As Mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças de armazenamento lisossômico causadas por deficiência de enzimas que catalisam a degradação gradual das glicosaminoglicanas (GAGs). GAGs (anteriormente chamadas de mucopolissacarídeos) são produtos de degradação das proteoglicanas que existem na matriz extracelular e tem efeito proteolítico. A classificação das MPS é baseada na deficiência enzimática específica. A MPS IVA é causada por mutações no gene que codifica a enzima GALNS (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), a qual desempenha um papel crucial na degradação do sulfato de queratano e condroitina-6-sulfatase. As mutações na enzima se resumem em três categorias: interrupção do sítio ativo, alterações no núcleo hidrofóbico e exposição da superfície, onde mutações missense na estrutura podem afetar gravemente a atividade da proteína GALNS, alterando seu núcleo hidrofóbico ou modificando seu enovelamento (folding). Com a falta de tratamentos efetivos, sendo em sua maioria paliativos, e tendo como base a estrutura já resolvida da GLANS selvagem, este trabalho teve como objetivo modelar 3 variantes da enzima GALNs, sendo uma mutação no sítio ativo, uma no núcleo hidrofóbico e uma na superfície. Foi usado o software MODELLER 9.12 para a modelagem comparativa, os softwares Prochek, PROSA II, ERRATv2, Verify3d, ProQ para a avaliação dos modelos, o software NAND 2.10, para simulação de dinâmica molecular e o software Chimera 1.10.1 para cálculo de superfícies eletrostáticas e hidrofobicidade da superfície. Os modelos apresentaram bons resultados segundo os softwares de avaliação e análise visual. Apresentaram poucas diferenças estruturais em relação à estrutura da GALNS selvagem, demonstraram estabilidade em simulação de dinâmica molecular. Entretanto, algumas diferenças foram observadas com relação à distribuição de cargas e hidrofobicidade no sítio ativo do modelo da variante com mutação no sítio ativo. Pôde ser concluído que as 3 mutações analisadas não causaram alterações estruturais significativas, não interferiram na estabilidade estrutural em simulação de dinâmica molecular, entretanto, foi demonstrado que mutações na região do sítio ativo podem interferir na função da enzima. / The Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of lysosomal storage diseases caused by deficiencies in enzymes that catalyze the gradual glycosaminoglycans (GAGs) degradation. GAGs (formerly called mucopolysaccharides) are products of proteoglycan degradation that exist in the extracellular matrix and have proteolytic effect. The classification of MPS is based on the specific enzyme deficiency. MPS IVA is caused by mutations in the gene that encodes the GALNS enzyme (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), which plays a crucial role in the degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfatase. Mutations in the enzyme can be summarized in three categories: interruption of the active site, changes in the hydrophobic core and display surface, where missense mutations in the structure can seriously affect the activity of GALNS protein, changing its hydrophobic core or modifying its folding. With the lack of effective treatments, in its most palliative, and based on the wild GALNS structure already determined, this study aimed to model 3 variants of GALNS enzyme, a mutation in the active site, one in the hydrophobic core and a on the surface. 9.12 MODELLER was used for comparative modeling software, the software Prochek, Prose II, ERRATv2, Verify3d, ProQ models for the evaluation of the NAND 2.10 software, for molecular dynamics simulation and software Chimera 1.10.1 calculates electrostatic and hydrophobic surface. The models showed good results according to the evaluation software and visual analysis. Presented few structural differences from the wild GALNS structure and showed stability in molecular dynamics simulation. However, some differences were observed with respect to the charge distribution and hydrophobicity in the active site of the variants of the model with a mutation in the active site. It might be concluded that the three mutations analyzed did not cause significant structural changes and did not affect the structural stability in molecular dynamics simulation, however, it has been shown that mutations in the active site region may interfere with the function of this enzyme.

Nesse projeto trabalhamos com uma β-glicosidase digestiva da larva da lagarta Spodoptera frugiperda (Sfβgli50, 50 kD - AF052729), expressa na forma de proteína recombinante em E.colli. O nosso objetivo foi estudar o papel de dois resíduos de aminoácidos envolvidos na atividade catalítica da Sfβgli50. O primeiro resíduo estudado foi o Y456, envolvido na afinidade pela porção redutora do substrato (aglicone), o segundo resíduo foi o N329 envolvido na modulação do pH ótimo. Estudo do papel do resíduo Y456 na afinidade pelo aglicone do substrato. O sítio-ativo da Sfβgli50 é formado por quatros subsítios (-1, +1, +2, e +3). O subsítio que acomoda a porção não-redutora do substrato (glicone) recebe numeração negativa (-1), já os subsítios que acomodam a porção redutora do substrato (aglicone) recebem números positivos (+1, +2 e +3). Trabalhando com duas β-glicosidases de plantas (milho e sorgo), Cicek et al. (2000) demonstraram que uma pequena porção da extremidade C-terminal destas β-glicosidases (462SSGYTERF469 - numeração da enzima do sorgo) está envolvida na especificidade pelo aglicone do substrato, sendo que muitos desses aminoácidos são conservados em outras β-glicosidases da família 1. O alinhamento das sequências destas duas enzimas com a Sfβgli50 sugere que Y456 pode fazer parte do sítio de ligação do aglicone nesta β-glicosidase de inseto. Utilizando experimentos de mutação sítio-dirigida, o Y456 foi substituído por uma alanina (mutante Y456A) sendo que este foi expresso na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando o vetor pT7-7. O mutante Y456A foi parcialmente purificado através de uma cromatografia hidrofóbica em sistema de FPLC, e caracterizado utilizando diversos inibidores competitivos (glucono δ-lactona, celobiose, celotriose, pentilbglicosídeo e octilbtioglicosídeo). Comparando os Kis obtidos para a Sfβgli50 selvagem e mutante Y456A com os inibidores glucono δ-lactona, celobiose e celotriose, foi proposto que Y456 encontra-se no subsítio +1 do sítio ativo da Sfβgli50. Já através da comparação entre os inibidores octilβtioglicosídeo e pentilβglicosídeos constatou-se que Y456 interage com uma porção polar do aglicone do substrato, talvez através de uma ligação de hidrogênio. Baseando-se nestes Kis foi calculada a energia de associação de resíduos de glicose e grupos alquila nos subsítios +1 e +2, indicando que o subsítio +1 do mutante Y456A tem uma especificidade mais ampla frente à ligantes polares (glicose) e apolares (grupos butil) do que a enzima selvagem. Sabendo que este resultado foi obtido removendo-se um resíduo com um grupo polar na cadeia lateral (Y456), estes dados estão de acordo com a hipótese de que a especificidade dos subsítios da região de ligação do aglicone é determinada por um balanço entre resíduos polares e apolares (Marana et al., 2001). Estudo do papel do resíduo N329 na modulação do pH ótimo. O mecanismo de catálise da Sfβgli50 é dependente de dois resíduos de ácido glutâmico: um doador de prótons (E187 - pKa= 7,5) e um nucleófilo (E399 - pKa = 5,0). Sendo o pH ótimo da Sfβgli50 (6,2) uma média aritmética dos pKas destes dois resíduos catalíticos. Uma análise estrutural do sítio ativo da Sfβgli50 mostra que o resíduo N329 forma ligações de hidrogênio com o resíduo E187 (doador de prótons), talvez atuando na modulação do seu pKa. Para estudar o papel do resíduo N329 na atividade da Sfβgli50 foram construídos 3 mutantes, nos quais tal resíduo foi substituído por alanina (N329A), ácido aspártico (N329D) e uma glutamina (N329Q). Os mutantes foram expressos na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando os vetores pT7-7 e pCal-n-Flag. Entretanto, tentativas de purificação das SfΒgli50 mutantes através de cromatografia hidrofóbica foram infrutíferas, sugerindo uma possível inativação destas enzimas. Esta hipótese foi reforçada pela purificação das Sfβgli50 mutantes e selvagem contendo o peptídeo de fusão CBP (calmodulin binding peptide) através de cromatografia de afinidade. Este experimento demonstrou que as enzimas mutantes eram de fato inativas. Frente à estes resultados não foi possível concluir a caracterização do efeito do pH na atividade catalítica das Sfβgli50 mutantes N329A, N329D e N329Q. Por fim, foi proposto que a inativação da Sfβgli50 devido à mutações na posição N329 pode resultar de uma desnaturação das enzimas mutantes ou do reposicionamento do ácido catalítico devido à perda ou alteração da interação com o resíduo 329. / In this project it was studied the role of two residues (N329 and Y456) in the catalytic activity of a digestive β-glycosidase from Spodoptera frugiperda (SfΒgli50 - AF052729). N329 is believed to modulate the enzyme pH optimum, whereas Y456 may participate in the binding of the substrate aglycone. Role of Y456 The peptide 462SSGYTERF469 of the sorghum β-glycosidase is proposed to be part of the aglycone binding site in that enzyme. Some of those residues are conserved in Sfβgli50, among them Y456. Using site-directed mutagenesis Y456 was replaced by A and this mutant (Y456A) expressed in bacteria. Following that, this mutant enzyme was partially purified using hydrophobic chromatography. Inhibition experiments showed that binding of δ-gluconolactone, which occupies subsite -1, is not affected by that mutation. In contrast, Ki values for cellobiose (that binds to subsites -1 and +1) and cellotriose (that binds to subsites -1, +1 and +2) are two-fold higher than those of wild-type enzyme, indicating that mutation Y456A decrease the interaction with these oligocellodextrins. Moreover, binding of pentyl and octylβglucosides is not affected by mutation Y456A, suggesting that Y456 interacts with aglycone polar groups. Finally, evaluation of glucose and butyl binding energies in subsite +1 revealed that mutant Y456A specificity is broader than that of wild-type enzyme. Role of N329 A structural model of Sfβgli50 active site revealed that catalytic proton donor (E187) may interact with N329. In order to study the role of this interaction in the activity of Sfβgli50, N329 was replaced by A, D and Q (mutants N329A, N329D and N329Q, respectively). These mutants were expressed as recombinant proteins in bacteria and purified through affinity chromatography, revealing that Sfβgli50 was inactivated by those mutations. It was proposed that this inactivation may be due to protein desnaturation or a wrong positioning of the catalytic proton donor.

Esta pesquisa teve como objetivo a realização de experimentos poéticos em artes visuais, que também foram o seu objeto de estudo. Os experimentos pretenderam explorar imagens de meu corpo em seus estados transitórios, realizando ações e modificações, por meio de peles artificiais e máscaras e acrescentando dispositivos ao corpo, produzindo sensações visuais, táteis, auditivas, espaciais e temporais que buscam gerar reflexões sobre os corpos dos seres em geral. Através das ações que meu corpo realiza ou, em alguns outros trabalhos, por meio de palavras que remetem ao corpo e a seus comportamentos, pretendi produzir sensações e ficções que discutem questões ligadas à existência cotidiana como: relações sociais, efemeridade, mutações da sensibilidade, subjetividade, relação humano-máquina e mecanização dos sentimentos. / This research aimed to carry out poetic experiments, which were also its object of study. The experiments attempted to explore images of my body in its transient states, performing actions and modifications, using artificial skins and masks, adding devices to the body, producing visual, tactile, auditory, spatial and temporal sensations which seek to generate reflections on the bodies of beings in general. Through the actions that my body performs or in some other works, through words that refer to the body and its behaviors, I intend to produce sensations and fictions that discuss issues related to daily existence such as: social relations, ephemerality, sensitivity mutations, subjectivity, human-machine relationship and mechanization of feelings.

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-28T17:57:16Z No. of bitstreams: 1 cp076202.pdf: 353215 bytes, checksum: 02f0b3e82f46b91b291d72431aa09667 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-28T17:57:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp076202.pdf: 353215 bytes, checksum: 02f0b3e82f46b91b291d72431aa09667 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T17:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp076202.pdf: 353215 bytes, checksum: 02f0b3e82f46b91b291d72431aa09667 (MD5) Previous issue date: 2008

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Objetivos: Descrever as alteracoes cromossomicas em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primaria (MF). Verificar se a taxa de anormalidades cromossomicas e ampliada pela FISH nos casos com cariotipo normal e ausencia de metafases. Detectar a incidencia da mutacao JAK2 V617F em PV, TE e MF; de mutacoes no exon 12 do JAK2 em PV e de mutacoes MPL W515K/L em TE e MF. Correlacionar as alteracoes citogeneticas e moleculares encontradas com o grau de fibrose medular nos casos de MF; numero de leucocitos, plaquetas, hemoglobinas; e idade, ao diagnostico, em todos pacientes. Metodo: O estudo foi realizado em 20 casos de PV, 17 de TE e 21 de MF. O cariotipo por banda G foi realizado em amostras de medula ossea, semeadas em cultura de curta duracao (24h), sem mitogenos e processadas de forma habitual (Chauffaille, 2006). Parte da amostra (1mL) foi destinada a FISH, com sondas para as regioes: 20q12, 20q13.12, 13q14.3, 13qter (subtelomerica), 8p11.1-q11.1 (ƒ¿-satellite) e 9q12 (satellite III). A pesquisa das mutacoes JAK2V617F e MPL W515K/L foi realizada em DNA de sangue periferico, por PCR em tempo real, utilizando-se o kit JAK2 MutaScreenTM (Ipsogen). A pesquisa de mutacoes no exon 12 do JAK2 foi realizada por sequenciamento direto. Resultados: As alteracoes cromossomicas foram observadas em 11,8% das PV, 17,6% das MF e nenhuma das TE, nao havendo relacao entre dados clinicos avaliados e alteracoes cromossomicas. As anormalidades cromossomicas nao foram ampliadas pela FISH. JAK2 V617F foi observada em 90% das PV, 42,8% das MF e 47% das TE. Os pacientes com PV JAK2 V617F negativos apresentaram menores niveis de plaquetas em relacao aos PV V617F positivos (p<0,0001). MF V617F positivos apresentaram maiores graus de fibrose do que os V617F negativos (p=0,003). Nao foi detectada a presenca de mutacoes no exon 12 do JAK2 em pacientes com PV. MPL W515L foi observada em um caso de MF e em um de TE. Nao foi encontrada a mutacao MPL W515K nos pacientes com TE e MF. A paciente com TE MPL W515L positivo nao apresentou quadro clinico diferente dos demais pacientes com TE, enquanto que a paciente com MF MPL W515L positivo apresentou quadro clinico mais agressivo quando comparada aos demais pacientes com MF. O numero de alteracoes clonais nao mostrou diferenca quanto aos dados clinicos avaliados. Conclusoes: Os diferentes tipos de alteracoes clonais em neoplasias mieloproliferativas exaltam seus diferentes mecanismos fisiopatogenicos, auxiliando no diagnostico e compreensao da biologia destas doencas. Este estudo permitiu a caracterizacao citogenetica e molecular de PV, MF e TE. / Introcuction: Polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and myelofibrosis (MF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell and clinical and biological aspects have in common that hinder their diagnosis, however, cytogenetic and molecular studies represent important tools to assist in this procedure. Therefore, the investigation of the presence of JAK2 V617F, mutations in exon 12 of JAK2, MPL W515K of MPLW515L and cytogenetic alterations per karyotype and FISH can provide a more detailed view for the diagnosis and prognosis of these diseases. In this study such cytogenetic and molecular changes were correlated with degree of fibrosis in cases of MF, the number of leukocytes, platelets, hemoglobin and age at diagnosis in PV, ET and MF Method: The karyotype by G-band was performed on samples of bone marrow, grown in culture for short duration (24h) without mitogens and processed as usual (Chauffaille, 2006). The sample (1 ml) was intended to FISH with probes for the regions: 20q12, 20q13.12, 13q14.3, 13qter, 8p11.1-q11.1 and 9q12. The investigation of JAK2 V617F and MPL W515K/L mutations was performed on DNA from peripheral blood by real time PCR, using the kit MutaScreenTM JAK2 (IPSOGEN). The search for mutations in exon 12 of JAK2 was performed by direct sequencing. Results: Chromosomal abnormalities were observed in 11.8% of PV, 17.6% of MF and none of the ET, no relation between clinical data and assessed chromosomal alterations. Chromosomal abnormalities were not amplified by FISH. JAK2 V617F was observed in 90% of PV, 42.8% of MF and 47% of ET. Patients with JAK2 V617F negative PV showed lower levels of platelets in relation to V617F positive PV (p <0.0001). MF V617F negative and MPL W515L positive showed higher degrees of fibrosis than V617F negative (p =0.003). Was not detected the presence of mutations in exon 12 of JAK2 in PV patients. MPL W515L was observed in a case of MF and a TE. No MPL W515K mutation was found in patients with ET and MF. The ET patient MPL W515L positive showed no clinical different from other patients with ET, whereas the patient with MF MPL W515L showed positive clinical more aggressive when compared to other patients with MF. The number of clonal abnormalities showed no difference in the clinical data evaluated. Conclusions: Different types of clonal abnormalities in myeloproliferative neoplasms exalt their different pathophysiological mechanism, aiding in the diagnosis and understanding of the biology of these diseases. This study allowed the cytogenetics and molecular characterization of PV, MF and ET. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-10-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00284.pdf: 1210351 bytes, checksum: 9468c9b00f4f6d4853d0e556a03096c4 (MD5) / Introdução: a falha ao HAART torna importante o desenvolvimento de novos fármacos que alvejam diferentes passos do ciclo de vida do HIV-1. O Enfuvirtide (T20) é um peptídeo sintético que mimetiza a região HR2 da gp41 do HIV-1, impedindo sua fusão e entrada na célula hospedeira. A presença de mutações de resistência primária ao T20 pode levar a falta de resposta virológica sustentada (RVS) em indivíduos em falha terapêutica ao HAART. Objetivos: genotipar a gp41 do HIV-1 de indivíduos considerados respondedores e não respondedores ao T20; verificar se a presença de mutações de resistência primária poderia interferir na RVS; correlacionar o status RVS com aspectos virais, imunológicos e tropismo. Metodologia: DNA genômico do baseline (antes do tratamento), 6 e 12 meses após o tratamento com T20, foi purificado utilizando QIAamp DNA Mini kit (Qiagen®, Valencia, Califórnia, USA). Todos pacientes receberam terapia otimizada mais T20 no inicio. 506 pb referentes as regiões HR1 e HR2 da gp41 foram amplificados por PCR “nested”. A PCR “nested” da região V3 para estudo do tropismo viral amplificou 654 pb. A PCR foi purificada utilizando Montage® PCR Centrifugal Filter Devises (Millipore®). As PCRs purificadas das regiões V3 e gp41 foram sequenciadas no ABI Prism 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Ca, USA) com o kit comercial BigDye® Terminator Cycle Sequencing versão 3.1 (Applied Biossystems, Foster City. Califórnia, USA). Iniciadores da segunda etapa da PCR “nested” foram utilizados para sequenciar. Resultados: sete indivíduos apresentavam um perfil de resposta ao T20 por 12 meses, 4 por pelo menos 6 meses e dois não responderam entre 6 e 12 meses. A média de idade foi de 44,92 ± 5,39, sendo 46,16% do sexo feminino e 53,84% do masculino. Dos 13 pacientes analisados, 12 pertencem ao subtipo B e 1 ao F1. Oito pacientes apresentaram o correceptor R5 e cinco o X4. Não foram encontradas mutações nas posições 36 a 45 da HR1 em 12 meses. Tivemos a N42S, que é responsável pela diminuição da susceptibilidade ao T20. De um total de 59 aminoácidos analisados na HR1, observamos 18,64% de trocas e na região HR2, 38,88%. Na HR1 no período de 8 meses ou mais em relação ao baseline, não encontramos modificações nas posições 36 a 45. De um total de 59 aminoácidos analisados, observamos 15,25% de trocas e na HR2, 36,11%. Verificamos a E137K sem a presença da N43D, que causou resistência. Verificamos a S138T como mutação de primaria com persistência de 12 meses sem a N43D e a falta de resposta ao tratamento. Na contagem de T CD4+, não encontramos diferença estatística entre as médias dos diferentes grupos (ANOVA – p=0,1). As cargas virais após 6 meses foram indetectáveis (<50 copias/mL) em 69,23% dos pacientes. Houve queda de carga viral do baseline para 6 meses (p=0.034), assim como para 6 meses e 8 meses ou mais. O uso do medicamento teve interferência significativa quando comparados o baseline e 6 meses (p=0.004) e entre o baseline e 12 meses (p=0.022), mas entre 6 e 12 meses a interferência não foi significativa, mostrando que após 6 meses ela permanece sustentada. Entre as variáveis, indivíduos respondedores e genótipo R5 houve alto valor de similaridade (76.98). Ocorreu agrupamento entre as duas amostras dos respondedores com genótipo X4 com as mutações 306, 311 e 320, que o caracterizam. Discussão: em relação ao tropismo, 38,47% dos pacientes que estudamos apresentaram correceptor X4 após alguns anos de infecção e múltiplos esquemas HAART. Este resultado mostra concordância com a literatura, que descreve uma taxa média de 50%. A N42S, observada em nosso estudo é relacionada com diminuição da susceptibilidade da droga. Apesar disso, somente um dos pacientes não respondeu ao tratamento, não obtendo ganho imunológico. Conclusão: o tropismo dos vírus HIV-1 na maioria dos indivíduos que responderam ao T20 está fortemente associado com o R5, que não causa progressão rápida. A presença da S138T foi suficiente para a falta de resposta ao T20, sem associação com a N43D. Mostramos evidente RVS e recuperação imunológica com o T20, mas que não foi suficiente para retirar estes indivíduos do risco de doenças oportunistas. Nosso estudo evidenciou a importância de iniciar o resgate quando a contagem de linfócitos T CD4+ está acima de 200 células/mm3. / Introduction: the failure to HAART becomes important to development of new drugs that target different steps of the life cycle of HIV-1. The Enfuvirtide (T20) is a synthetic peptide that mimics the HR2 region of gp41 of HIV-1, preventing its fusion and entry into the host cell. The presence of primary resistance mutations to T20 can lead to lack of sustained virologic response (SVR) in people in the HAART failure. Objectives: to genotype the gp41 of HIV-1 subjects considered responders and nonresponders to T20; verify the presence of primary resistance mutations could influence the SVR, SVR status correlate with aspects of viral, immunological and tropism. Methodology: genomic DNA from baseline (before treatment), 6 and 12 months after treatment with T20, was purified using QIAamp DNA Mini kit (Qiagen ®, Valencia, California, USA). All patients received optimal therapy more T20 at the beginning. 506 bp referring to the HR1 and HR2 regions of gp41 were amplified by PCR nested. PCR nested the V3 region to study viral tropism amplified 654 bp. The PCR was purified using Montage ® PCR Centrifugal Filter Devises (Millipore ®). The PCRs of purified V3 and gp41 regions were sequenced in ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA) with commercial kit BigDye ® Terminator Cycle Sequencing version 3.1 (Applied Biossystems, Foster City. California, USA). Initiators of the second stage of PCR nested were used for sequencing. Results: seven patients had a higher response to T20 for 12 months, 4 for at least 6 months and two did not respond between 6 and 12 months. The average age was 44.92 ± 5.39, and 46.16% female and 53.84% male. Of the 13 patients analyzed, 12 belong to subtype B and 1 to F1. Eight patients had the coreceptor R5 and five the X4. There were no mutations at positions 36 to 45 of HR1 in 12 months. We acquired the N42S, which is responsible for decreased susceptibility to T20. From a total of 59 amino acids analyzed in HR1, we observed 18.64% of change and in HR2 region, 38.88%. In HR1 within 8 months or more compared to the baseline, we found no changes in positions 36 to 45. From a total of 59 amino acids analyzed, we observed 15.25% of change and in HR2, 36.11%. We checked the E137K without the presence of N43D, which caused resistance. We checked the S138T mutation as the primary persistence of 12 months without the N43D and the lack of response to treatment. On the count of CD4 + T cells, we found no statistical difference between the means of different groups (ANOVA - p = 0.1). The viral loads after 6 months were undetectable (<50 copies / mL) in 69.23% of patients. There was a decrease in viral load baseline to 6 months (p = 0.034) and for 6 months and 8 months or more. The use of the drug had significant interference when compared to baseline and 6 months (p = 0.004) and between baseline and 12 months (p = 0.022), but between 6 and 12 months the interference was not significant, showing that after 6 months it remains sustainable. Among the variables, responders and R5 genotype, there were high value of similarity (76.98). There was a grouping between the two samples of responders with X4 genotype with mutations 306, 311 and 320 which characterize it. Discussion: regarding tropism, 38.47% of the patients studied had correceptor X4 after a few years of infection and multiple HAART regimens. This result shows agreement with the literature, which describes an average rate of 50%. The N42S, observed in our study is associated with decreased drug susceptibility. However, only one patient did not respond to treatment, without increase of his immune. Conclusion: the tropism of HIV-1 in the majority of people who responded to the T20 is strongly associated with the R5, which causes rapid progression. The presence of S138T was sufficient for the lack of response to T20, but no association with N43D. It was clearly shown SVR and immune recovery with the T20, but that was not enough to remove these people from the risk of contracting opportunistic diseases. Our study showed the importance of starting the rescue when the count of CD4 + T cells are above 200 cells/mm3. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 gabriela_garcia_ioc_mest_2012.pdf: 5953983 bytes, checksum: 9330fc410b9489226898cb3a6791b904 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A utilização de inseticidas neurotóxicos contra insetos vetores ainda tem um papel crucial nos programas de controle de doenças. No Brasil é uma estratégia importante no controle do vetor da dengue, o Aedes aegypti. O principal larvicida utilizado para este fim em ca mpo tem sido o organofosforado (OP) temephos, desde 1967, com utilização intensificada a partir da epidemia de 1986. Em função do diagnóstico de resistência em diversas populações brasileiras a este OP, atualmente se encontra em andamento a substituição pelo inibidor de síntese de quitina (ISQ) diflubenzuron. Para o controle da fase adulta dos mosquitos, os inseticidas mais utilizados atualmente pertencem à classe dos piretróides (PI). Contamos no país com a Rede Nacional de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti a Inseticidas (MoReNAa), com metodologias consolidadas para a avaliação da resistência e de seus mecanismos em populações do vetor de dengue. No presente estudo, essas metodologias foram empregadas para avaliar ao longo de um ano, em quatro localidades do Brasil, de quatro regiões distintas, a resistência aos inseticidas citados anteriormente. Identificamos alterações de susceptibilidade ao larvicida temephos em todas as populações participantes do estudo; entretanto, observamos, em todos os casos, tendência de queda da razão de resistência ao longo do estudo, que atribuímos à interrupção do uso deste composto em campo Em relação ao outro larvicida investigado, o diflubenzuron, foram constatadas razões de resistência baixas para todas as populações, em todos os momentos, provavelmente em função da sua recente incorporação no âmbito do controle químico no país. Ressaltamos no entanto a importância de avaliações deste ISQ mediante simulados de campo para uma melhor compreensão sobre o significado funcional das razões de resistência encontradas neste estudo, e seu impacto no controle efetuado em campo no país. Já para o adulticida investigado, a deltametrina (PI), observamos uma resistência disseminada no país, sendo extremamente elevada em três das quatro populações estudadas. Os resultados indicam uso público indiscriminado de inseticidas em uma das localidades e sugerem correlação entre a resistência a PI e a utilização doméstica deste inseticida, o que chama atenção para a necessidade de adoção de medidas de conscientização do uso deste tipo de ferramenta pela sociedade. Após a quantificação da resistência a estes três inseticidas, partimos para a investigação dos mecanismos responsáveis, analisando a resistência metabólica \2013 derivada de alterações nas atividades de enzimas que detoxificam estes compostos \2013 por meio de ensaios bioquímicos e a resistência por alteração no sítio alvo \2013 derivada de modificações estruturais nas moléculas alvo dos inseticidas - por meio de ensaios bioquímicos e moleculares Foram diagnosticadas principalmente alterações na atividade de duas enzimas na fase adulta das quatro populações, GST e PNPA. Estas enzimas já haviam sido relacionadas à resistência a PI anteriormente. Na fase de larvas, não foi possível estabelecer qualquer correlação diagnóstica com a resistência a temephos ou diflubenzuron: alterações na atividade das enzimas variaram entre as populações estudadas. De maneira geral, verificamos tendência de queda na atividade de PNPA em Duque de Caxias, de MFO em Parnamirim e das Esterases ALFA e BETA em Campo Grande . Em relação aos ensaios moleculares, diagnosticamos três diferentes mutações no canal de sódio das populações avaliadas (nas posições 1011, 1016, 1534). Destas, duas mutações (1016 e 1534) foram correlacionadas com a elevada resistência a PIs neste estudo. Este trabalho possibilitou uma melhor compreensão sobre a dinâmica da resistência a inseticidas no país. Esperamos, desta forma, contribuir para o manejo do controle químico de Ae. aegypti, auxiliando a recomendação de inseticidas, tanto para larvas quanto para adultos, de uma forma eficiente e racional / The utilization of neurotoxic insecticides against insect vectors has a crucial role in disease control programs. In Bra zil it is an important strategy against the dengue vector, Aedes aegypti . Since 1967 the main larvicide used in the field has been the organophosphate (OP) temephos, with a strong utilization after the dengue epidemy in 1986. Due to OP resistance of seve ral Brazilian vector populations, nowadays it’s substitution by the chitin synthesis inhibitor (CSI) diflubenzuron is in progress. Pyrethroids (PI) are the most widely used insecticides in the control of adult mosquitoes. In Brazil the National Network f or Aedes aegypti Insecticide Resistance Monitoring (MoReNAa) relies on consolidated methodologies for assessing resistance and the underlying its mechanisms in populations of the dengue vector. In the present study, we employed these methodologies to eval uate resistance to the above mentioned insecticides of four municipalities, belonging to four Brazilian regions , during one year. We identified changes in the susceptibility levels to the larvicide temephos in all populations considered in the study. How ever , there was a tendency of temephos resistance ratio decrease throughout the period of evaluation, probably due to the interruption of the use of this compound in the field. Diflubenzuron, the other larvicide investigated, elicited low resistance ratio s in all populations considered, and this was attributed to its recent incorporation as a chemical control tool in the country. However, we emphasize the importance of field simulated assays with this CSI in order to better understand the significance of the resistance values found and their impact on vector control. For the adulticide investigated, deltamethrin (PI), we observed widespread resistance all over the country . Resistance levels were particularly high in three out of the four investigated pop ulations. Our results point to an indiscriminate public use of PI in one municipality and suggest correlation between PI resistance and the intense domestic use of this class of insecticides. This calls attention to the need of adopting measures to raise society awareness to the limitations of this kind of tools. After resistance quantification to these three insecticides, we investigated the mechanisms potentially involved by analyzing both metabolic resistance - derived from changes in the activity of detoxifying enzymes - and resistance by altered target site - derived from structural modifications in the insecticide target molecules. Biochemical and molecular assays were employed. GST and PNPA were the main enzymes altered, and this was observed in adult specimens of all populations. These enzymes have been previously associated with PI resistance. In the larval stage, no diagnostic correlation between enzymes activity and temephos or diflubenzuron resistance could be established , enzymatic alterat ions varying among the evaluated populations . In general, we detected tendency of decrease in the PNPA activity at Duque de Caixas, MFO at Parnamirin and ALFA and BETA Esterases at Campo Grande. Regarding the molecular assays, it was possible to identify three different mutations in the sodium channel, the PI target site (at positions 1011, 1016 and 1534). Of these, two mutations (1016 and 1534) were correlated to high resistance levels to PIs. This study contributed to a better understanding of the dyn amics of insecticide resistance in Brazil. We expect to have been contributed to the management of Ae. aegypti chemical control, support ing the recommendation of efficient and rational usage of insecticides for both larvae and adults

Made available in DSpace on 2016-06-21T13:43:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 16.pdf: 1288159 bytes, checksum: 2cc2211b7c112d6211913cb143210291 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:16:57Z (GMT). No. of bitstreams: 3 16.pdf.txt: 147563 bytes, checksum: bd0b620aa6e12c62ec7b8d6d41de5c7b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 16.pdf: 1288159 bytes, checksum: 2cc2211b7c112d6211913cb143210291 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Em Cabo Verde, arquipélago situado na Costa Ocidental Africana, os primeiros casos de dengue ocorreram em 2009, com a notificação de mais de 21.000 casos, a maioria desses registrados na Ilha de Santiago. O mosquito Aedes aegypti foi identificado como vetor, e ações para seu controle, usando os inseticidas temephos (larvicida) e a deltametrina (adulticida), têm sido implementadas. Objetiva-se com esse trabalho avaliar o atual status de suscetibilidade a inseticidas e caracterizar os mecanismos de resistência nessa população. Amostras de A. aegypti da ilha de Santiago foram coletadas através de armadilhas de oviposição, para o estabelecimento de uma população a ser analisada. Foram realizados bioensaios do tipo dose diagnóstica, usando garrafas impregnadas com doses únicas dos adulticidas malathion (organofosforado), deltametrina (piretróide) e cipermetrina (piretróide), e bioensaios do tipo dose resposta, usando múltiplas concentrações dos inseticidas temephos (organofosforado), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (bactéria entomopatogênica) e diflubenzuron (inibidor de síntese de quitina). Para a investigação dos mecanismos de resistências, foram realizados testes bioquímicos com substratos específicos para quantificar a atividade das enzimas glutationa S-transferases, esterases (alfa, beta e PNPA) e oxidases de função mista, ligadas a detoxificação de xenobióticos, e a taxa de inibição da acetilcolinesterase ligada a insensibilidade do sítio alvo. Pesquisou-se também a presença de mutaçõeso do tipo kdr (knock-down resistance) associadas à resistência a piretróides, pela análise da sequência dos exons 20 e 21 no gene do canal de sódio. Nos resultados dos bioensaios constatou-se que a população de A. aegypti investigada apresenta resistência aos piretróides deltametrina e cipermetrina (mortalidade 80 por cento) e ao organofosforado temephos (RR90=4), mas é suscetível ao malathion (mortalidade maior ou igual a 98 por cento), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (RR90=0.8) e ao diflubenzuron (RR90=2,2). Em relação a atividade das enzimas ligadas ao processo de detoxificação, foram detectadas alterações nas glutationa S-transferases (25 por cento), oxidases de função mista (18 por cento), esterase-alfa (19 por cento) e esterase-beta (17 por cento). A taxa de inibição da acetilcolinesterase (6 por cento) e a atividade da esterase-PNPA (7 por cento) mostraram que estas estão inalteradas. Nenhuma das mutações do tipo kdr pesquisadas foi detectada. Estes resultados permitem concluir que a população de A. aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, é suscetível aos inseticidas, excetuando os piretróides testados e o temephos, usados no seu controle; e que ela apresenta alterações em enzimas detoxificadoras que poderão estar implicadas na resistência a esses compostos.

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Um grupo de doenças relacionadas às alterações no desenvolvimento da tireoide, denominadas disgenesias tireoidianas (DT), responsabiliza-se por aproximadamente 85% de todos os casos de HC, sendo sua patogênese pouco conhecida. OBJETIVOS: Geral: Caracterização clínica e genética de pacientes com HC diagnosticados com disgenesia tireoidiana. Específicos: 1. Caracterizar clínica dos indivíduos com HC em acompanhamento na APAE/Salvador (Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais); 2. Avaliar a existência de associação entre malformações tireoidianas e malformações cardiacos; 3. Pesquisar polimorfismos e mutações nos genes candidatos: PAX8, TSH-R, NKX2.5 e HES1, em pacientes diagnosticados com disgenesia tireoidiana; 4. Pesquisar o gene TSH-R numa coorte de pacientes com HC diagnosticados no programa de triagem neonatal da França. METODOLOGIA: Até o ano de 2016, 1.188 crianças foram diagnosticadas com HC e 773 estão em acompanhamento. Duzentos e dezoito crianças confirmadas com HC foram caracterizadas clinicamente através de testes de função da tireoide (TT4 e TSH), ultrassonografia e cintilografia, seguidas de dosagem de tireoglobulina. Toda a região codificantes dos genes PAX8, TSH-R, NKX2.5 e HES1 incluindo íntrons e éxons foram amplificados a partir do DNA genômico através da PCR (Reação em cadeia da Polimerase) utilizando-se técnicas padrão seguida de Sequenciamento direto. RESULTADOS: Sessenta e três pacientes foram diagnosticados com DT e 155 com glândula tópica normal. Hipoplasia representou 33,4% dos casos de DT, agenesia 19%, ectopia 27% e hemiagenesia 20,6%. Altos concentrações de TSH no teste do pezinho foram detectados no grupo das agenesias seguido das hipoplasias. Na análise genética/molecular, 31 (49,2%) dos pacientes foram identificados com o polimorfismo p.D727E em heterozigose e 4 (6,4%) em homozigose, no gene TSH-R; 4/63 pacientes tiveram o polimorfismo p.P52T em heterozigose; 14/63 apresentaram a variante polimórfica p.N181N e 2/63 apresentaram a substituição sinônima conhecida p.L645L, todos no gene TSH-R. o polimorfismo p.Glu21 foi encontrado em 54% dos pacientes e p.Gln181 encontrado em 1 paciente no gene NKX2.5. Nenhuma alteração foi encontrada no gene HES1, bem como em PAX8. CONCLUSÕES: Este é o primeiro estudo realizado na população de HC no Estado da Bahia. Análises clínicas revelaram um padrão distinto entre os subgrupos da DT quando comparados com glândula normal; 6 polimorfismos já descritos foram encontrados em dois genes candidatos. Nenhuma mutação patogênica foi encontrada. A descrição fenotípica é essencial para a correta avaliação genética e os mecanismos nela implicados, além de utilizados para predição da gravidade do HC. A identificação de novos genes ou eventos moleculares que controlam a função tireoidiana pós-natal seria de grande utilidade no esclarecimento das DT. Palavras-chave: / INTRODUCTION: Congenital hypothyroidism (CH), is the most common metabolic diseases in childhood with incidence of 1: 3000-1: 4000 newborns. A group of diseases related to alterations in the development of the thyroid, called thyroid dysgenesis (TD), is responsible for approximated 85% of all HC cases, and the majority has unknown pathogenesis. OBJECTIVES: General: clinical and genetic characterization of CH patients diagnosed with TD. Specific: 1. CH clinical characterization in individuals followed at APAE/Salvador; 2. evaluating the association between thyroid abnormalities and other abnormalities or syndromes; 3. search polymorphisms and mutations in known candidate genes for TD: PAX8, TSH-R, NKX2.5 and HES1; 4. XX METHODS: Until the year 2016, 1.188 children were diagnosed for CH and 773 were actually follow in APAE-Salvador. A continuous series of 218 children with confirmed HC were characterized clinically through thyroid function tests (TT4 and TSH), thyroid ultrasound and scintigraphy, followed by serum thyroglobulin measurement. The entire coding region of the candidate genes (PAX8, TSH-R, NKX2.5 and HES1), including exon/intron boundaries, was amplified from genomic DNA by polymerase chain reaction (PCR) using standard techniques, followed by direct sequencing. Results: Sixty-three patients were diagnosed with DT and 155 with in situ thyroid gland (ISTG). Hypoplasia represented 33,4% of all cases of DT, agenesis (19%), ectopy (27%) and hemiagenesis (20,6%). The higher screening TSH levels was in the agenetic group followed by hypoplasia. In the genetic/molecular analysis, 31 (49,2%) patients were identified with a polymorphism of TSH-R gene (p.D727E); 4/63 patients had a heterozygous p.P52T; 14/63 patients showed p.N187N polymorphic variants of the gene; and 2/63 patients presented a known p.L645L synonimous substitution. The polymorphism p.Glu21was found in 54% of patients, and p.Gln181 found in only one patient in the NKX2.5 gene. None alteration was detected in HES1 gene. CONCLUSIONS: This is the first CH population-based study in State of Bahia, Brazil. Clinical analysis revealed distinct hormonal patterns in DT subgroup when compared with ISTG, with only 6 known polymorphisms identified in few cases of TD in TSH-R, PAX8, NKX2.5 and HES1 genes. No mutation was found in a candidate genes studied. A detailed description of phenotype might be essential to target the correct genetic and mechanism implicated, and useful to predict CH severity. The identification of additional genes or molecular events controlling early postnatal thyroid function would be helpful.

O câncer de mama é o tipo mais frequente de neoplasia maligna entre as mulheres, com a incidência de mais de um milhão de novos casos no mundo, por ano. O gene TP53 é responsável por regular o destino da célula em resposta a estresses genotóxicos e não genotóxicos. Mutações somáticas neste gene são encontradas em, aproximadamente, 50% dos carcinomas humanos. No câncer de mama, a frequência das mutações no TP53 é em torno de 20 a 50%, sendo a alteração mais encontrada. Estas mutações podem alterar a conformação da proteína, prejudicando sua função de ativadora da transcrição de genes alvo e, pode levar a p53 a apresentar tendência à agregação. Neste trabalho, foi realizado a análise da presença de mutações nos exons 5 a 10 do gene TP53, em biópsias de câncer de mama, de mulheres residentes na cidade do Rio de Janeiro. Após a identificação das amostras com mutação em TP53, algumas foram selecionadas para se verificar o comportamento das diversas mutantes quanto à formação de agregados de p53, em cortes histológicos dos tumores de mama. Foram utilizados os anticorpos A11 e DO1, que reconhecem oligômeros pré-fibrilares e a p53 mutante ou selvagem, respectivamente. Para tanto, foi utilizado o ensaio de co-localização por imunofluorescência, utilizando microscópio confocal para a observação dos resultados. Mutações no gene TP53 foram detectadas em 19% dos casos analisados de câncer de mama sendo 88,2% do tipo &#8213;missense&#8214;. Estas mutações, em tumores do tipo carcinoma ductal infiltrante (CDI), estavam associadas a um estágio mais tardio e agressivo de câncer, representado pelo Grau III de Elston (p< 0,0001). Também foi observada relação positiva dos tumores com mutações e o acúmulo da p53 (p= 0,0184). Além disso, foi observado um padrão diferente das mutantes de p53 quanto à tendência a agregação, sendo as mutantes R273H e P278A as que apresentaram uma maior agregação. Assim, a agregação da p53 mutante observada &#8213;in vivo&#8214; e descrita nesta dissertação, parece depender do tipo de mutação observada nos casos de câncer de mama. / Breast cancer is the most frequent cancer in women, with 1 million of new cases in the world each year. The TP53 gene is responsible for the regulation of the cells fate in response to genotoxic and non-genotoxic stress. Somatic TP53 mutations are found in, approximately, 50% of human cancers. In breast cancer, TP53 mutation is the most frequent genetic alteration, being present in 20 to 50% of cases. These mutations may change the protein conformation, impairing the transcription of target genes, and may lead the mutant p53 to aggregate. In this study, we analyzed the presence of mutations in exons 5-10 of TP53 in breast cancer biopsies of women resident in the metropolitan area of Rio de Janeiro. After the determination of samples with mutation, some of them were selected to investigate the behavior of different mutants in the formation of p53 aggregates in tumors using A11 and DO-1 antibodies, which recognizes pre-fibrillar oligomers and mutant or wild-type p53, respectively. So, we utilized a immunofluorescence co-localization assay using confocal microscope. TP53 mutations were detected in 19% of the breast cancer cases, with 88.2% of missense type. These mutations, in tumors classified as infiltrating ductal carcinoma (CDI), were associated with a later and aggressive stage of cancer, represented by Elstons Grade III (p< 0.0001). A relation was also observed between these mutations and p53 accumulation (p= 0.0184). Furthermore, a different pattern of p53 mutants for the tendency to aggregate was observed and we detected that the mutants R273H and P278A showed a greater aggregation. Thus, the mutant p53 aggregation observed in vivo and described in this study, seems to depend on the type of mutation found in breast cancer cases.