Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1. / Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disorders associated with aging, reaching 2% at age 70. It is a disease characterized by progressive degeneration of nigra dopaminergic neurons in the basal ganglia and the presence of cytoplasmic protein inclusions known as Lewy bodies and neurites in surviving neurons. The etiology of PD is poorly understood, being considered, in most cases, idiopathic. Knowledge achieved in the last 15 years about the genetic basis of PD clearly shows that genetic factors play an important role in the etiology of this disorder. In this study, we screened mutations in genes that encode proteins participating in mitochondrial metabolic pathways (Parkin, PINK1 and DJ-1) in 136 Brazilian patients with early onset PD, through automatic sequencing and MLPA technique. We evaluated the presence of sequence variants by means of sequencing of exons 1 to 12 of Parkin gene and exons 1 to 8 of PINK1 gene. In Parkin gene were identified three pathogenic or potentially pathogenic mutations, both in heterozygous state: p.T240M, p.437L e p.S145N. In PINK1 gene we did not find pathogenic point mutations. Through the MLPA technique we investigated dosage changes in Parkin, PINK1 and DJ-1 genes. We identified five exon rearrangements in Parkin gene in four patients: a heterozygous duplication of exon 4 in patient PAR2256, a heterozygous deletion of exon 4 in proband PAR2099, a homozygous deletion of exon 4 in patient PAR3380 and a compound heterozygote (PAR2396) with two changes, a duplication of exon 3 and a deletion of exons 5 and 6. In PINK1 gene we identified a heterozygous deletion of exon 1, which has never been described in literature, in one patient (PAR2083). We found no quantitative change in DJ-1 gene. In this study, we obtained an overall frequency of pathogenic mutations (sequence and dosage) in the genes studied of 7.3%, being 6.6% in Parkin gene and 0.7% in PINK1 gene.

A obra O vendedor de passados, do escritor angolano José Eduardo Agualusa, tem como enredo um homem que tem o estranho ofício de comercializar passados. Os clientes normalmente costumam procurá-lo por questões de ordem financeira e social, tendo os novos passados a função de apresentá-los melhor à sociedade. A trama ganha novos contornos com a chegada de um estrangeiro que se coloca á disposição do vendedor para que este lhe atribuísse a identidade que considerasse a melhor. Questões referentes à identidade e suas implicações emergem. O processo, que a princípio parecia simples, torna-se cada vez mais obscuro. A memória atua como um dos fatores de maior interferência no procedimento, atribuindo a ele maior complexidade. As experiências do indivíduo também sofrem mutações com o procedimento de compra. E por fim, a identidade do sujeito sofre modificações com a obtenção de um novo passado. Tais questões que surgem em decorrência do peculiar comércio de passados serão foco de estudo da presente dissertação / The book The book of chameleons, by the Angolan writer José Eduardo Agualusa, has as story a man who has the estrange job of selling pasts. The costumers generally use to look for him because of financial and social issues, the new pasts have the function of introduce them better for the society. The story obtains new forms when a foreigner arrives. He doesnt tell de seller who is he, instead of that, he puts himself as a white paper for the seller tell him who he would be. Issues concerned to identity and its implications become very present. The process, which in the beginning seemed to be simple, become more and more complex. The memory acts as one of the factors of major interference on the procedure, making it more difficult. The persons experiences also changes because of the new past. And the identity has also modifications in the end. Such issues, that occur because of the different shopping of pasts will be focus of research in the present dissertation

Submitted by Nadia Maria Poloni null (nadiapoloni@gmail.com) on 2016-04-16T00:04:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Nadia Poloni - completa.pdf: 1931593 bytes, checksum: e8e92f6dc3b3aa46033959f97f62b795 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-18T12:53:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 polani_nm_me_ilha.pdf: 1931593 bytes, checksum: e8e92f6dc3b3aa46033959f97f62b795 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T12:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 polani_nm_me_ilha.pdf: 1931593 bytes, checksum: e8e92f6dc3b3aa46033959f97f62b795 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O fungo ascomiceto, Pyricularia oryzae, tem distribuição mundial como patógeno do arroz, mas recentemente emergiu como patógeno causando a brusone do trigo no Brasil. Os grupos de fungicidas estrobirulinas e triazóis tem sido intensivamente utilizados para manejo de doenças do trigo há cerca de três décadas. Há relato de resistência de P. oryzae do trigo a estrobirulinas no Brasil e a ineficácia dos fungicidas triazóis aponta para um cenário semelhante. Os triazóis, inibidores da desmetilação de esteróis (DMI), inibem a biossíntese de ergosterol e possuem como alvo a enzima 14α-demetilase, codificada pelo gene cyp51. Em nosso estudo, determinamos as distribuições de frequência da sensibilidade de 180 isolados de P. oryzae do trigo amostrados de sete estados do Centro-Sul do Brasil, com base na EC50 a tebuconazol e epoxiconazol. Descrevemos, também, a presença de mutações no gene cyp51A e reconstruímos sua filogenia reticulada para esclarecer a relação evolutiva entre haplotipos. Relatamos que todas as populações de P. oryzae amostradas se mostraram insensíveis aos fungicidas testados, comparando-se com as doses recomendadas para o manejo da doença no campo. Com base na sequência do gene cyp51A de P. oryzae do trigo, foram detectados oito haplotipos distintos. Foram encontradas sete mutações não-sinônimas, que podem estar correlacionadas com a resistência à DMI's. / The fungus ascomycete Pyricularia oryzae has worldwide distribution as rice pathogen, but it has recently emerged as pathogen causing wheat blast in Brazil. The strobirulin and azole fungicides have been intensively used for management of wheat diseases in the last three decades. The report of resistance of P. oryzae from wheat to strobirulins in Brazil and the inefficiency of azole fungicides indicates a similar scenario. The triazoles represented sterols demethylation inhibitor fungicides group (DMI), characterized by inhibiting the biosynthesis of ergosterol and their target is the 14α-demethylase enzyme, encoded by the cyp51 gene. We determined the azole sensitivity frequency distributions of 180 isolates of P. oryzae of wheat sampled in seven states of the south-central Brazil, based on the EC50 of tebuconazole and epoxiconazole. We described the presence of mutations in the cyp51A gene and built their reticulate phylogeny to identify the evolutionary relationship among haplotypes. We reported that all P. oryzae populations sampled were insensitive to the azoles when compared to the recommended doses for the management of the disease in the field. Based on the sequence of cyp51A gene from P. oryzae of wheat, eight distinct haplotypes were detected. We found seven non-synonymous mutations that could be correlated with resistance to DMI's.

Orientador: Paulo Cezar Ceresini / Resumo: O fungo ascomiceto, Pyricularia oryzae, tem distribuição mundial como patógeno doarroz, mas recentemente emergiu como patógeno causando a brusone do trigo noBrasil. Os grupos de fungicidas estrobirulinas e triazóis tem sido intensivamenteutilizados para manejo de doenças do trigo há cerca de três décadas. Há relato deresistência de P. oryzae do trigo a estrobirulinas no Brasil e a ineficácia dos fungicidastriazóis aponta para um cenário semelhante. Os triazóis, inibidores da desmetilaçãode esteróis (DMI), inibem a biossíntese de ergosterol e possuem como alvo a enzima14α-demetilase, codificada pelo gene cyp51. Em nosso estudo, determinamos asdistribuições de frequência da sensibilidade de 180 isolados de P. oryzae do trigoamostrados de sete estados do Centro-Sul do Brasil, com base na EC50 a tebuconazole epoxiconazol. Descrevemos, também, a presença de mutações no gene cyp51A ereconstruímos sua filogenia reticulada para esclarecer a relação evolutiva entrehaplotipos. Relatamos que todas as populações de P. oryzae amostradas semostraram insensíveis aos fungicidas testados, comparando-se com as dosesrecomendadas para o manejo da doença no campo. Com base na sequência do genecyp51A de P. oryzae do trigo, foram detectados oito haplotipos distintos. Foramencontradas sete mutações não-sinônimas, que podem estar correlacionadas com aresistência à DMI's. / Abstract: The fungus ascomycete Pyricularia oryzae has worldwide distribution as rice pathogen, but it has recently emerged as pathogen causing wheat blast in Brazil. The strobirulin and azole fungicides have been intensively used for management of wheat diseases in the last three decades. The report of resistance of P. oryzae from wheat to strobirulins in Brazil and the inefficiency of azole fungicides indicates a similar scenario. The triazoles represented sterols demethylation inhibitor fungicides group (DMI), characterized by inhibiting the biosynthesis of ergosterol and their target is the 14α-demethylase enzyme, encoded by the cyp51 gene. We determined the azole sensitivity frequency distributions of 180 isolates of P. oryzae of wheat sampled in seven states of the south-central Brazil, based on the EC50 of tebuconazole and epoxiconazole. We described the presence of mutations in the cyp51A gene and built their reticulate phylogeny to identify the evolutionary relationship among haplotypes. We reported that all P. oryzae populations sampled were insensitive to the azoles when compared to the recommended doses for the management of the disease in the field. Based on the sequence of cyp51A gene from P. oryzae of wheat, eight distinct haplotypes were detected. We found seven non-synonymous mutations that could be correlated with resistance to DMI's. / Mestre

O câncer de mama é o tipo mais frequente de neoplasia maligna entre as mulheres, com a incidência de mais de um milhão de novos casos no mundo, por ano. O gene TP53 é responsável por regular o destino da célula em resposta a estresses genotóxicos e não genotóxicos. Mutações somáticas neste gene são encontradas em, aproximadamente, 50% dos carcinomas humanos. No câncer de mama, a frequência das mutações no TP53 é em torno de 20 a 50%, sendo a alteração mais encontrada. Estas mutações podem alterar a conformação da proteína, prejudicando sua função de ativadora da transcrição de genes alvo e, pode levar a p53 a apresentar tendência à agregação. Neste trabalho, foi realizado a análise da presença de mutações nos exons 5 a 10 do gene TP53, em biópsias de câncer de mama, de mulheres residentes na cidade do Rio de Janeiro. Após a identificação das amostras com mutação em TP53, algumas foram selecionadas para se verificar o comportamento das diversas mutantes quanto à formação de agregados de p53, em cortes histológicos dos tumores de mama. Foram utilizados os anticorpos A11 e DO1, que reconhecem oligômeros pré-fibrilares e a p53 mutante ou selvagem, respectivamente. Para tanto, foi utilizado o ensaio de co-localização por imunofluorescência, utilizando microscópio confocal para a observação dos resultados. Mutações no gene TP53 foram detectadas em 19% dos casos analisados de câncer de mama sendo 88,2% do tipo &#8213;missense&#8214;. Estas mutações, em tumores do tipo carcinoma ductal infiltrante (CDI), estavam associadas a um estágio mais tardio e agressivo de câncer, representado pelo Grau III de Elston (p< 0,0001). Também foi observada relação positiva dos tumores com mutações e o acúmulo da p53 (p= 0,0184). Além disso, foi observado um padrão diferente das mutantes de p53 quanto à tendência a agregação, sendo as mutantes R273H e P278A as que apresentaram uma maior agregação. Assim, a agregação da p53 mutante observada &#8213;in vivo&#8214; e descrita nesta dissertação, parece depender do tipo de mutação observada nos casos de câncer de mama. / Breast cancer is the most frequent cancer in women, with 1 million of new cases in the world each year. The TP53 gene is responsible for the regulation of the cells fate in response to genotoxic and non-genotoxic stress. Somatic TP53 mutations are found in, approximately, 50% of human cancers. In breast cancer, TP53 mutation is the most frequent genetic alteration, being present in 20 to 50% of cases. These mutations may change the protein conformation, impairing the transcription of target genes, and may lead the mutant p53 to aggregate. In this study, we analyzed the presence of mutations in exons 5-10 of TP53 in breast cancer biopsies of women resident in the metropolitan area of Rio de Janeiro. After the determination of samples with mutation, some of them were selected to investigate the behavior of different mutants in the formation of p53 aggregates in tumors using A11 and DO-1 antibodies, which recognizes pre-fibrillar oligomers and mutant or wild-type p53, respectively. So, we utilized a immunofluorescence co-localization assay using confocal microscope. TP53 mutations were detected in 19% of the breast cancer cases, with 88.2% of missense type. These mutations, in tumors classified as infiltrating ductal carcinoma (CDI), were associated with a later and aggressive stage of cancer, represented by Elstons Grade III (p< 0.0001). A relation was also observed between these mutations and p53 accumulation (p= 0.0184). Furthermore, a different pattern of p53 mutants for the tendency to aggregate was observed and we detected that the mutants R273H and P278A showed a greater aggregation. Thus, the mutant p53 aggregation observed in vivo and described in this study, seems to depend on the type of mutation found in breast cancer cases.

A obra O vendedor de passados, do escritor angolano José Eduardo Agualusa, tem como enredo um homem que tem o estranho ofício de comercializar passados. Os clientes normalmente costumam procurá-lo por questões de ordem financeira e social, tendo os novos passados a função de apresentá-los melhor à sociedade. A trama ganha novos contornos com a chegada de um estrangeiro que se coloca á disposição do vendedor para que este lhe atribuísse a identidade que considerasse a melhor. Questões referentes à identidade e suas implicações emergem. O processo, que a princípio parecia simples, torna-se cada vez mais obscuro. A memória atua como um dos fatores de maior interferência no procedimento, atribuindo a ele maior complexidade. As experiências do indivíduo também sofrem mutações com o procedimento de compra. E por fim, a identidade do sujeito sofre modificações com a obtenção de um novo passado. Tais questões que surgem em decorrência do peculiar comércio de passados serão foco de estudo da presente dissertação / The book The book of chameleons, by the Angolan writer José Eduardo Agualusa, has as story a man who has the estrange job of selling pasts. The costumers generally use to look for him because of financial and social issues, the new pasts have the function of introduce them better for the society. The story obtains new forms when a foreigner arrives. He doesnt tell de seller who is he, instead of that, he puts himself as a white paper for the seller tell him who he would be. Issues concerned to identity and its implications become very present. The process, which in the beginning seemed to be simple, become more and more complex. The memory acts as one of the factors of major interference on the procedure, making it more difficult. The persons experiences also changes because of the new past. And the identity has also modifications in the end. Such issues, that occur because of the different shopping of pasts will be focus of research in the present dissertation

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1. / Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disorders associated with aging, reaching 2% at age 70. It is a disease characterized by progressive degeneration of nigra dopaminergic neurons in the basal ganglia and the presence of cytoplasmic protein inclusions known as Lewy bodies and neurites in surviving neurons. The etiology of PD is poorly understood, being considered, in most cases, idiopathic. Knowledge achieved in the last 15 years about the genetic basis of PD clearly shows that genetic factors play an important role in the etiology of this disorder. In this study, we screened mutations in genes that encode proteins participating in mitochondrial metabolic pathways (Parkin, PINK1 and DJ-1) in 136 Brazilian patients with early onset PD, through automatic sequencing and MLPA technique. We evaluated the presence of sequence variants by means of sequencing of exons 1 to 12 of Parkin gene and exons 1 to 8 of PINK1 gene. In Parkin gene were identified three pathogenic or potentially pathogenic mutations, both in heterozygous state: p.T240M, p.437L e p.S145N. In PINK1 gene we did not find pathogenic point mutations. Through the MLPA technique we investigated dosage changes in Parkin, PINK1 and DJ-1 genes. We identified five exon rearrangements in Parkin gene in four patients: a heterozygous duplication of exon 4 in patient PAR2256, a heterozygous deletion of exon 4 in proband PAR2099, a homozygous deletion of exon 4 in patient PAR3380 and a compound heterozygote (PAR2396) with two changes, a duplication of exon 3 and a deletion of exons 5 and 6. In PINK1 gene we identified a heterozygous deletion of exon 1, which has never been described in literature, in one patient (PAR2083). We found no quantitative change in DJ-1 gene. In this study, we obtained an overall frequency of pathogenic mutations (sequence and dosage) in the genes studied of 7.3%, being 6.6% in Parkin gene and 0.7% in PINK1 gene.

Esta tese aborda diversos temas em evolução molecular, usando extensivamente o formalismo de funções geratrizes para obter resultados analíticos sempre que possível. Em primeiro lugar, apresenta-se a solução exata para o comportamento dinâmico de uma população infinita de seqüências infinitamente longas (não há mutações reversas) evoluindo sob a ação de mutações deletérias em um relevo adaptativo multiplicativo ou truncado. Além disso, foi estudado o comportamento de uma população submetida a sucessivas diluições de intensidades arbitrárias, como ocorre em alguns protocolos de evolução experimental. Foram obtidas expressões matemáticas que, em princípio, podem ser úteis na caracterização de populações reais de microorganismos. Demonstrou-se também que um processo estocástico de ramificação multidimensional generalizado é uma excelente ferramenta para analisar numericamente os efeitos da degeneração mutacional (especificamente, de um fenômeno denominado catraca de Muller) em populações sob variadas condições de crescimento exponencial. Finalmente, simulações foram extensivamente utilizadas para analisar a história evolutiva de populações finitas e averiguar a possibilidade de certas grandezas, como certas medidas da topologia de árvores genealógicas, serem empregadas na elaboração de testes estatísticos capazes de detectar as marcas deixadas pela seleção natural. / This thesis discusses some topics of molecular evolution, extensively using generating function methods to find analytical results whenever possible. In first place, it gives the exact solution for the dynamics of an infinite population of infinitely long sequences (no back mutations) evolving under the action of deleterious mutations on either multiplicative or truncated fitness landscapes. In addition, the behavior of a population subject to successive dilutions of arbitrary intensity, just like some experimental evolution protocols, is found. The mathematical expressions, in principle, may prove useful in characterizing real populations of microor¬ganisms. It was also demonstrated that a generalized multidimensional branching process is a nice tool in numerically studying mutational degeneration effects (specifically a pheno¬menon called Muller\'s ratchet) in populations under a wide variety of exponential growth settings. Finally, the evolutionary history of finite populations was studied by simulations to probe the viability of certain statistic, like some topological measures in genealogical trees, being incorporated in statistical tests to detect the fingerprints of natural selection.

O objetivo deste estudo foi avaliar a plataforma OpenArray para testes genéticos em doadores de sangue e determinar as frequências genotípicas e alélicas de alterações pontuais (SNPs) associadas à trombose venosa (G1691A e G20210A), à hiperhomocisteinemia (C677T, A1298C), e à hemocromatose hereditária (C282Y, H63D e S65C) na população de doadores de sangue de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de outubro a novembro de 2011. A detecção dos SNPs foi realizada utilizando a tecnologia de microarray em superfície sólida OpenArray. As amostras também foram analisadas utilizando a técnica de PCR em Tempo Real sistema FRET para comparação dos resultados e determinação da acurácia do sistema OpenArray. Observamos que houve 100% de concordância de resultados entre ambas as técnicas para todas as amostras, em todas as variantes pesquisadas, com exceção da mutação C282Y no gene HFE, a qual apresentou 99,75% de concordância. O resultado da amostra em questão foi posteriormente confirmado por sequenciamento direto (Sanger), que confirmou o resultado fornecido pelo método OpenArray. As frequências calculadas para cada SNP foram: FV G1691A 98,8% (G/G), 1,2% (G/A); FII G2021A 99,5% (G/G), 0,5% (G/A); MTHFR C677T 45,5% (C/C), 44,8% (C/T), 9,8% (T/T); MTHFR A1298C 60,3% (A/A), 33,6% (A/C), 6,1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78,1%(C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/A), 1,9% (A/T). Esses resultados descrevem as frequências de SNPs associados a doenças e são importantes para aprimorar o conhecimento atual do perfil genético da população de doadores de sangue brasileiros, embora um estudo maior seja necessário para determinar com a maior acurácia a frequência das mutações pesquisadas. Além disso, observamos que a plataforma OpenArray, demonstrou alta taxa de concordância com o método de PCR em Tempo Real sistema FRET. / The aim of this study was to evaluate the OpenArray platform for genetic testing of blood donors and to assess the genotype frequencies of nucleotide-polymorphisms (SNPs) associated with venous thrombosis (G1691A and G20210A), hyperhomocysteinemia (C677T, A1298C), and hereditary hemochromatosis (C282Y, H63D and S65C) in blood donors from Sao Paulo, Brazil. We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. The blood samples were also examined using a real-time PCR-FRET system to compare the results and determine the accuracy of the OpenArray method. We observed 100% agreement in all assays tested, except HFE C282Y, which showed 99.75% agreement. The HFE C282Y assay was further confirmed through direct sequencing, and the results showed that OpenArray analysis was accurate. The calculated frequencies of each SNP were FV G1691A 98.8% (G/G), 1.2% (G/A); FII G2021A 99.5% (G/G), 0.5% (G/A); MTHFR C677T 45.5% (C/C), 44.8% (C/T), 9.8% (T/T); MTHFR A1298C 60.3% (A/A), 33.6% (A/C), 6.1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78.1%(C/C), 20.3% (C/G), 1.6% (G/G); and HFE S65C 98.1% (A/A), 1.9% (A/T).Taken together, these results describe the frequencies of SNPs associated with diseases and are important to enhance our current knowledge of the genetic profiles of Brazilian blood donors, although a larger study is needed for a more accurate determination of the frequency of the alleles. Furthermore, the OpenArray platform showed a high concordance rate with standard FRET RT-PCR

Submitted by Maryse Santos (maryseeu4@gmail.com) on 2016-09-02T15:09:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Matilde Contreras.pdf: 2282058 bytes, checksum: eae1f17b53a7e783e6a0d0a1bff74346 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:25:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Matilde Contreras.pdf: 2282058 bytes, checksum: eae1f17b53a7e783e6a0d0a1bff74346 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:31:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Matilde Contreras.pdf: 2282058 bytes, checksum: eae1f17b53a7e783e6a0d0a1bff74346 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T12:31:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Matilde Contreras.pdf: 2282058 bytes, checksum: eae1f17b53a7e783e6a0d0a1bff74346 (MD5) Previous issue date: 2013-05-17 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. Worldwide efforts to control leprosy with multidrug therapy (MDT), which is a combination of the drugs rifampin, dapsone and clofazimine, have led to a significant reduction in the detection of new cases in recent years. The current control measure for treating leprosy based mainly in MDT is designed to prevent the emergence, transmission and spread of resistant strains of M. leprae. Although resistance has been reported since 1964 to dapsone, since 1976 to rifampin and since 1994 to ofloxacin, determining the prevalence of drug resistance was made possible only with the advent of molecular biology techniques. It is known that mutations in the folp1 gene result in dapsone resistance. Mutations in the rpoB gene are responsible for rifampin resistance. Mutations in the gyrA gene are associated with fluoroquinolone resistance. The aim of this study was to identify mutations in the folp1, gyrA and rpoB genes of M. leprae from leprosy patients being treated at a reference center of dermatologic diseases in the state of Amazonas, Brazil. We utilized molecular biology techniques including conventional Polymerase Chain Reaction (PCR), Leprosy Drug Susceptibility-DNA microarray (LDS-DA) and DNA sequencing. Using the LDS-DA test two mutations in the rpoB gene were observed in two different samples. These mutations were confirmed by DNA sequencing. Through DNA sequencing four mutations in the folp1 gene five mutations in the gyrA gene and six mutations in the rpoB gene were detected. This included two samples that had mutations in both the gyrA and rpoB genes, indicating multidrug resistance (MDR). Primary and secondary drug resistance was confirmed using LDS-DA analysis and DNA sequencing in slit skin smear specimens obtained from leprosy patients, showing the spread of resistant strains of M. leprae in this area of Brazil and the importance to vary the treatment in these leprosy patients to prevent the dissemination of resistant leprosy bacilli. / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae. Os esforços globais no controle da hanseníase incluindo a poliquimioterapia (PQT) que consiste na combinação dos fármacos: rifampicina, dapsona e clofazimina têm levado à significativa redução na detecção de casos novos nos últimos anos. A atual estratégia para o controle da hanseníase está embasada principalmente na PQT e pretende prevenir o surgimento, a transmissão e a disseminação de cepas resistentes de M. leprae. Atualmente, sabe-se que mutações no gene folp1 de M. leprae resultam em resistência à dapsona. Mutações no gene rpoB são responsáveis pela resistência à rifampicina. Mutações no gene gyrA são correlacionadas com resistência às fluoroquinolonas. O objetivo deste estudo foi identificar mutações nos genes folp1, gyrA e rpoB do M. leprae de pacientes com hanseníase atendidos no centro de referência de doenças dermatológicas no estado do Amazonas, Brasil. Neste trabalho foram utilizadas técnicas da Biologia Molecular incluindo Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Leprosy Drug Suceptibility-DNA microarray (LSD-DA) e sequenciamento de DNA. Com o LSD-DA foram identificadas duas mutações no gene rpoB em dois diferentes amostras. Através do sequenciamento de DNA foram detectadas quatro mutações no gene folp1, cinco mutações no gene gyrA e seis mutações no gene rpoB. Nestes dados incluem-se duas amostras com mutações nos genes gyrA e rpoB, indicando multidroga resistência. Resistência primaria e secundária foi confirmada usando LDS-DA e sequenciamento de DNA em amostras de raspados dérmicos de pacientes com hanseníase, mostrando a disseminação de cepas resistentes de M. leprae nesta área do Brasil e a importância de avaliar o tratamento nestes pacientes para prevenir a disseminação de bacilos resistentes na hanseníase.