melanoma, lo cual también se produce en el núcleo. Además, por IP, vimos que Crt que inmunoprecipita con MICA, solamente en la banda que corresponde a la segunda de menor peso molecular. Por otro lado, mediante IF no logramos detectar que IL-10 afectase la distribución citoplasmática de MICA y MICB. Finalmente, al sobreexpresar y mutar Vasostatina no logramos apreciar algún efecto importante sobre el nivel de expresión de MICA y MICB en la superficie de las células HEK. Como conclusión podemos decir que MICA y MICB se encuentran agrupados en el interior de las células de melanoma y que interactúan con Crt, requiriéndose estudios posteriores a fin de determinar si esto constituye o no un mecanismo de evasión de la inmunovigilancia de las células NK

Resumo não disponível.

Orientador: Ana Gabriela Sávio / Coorientador: Vandereli Salvador Bagnato / Banca: José Dirceu Vollet Filho / Banca: Luciana Patricia Fernandes Abbade / Resumo: O câncer de pele é uma neoplasia que vem aumentando no Brasil e no mundo. Dentre eles está o melanoma, que embora represente apenas 4% dos cânceres de pele é responsável por 60% das mortes por esta neoplasia. Existem grandes dificuldades na triagem do melanoma, pois um de seus diagnósticos diferenciais é a queratose seborreica pigmentada. Tal fato causa grande dificuldade para o diagnóstico dos médicos não especialistas. O objetivo deste estudo foi identificar os padrões de autofluorescência de lesões de pele para que se possa excluir o diagnóstico de melanoma em lesões enegrecidas. Participaram 31 pacientes, com 31 lesões enegrecidas, sendo 17 pacientes com diagnóstico de melanoma e 14 pacientes com queratose seborreica pigmentada. Cada lesão enegrecida foi avaliada, sendo realizada foto macroscópica, dermatoscópica e fotos com fluorescência com o equipamento LINCE. Em seguida foi realizada biópsia de todas as lesões para confirmação diagnóstica. Foram avaliados os padrões de fluorescência da queratose seborreica e do melanoma. Através dos resultados observou-se que todas as lesões de queratose seborreica apresentaram um padrão de fluorescência peculiar. Quando iluminada pelo ultravioleta, a queratose seborreica apresentou estruturas puntiformes esbranquiçadas que permitiram diferenciá-la do melanoma. Tal diferença pôde ser vista em todas as lesões. Frente aos fatos apresentados no presente estudo, pode-se concluir que a fluorescência, pode excluir o diagnóstico de melanoma, facilitando a triagem de lesões enegrecidas / Abstract: Skin cancer, including melanoma, is increasing worldwide. Although melanoma represents only 4% of skin cancers it is responsible for 60% of deaths from this cancer. There are difficulties in screening for melanoma. One of the differential diagnosis is the pigmented seborrheic keratosis. The aim of this study was to identify patterns of fluorescence of skin lesions of sborreic keratosis to exclude the melanoma. It was taken 31 patients with 31 dark and assimetric lesions. Seventeen patients with melanomas lesions and 14 patients with pigmented seborrheic keratosis. Each lesion was evaluated, being held macroscopic and dermoscopic photo images with fluorescence by the prototipe named LINCE. Biopsies of all lesions were carried out for diagnostic confirmation. The fluorescence patterns of seborrheic keratosis and melanoma were evaluated. The results showed that all lesions of seborrheic keratosis showed a peculiar pattern of fluorescence. When illuminated by ultraviolet, all the seborrheic keratosis showed white dots that allowed differentiate it from melanoma. This difference was observed in all lesions. It can be concluded that fluorescence can exclude the diagnosis of melanoma when a pigmented lesion is evaluated / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-29Bitstream added on 2014-06-13T19:56:59Z : No. of bitstreams: 1 grandi_f_me_botfm.pdf: 914284 bytes, checksum: 7e8beca0af748a53dac236ca291fea62 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O melanoma é uma das neoplasias cutâneas mais comumente diagnosticadas no homem e nos cães. O microambiente tumoral é composto pelas células neoplásicas e células estromais interagindo constantemente para garantir a progressão tumoral. Os fibroblastos associados ao câncer (FAC) representam uma população heterogênea de células caracterizadas pela expressão de diversos marcadores incluindo a proteína α-SMA e S100A4. Acredita-se que estas células originem-se de diversas fontes incluindo a transição endotelial fibroblástica. Neste trabalho, quantificamos a imunoexpressão da prpteína S100A4 nos fibroblastos associados ao câncer em melanomas cutâneos caninos, verificamos a potencial contribuição das células endoteliais na gênese desta população e correlacionamos os achados com parâmetros patológicos, incluindo a microdensidade vascular. Quarenta e oito casos de melanoma dermais caninos (21 epitelióides, 14 fusiformes e 13 mistos) previamente categorizados nos níveis de Clark 4, 5 e até 4 foram submetidos a imunofluorescência dupla utilizando os anticorpos primários α-SMA, fator de Von Willebrand (vWF) e S100A4 objetivando-se caracterizar os fibroblastos associados ao câncer e a contribuição da transição endotelial mesenquimal. Os melanomas não pigmentados foram caracterizados pela imunoistoquímica utilizando-se os anticorpos vimentina, pancitoqueratina, S100 e Melan A. A densidade microvascular foi analisada utilizando-se a técnica de imunofluorescência e o anticorpo primário anti-fator de Von Willebrand. O cálculo do número de vasos foi realizado selecionando-se cinco campos microscópicos de 200x contendo o maior número de vasos. O percentul de expressão da proteína S100A4 foi calculado através da técnica de segmentação de conglomerados de cor. Apenas um caso demonstrou... / Skin melanoma is one of the most common skin neoplasm seen in humans and dogs. Tumor microenvironment is composed by cancer cells and stromal cells that interacts to guarantee tumor progression. Cancer associated fibroblasts (CAF) represents a heterogeneous cell population characterized by expression of several markers including α-SMA and S100A4 proteins. These cells are thought to derive from different sources including endothelial-to-fibroblast transition. Here we characterize CAF in canine skin melanomas, verify the potential contribution of the endothelial cells to this population and correlate findings to pathological parameters, including microvascular density (MVD). Forth-eight cases of canine dermal melanomas (21 epithelioid, 14 spindle and 13 mixed) classified under Clark´s level 4 and 5 were submitted to a double immunofluorescence assay using primary antibodies α-SMA, Von Willebrand Factor (vWF) and S100A4 in order to characterize cancer associated fibroblasts and verify the contribution of endothelial to fibroblast transition. Non-pigmented samples were characterized by immunohistochemistry using primary antibodies pan-cytokeratin, vimentin, S100 and Melan A. Microvascular density was evaluated by immunofluorescent assay using vWF and by calculating total number of vessels in five 200x fields (“hotspots”).S100A4 imunoexpression was calculated using K-means clustering segmentation method. Only one case showed α-SMA and vWF co-expression restricted to myofibroblasts in tumor stroma. The cells were predominantly peritumoral and periadnexal. S100A4 expression was significantly different among three histotypes with mixed melanomas displaying lesser percentage of positive cells. Some neoplastic cells mainly in spindle cell melanomas were also positive for S100A4. There were no significant differences between MVD/histotypes... (Complete abstract click electronic access below)