Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-13T13:41:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ODONTO_ Poliana Ramos Braga Santos.pdf: 1921456 bytes, checksum: c77e91196bc30a795d51c54281f7c04f (MD5) / Approved for entry into archive by Flávia Ferreira (flaviaccf@yahoo.com.br) on 2015-04-30T13:03:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_ODONTO_ Poliana Ramos Braga Santos.pdf: 1921456 bytes, checksum: c77e91196bc30a795d51c54281f7c04f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-30T13:03:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ODONTO_ Poliana Ramos Braga Santos.pdf: 1921456 bytes, checksum: c77e91196bc30a795d51c54281f7c04f (MD5) / CAPES / O objetivo desse trabalho foi avaliar o perfil de expressão dos microRNAs: miR-9, miR-16, miR-17, miR-132, miR-195 e miR-221 relacionados à ativação de mastócitos e a angiogênese em 31 amostras de tumores de glândulas salivares parafinadas, sendo 11 carcinomas adenóides císticos (CAC), 9 carcinomas mucoepidermóides (CME) e 11 adenomas plaomórficos (AP). Em adição, foi realizada uma investigação imuno-histoquímica para a detecção de mastócitos e de microvasos utilizando os marcadores mast cell tryptase e CD-34. Foi possível observar uma maior densidade de mastócitos entre os controles normais (2,12células/mm2) e os CME (10,55células/mm2) e, entre este último e o CAC (6,27células/mm2) e o AP (5,97células/mm2), sendo que o CME apresentou as maiores concentrações tanto peri (16,8células/mm2) quanto intratumorais (4,29células/mm2). Uma diferença significatica na densidade de microvasos foi observada entre os tumores malignos e benignos (p<0,001), bem como entre os controles (3,06microvasos/mm2) e os tumores, sendo que o CME (21,53 microvasos/mm2) apresentou os maiores índices quando comparado ao CAC (10,92microvasos/mm2) e ao AP (2,63microvasos/mm2). Foi observada também uma forte correlação positiva entre a densidade mastócitaria e a densidade de microvasos nos tumores analisados (ρ=0,601, Coeficiente de Spearman, p<0,001). Os microRNAs: miR-16, miR-17, miR-132, miR-195 e miR-221 apresentaram uma expressão diminuída, enquanto, o miR-9 apresentou uma expressão aumentada na maioria dos tumores quando comparados aos tecidos normais. Observou-se também uma diferença significativa na média de expressão do miR-9 (p=0,003), miR-17 (p=0,013), miR-132 (p=0,040) e miR-221 (p=0,032) entre os tumores e controles. Apenas o miR-9 apresentou uma correlação negativa estatisticamente significante com a densidade de microvasos nos tumores estudados (ρ= -0,533, Coeficiente de Spearman, p=0,001). Sendo assim, o estudo genético dos microRNAs parece contribuir para o entendimento de algumas das anormalidades que ocorrem em tumores de glândulas salivares podendo tornar-se fortes alvos terapêuticos no futuro.

Orientador: Luiz Cláudio Di Stasi / Banca: Sílvio Luis de Oliveira / Banca: Alessandra Gambero / Banca: Jairo Kenupp Bastos / Banca: Noeli Pereira Rocha / Resumo: As reações alérgicas afetam grande parte da população e tem aumentado nos últimos anos. Nesse sentido, a histamina liberada pelos mastócitos é um mediador importante e a procura por compostos que inibam a liberação do referido mediador se faz necessária tendo em vista que os tratamentos disponíveis apresentam limitações. Estudos prévios demonstraram que o extrato metanólico bruto da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa (ME) apresenta atividade inibitória sobre a liberação de histamina. Assim, o presente trabalho realizou o fracionamento biomonitorado do ME a fim de identificar a(s) frações mais ativa(s). As frações foram avaliadas em suspensão de mastócitos peritoneais de ratos Wistar machos desafiados com ionóforo A23187 e composto 48/80 (apenas as frações mais ativas). Posteriormente, a fração mais ativa foi avaliada em mastócitos sensibilizados com ovoalbumina (OVA). A dosagem de histamina foi realizada utilizando-se um sistema fluorimétrico automatizado e a análise fitoquímica por CG/EM. Os resultados mostraram que a fração acetato de etila foi a mais ativa e, na concentração de 100 g/mL inibiu em 78, 98 e 85% a liberação de histamina induzida pelo ionóforo A23187, composto 48/80 e OVA respectivamente. O fracionamento biomonitorado desta fração por cromatografia líquida sob vácuo (CLV) gerou seis sub-frações, das quais as mais ativas demonstraram ser constituídas por terpenos e ácidos graxos de cadeia longa / Abstract: Allergic reactions affect most of the population and has increased in recent years. Accordingly, histamine released by mast cells is an important mediator and search for compounds that inhibit release of that mediator is necessary in order that the treatments available have limitations. Previous studies demonstrated that the crude methanol extract of the stem bark of Hymenaea stigonocarpa (ME) has an inhibitory activity on the histamine release. Thus, the present study performed the bioguided fractionation of the ME in order to identify (s) most active fractions (s). The fractions were evaluated on the histamine release from rat peritoneum mast cells challenged with ionophore A23187 and compound 48/80 (only the most active fractions). Subsequently, the most active fraction was evaluated in mast cells sensitized with ovalbumin (OVA). The dosage of histamine was performed using an automated fluorimetric system and phytochemical analysis by GC/MS. The results showed that the ethyl acetate fraction was the most active and at concentration of 100 g/mL inhibited by 78, 98 and 85% histamine release induced by ionophore A23187, compound 48/80 and OVA, respectively. The bioguided-fractionatation of this fraction by vacuum liquid chromatography (VLC) generated six sub-fractions, of which the most actives showed the presence of terpenes and long chain fatty acids / Doutor

Orientadores: Maria Leticia Cintra, Oslei Paes de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-29T04:49:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Villar_CristinaCunha_M.pdf: 3307979 bytes, checksum: c4e54d6d6ec2b6dd6955628c3fc8dfd5 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea crônica, de causa desconhecida, que freqüentemente afeta a mucosa oral. Histologicamente, o LP apresenta diferentes graus de acantose e atrofia, com desorganização da camada basal e infiltrado inflamatório subepitelial em banda, composto principalmente de linfócitos T. Lesões semelhantes ao líquen plano, chamadas reações liquenóides, podem acometer a mucosa oral. As reações liquenóides podem estar associadas à desordens sistêmicas, como na doença do enxerto contra o hospedeiro crônica (GVHDc). Os achados histológicos da reação liquenóide associada à GVHDc são semelhantes aos encontrados no LP. O objetivo deste trabalho foi comparar as características microscópicas do LP e da GVHDc em boca. As alterações epiteliais e no tecido conjuntivo foram avaliadas em 40 casos de LP e 31 de GVHDc, assim como a presença de mastócitos, macrófagos e células de Langerhans (CL). As maiores diferenças entre as lesões foram observadas na região da junção epitélio tecido conjuntivo. No LP, o infiltrado inflamatório foi mais intenso, porém a desorganização e vacuolização das células da camada basal foram menos evidentes. Os mastócitos foram mais numerosos no LP, e apresentaram menor quantidade de grânulos quando observados no infiltrado inflamatório. As CL foram mais freqüentes no LP, e os macrófagos na GVHDc. A expressão de laminina foi similar nos dois grupos. Estes resultados mostram que a lesão liquenóide associada a GVHDc difere do LP, particularmente na junção epitélio-tecido conjuntivo. No LP, o infiltrado inflamatório é mais intenso, mas a expressão antigênica, possivelmente menor, gera alterações epiteliais mais discretas / Abstract: Lichen planus (LP) is a chronic mucocutaneous disease of unknown etiology, that frequently affects the oral mucosa. Microscopically, LP is characterized by areas of epithelial acantosis and atrophy, with disorganization of the basal layer, and by a subepithelial band-like mononuclear inflammatory infiltrate. Lichenoid lesion are diseases that present a similar pattern to LP, that can affect the mouth and skin, as Lichenoid lesions may be associated with chronic Graft versus Host Disease (cGVHD). The objective of this work was to compare the microscopic characteristics of LP and those of cGVHD in the oral mucosa. Epithelial and connective tissue alterations were evaluated in 40 cases of LP and in 31 cases of cGVHD, as well as the presence of mast cells, Langerhans cells (CL) and macrophages. The main differences found between the two diseases were at dermal-epithelial junction area. In LP the inflammatory infiltrate was more intense, but disorganization and vacuolization of the epithelial basal cells were less evident. Mast cells were more numerous in lichen planus, and showed less granules when observed in the inflammatory infiltrated. LC were more numerous in lichen planus and macrophages in cGVHD. The laminin expression was similar in both groups. From these observations it was concluded that lichenoid lesions of cGVHD of the oral mucosa differs from LP, particularly at the dermal-epithelial junction region. In LP the inflammatory infiltrate is more intense, but the antigenic expression possibly is less than in cGVHD, causing a more discrete epithelial cells alterations / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

Orientador: Renée Laufer Amorim / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: Os mastócitos são células provenientes do precursor CD34 da medula óssea, o mastocitoma (MCT) pertence ao grupo das neoplasias de células redondas e possui etiologia desconhecida, é a neoplasia cutânea mais comum em cães, sem predileção por raça, sexo ou idade. Seu comportamento biológico é bastante agressivo e de alta frequência. A graduação histopatológia proposta Patnaik et al., (1984), é o critério mais utilizado para a graduação histopatológica da neoplasia sendo o grau 1 uma neoplasia bem diferenciada, o grau 2 moderadamente diferenciada e o grau 3 pouco diferenciada ou anaplásica. O presente trabalho teve como objetivos a avaliação do ínidice proliferativo e apoptotico dos MCT em lâmina de Microarranjo de tecido (TMA) utilizando a técnica de imunoistoquiímica e TUNEL. Para tal utilizou-se 166 casos de MCT compondo um arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray (TMA) com 190 amostras, sendo avaliado o padrão de marcação da proteína Kit, a proliferação celular com o anticorpo primário Ki67 e apoptose com o anticorpo primário caspase-3 clivada e pela técnica da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick end Labeling Assey (TUNEL). Quando os casos foram avaliados quanto à imunoexpressão de c-KIT, os tumores (únicos e múltiplos) com expressão citoplasmática da proteína KIT tiveram uma taxa proliferativa maior e uma menor taxa apoptótica quando comparados aos com expressão membranosa. Os MCTs grau 3 tiveram um maior índice proliferativo (imunoexpressão de Ki67) quando comparados aos tumores de graus 1 e 2. Não foi observada correlação entre a imunomarcação do anticorpo primário caspase-3 clivada e a técnica de TUNEL, sendo que a técnica de TUNEL se mostrou mais eficaz na avaliação da apoptose que a imunomarcação para caspase-3 clivada / Abstract: Mast cells are from precursor CD34 cells bone marrow, the mast cell tumor (MCT) belongs to the group of round cell malignancies and has unknown etiology, is the most common skin cancer in dogs without distinction of race, sex or age. Its biological behavior is very aggressive and high frequency. The histopathological grading proposal from Patnaik et al., (1984), is the most commonly used criterion for the histopathological grade of the tumor is a tumor grade 1 are well-differentiated, grade 2 are moderately differentiated and grade 3 are poorly differentiated or anaplastic. This study aimed to evaluate the proliferative and apoptotic index of MCT in blade tissue microarray (TMA) using the TUNEL technique and immunohistochemistry. To this end we used 166 cases of MCT composing an tissue microarray (TMA) with 190 samples, and evaluated the pattern of protein labeling kit, cell proliferation, with the primary antibody Ki67 and apoptosis with primary antibody and cleaved caspase-3 by the technique of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling Mediated Assey (TUNEL). When the cases were evaluated for immunoexpression of c-KIT, tumors (single and multiple) with cytoplasmic KIT protein expression had a higher proliferative rate and a lower apoptotic rate when compared to those with membranous expression. Grade 3 MCTs had a greater proliferative index (Ki67 immunostaining) when compared with tumor grades 1 and 2. No correlation was observed between the immunostaining of primary antibody caspase-3 cleavage and TUNEL technique, and TUNEL technique was more effective in assessing apoptosis that immunostaining for cleaved caspase-3 / Mestre

Os mastócitos são células multifuncionais do sistema imunológico que participam em diversos processos biológicos. As funções dos mastócitos estão diretamente relacionados com a sua ativação e, subsequente, liberação de mediadores químicos. Os eventos iniciais da ativação dos mastócitos e da transdução de sinais ocorrem em microdomínios lipídicos (lipid rafts) da membrana plasmática. Os gangliosídeos derivados do GD1b são constituintes dos lipid rafts de mastócitos de roedores. O intercruzamento destes gangliosídeos pelo mAb AA4, resulta na formação de agregados (caps) na superfície celular e promove uma ativação parcial dos mastócitos, sem que ocorra a desgranulação. A ativação é semelhante a observada quando os FcRIs são intercruzados por antígenos multivalentes ligados a IgEs, mas neste caso ocorre a desgranulação. O presente estudo tem como objetivo caracterizar o papel dos gangliosídeos derivados do GD1b na liberação de mediadores de mastócitos da linhagem RBL-2H3. O intercruzamento dos gangliosídeos derivados do GD1b resulta na ativação dos fatores de transcrição NFAT e NFB e esta ativação é mediada pela proteína quinase Syk. A ativação destes fatores de transcrição resulta na liberação de mediadores neo-sintetizados, tais como: TNF-, interleucina (IL)-4. Por outro lado, o intercruzamento dos gangliosídeos derivados de GD1b não induz a liberação dos mediadores neoformados como o leucotrieno B4 (LTB4) e o leucotrieno C4 (LTC4). A agregação dos gangliosídeos derivados do GD1b resulta na desorganização dos lipid rafts e na redistribuição de seus componentes, como demostrado pela análise proteômica. Estes dados mostraram proteínas capazes de desencadear uma ativação parcial dos mastócitos e proteínas reguladoras negativas da desgranulação estão up reguladas, enquanto que proteínas críticas para a transdução do sinal estão down reguladas. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que os gangliosídeos derivados do GD1b desempenham papel crucial na integridade dos lipid rafts modulando a ativação e liberação de mediadores de mastócitos. / Mast cells are immunoregulatory cells that participate in diverse biological events. The action of mast cells is directly related to their activation and subsequent mediator release. Early signal transduction events occur in lipid rafts in the plasma membrane. GD1b-derived gangliosides are known constituents of lipid rafts in rodent mast cells. The cross-linking of these gangliosides by mAb AA4 results in a partial activation of mast cells similar to that observed when FcRIs are cross-linked, but does not result in the mast cell degranulation. With time, the gangliosides bound to mAb AA4 cap on the cell surface. The present study aims to characterize the role of the rodent mast cell specific gangliosides derived from GD1b in mediator release from RBL-2H3 mast cells. Cross-linking the GD1b-derived gangliosides activated the transcription factors NFAT and NFB and this activation was mediated by Syk. The activation of theses transcription factors by cross-linked GD1b-derived gangliosides results in the release of the neo-synthesized mediators TNF- and interleukin (IL)-4. However, cross-linking GD1b-derived gangliosides did not stimulate release of the newly formed mediators leukotriene B4 (LTB4) and leukotriene C4 (LTC4). Capping of GD1b-derived gangliosides disorganized lipid rafts and resulted in a redistribution of lipid raft components. Proteomic analysis showed that proteins that trigger mast cell activation and negative regulatory proteins of degranulation are up regulated, whereas proteins critical for signal transduction are down regulated in mast cells where the gangliosides are capped. The results of this work demonstrate that the mast cell-specific GD1b-derived gangliosides are crucial in maintaining the functional integrity of the lipid rafts and modulate cell activation and subsequent mediator release from mast cells.

Os mastócitos, em associação com outras células inflamatórias se acumulam em locais de tumor. Entretanto, pouco é conhecido sobre o papel exato dos mastócitos e de seus mediadores na progressão tumoral e angiogênese. Resultados recentes do nosso laboratório mostraram que a expressão das triptases específicas de mastócitos está correlacionada com a progressão tumoral (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Além do mais, existe uma associação entre mastócitos e a angiogênese tumoral. Então, tornou-se interessante investigar o papel das quimases específicas de mastócitos (mMCP-4 e -5) neste processo. Visto que estas quimases não são disponíveis comercialmente, a primeira etapa deste estudo foi produzir as quimases mMCP-4 e -5 recombinantes. Assim, as sequências dos genes respectivos para mMCP-4 e -5, além das sequências para seis resíduos de His e do sítio suscetível a enteroquinase foram clonadas no vetor de expressão pPIC9. A cepa GS115 de Pichia pastoris foi transformada com o respectivo vetor para mMCP-4 ou -5. Os clones transformados foram crescidos em meio BMMY e induzidos com várias concentrações de metanol para a produção de mMCP-4 ou -5 recombinantes. Depois de 96 horas, o meio foi centrifugado e as quimases mMCP-4 ou -5 foram purificadas do sobrenadante usando resina de níquel. A identidade das proteínas foi confirmada por Western Blotting usando o anticorpo anti-his, assim como os anticorpos anti-mMCP-4 e -5. As proteases foram ativadas pela clivagem do sítio suscetível a enteroquinase por cinco horas, a 22°C. A ativação das enzimas foi confirmada através da degradação de seus substratos específicos. Estes resultados mostram que P. pastoris é um organismo eficiente para a expressão de ambas as proteases. Estas proteases recombinantes se constituem em ferramentas importantes para se elucidar o papel da mMCP-4 ou -5 na angiogênese. / Mast cells, in association with other inflammatory cells, are known to accumulate at tumor sites. However, little is known about the exact role that mast cells and their mediators play in tumor progression and angiogenesis. Recent results from our laboratory have shown that expression of mast cell specific tryptases correlates with tumor progression (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Furthermore, there is an association between mast cells and tumor angiogenesis. It then became of interest to investigate the role of mast cell specific chymases (mMCP-4 and -5) in this process. Since these chymases are not commercially available, the first step in this study was to produce recombinant mMCP-4 and -5. The gene sequences for these chymases along with the sequence for six His residues and an enterokinase susceptible peptide were cloned into the expression vector pPIC9. The GS115 strain of Pichia pastoris was transformed with the respective vector for either rmMCP-4 or -5. The transformed clones were grown in BMMY media and induced to produce rmMCP-4 or -5 with various concentrations of methanol. After 96 hours, the medium was centrifuged and rmMCP-4 or -5 was purified from the supernatant using nickel-nitrilotriacetic acid agarose beads. The identity of the proteins was confirmed by Western blotting using an anti-his antibody as well as anti-mMCP-4 and -5. These results show that P. pastoris is an efficient organism in which to express both proteases.

A inflamação é uma resposta protetora para livrar o organismo da causa inicial da lesão celular e suas consequências, porem se excessiva e não modulada, pode provocar a destruição progressiva do tecido. Este estudo pretende contribuir para o esclarecimento da influência de dois anti-inflamatórios, a dexametasona e o diclofenaco sódico, sobre a fase inflamatória do processo reparativo tecidual, bem como sobre o número de mastócitos nas diferentes fases do reparo. Foram utilizadas 60 ratas Wistar, divididas em 3 grupos (1, 2 e 3), medicadas 30 minutos antes de uma intervenção cirúrgica (lesão de 3mm de diâmetro no ventre lingual), com injeção intramuscular de 0,235mg/kg de dexametasona; 4,45mg/kg de diclofenaco sódico ou solução salina estéril, respectivamente. Os 3 grupos foram subdivididos em a, b, c, d, de acordo com o tempo de sacrifício: 6, 24, 48 e 120 horas após a cirurgia. As lesões foram fotografadas logo no momento cirúrgico e no sacrifício e as fotos utilizadas para análise clínica do processo de reparo e morfometria. As línguas foram extirpadas e enviadas para processamento histológico, os cortes foram direcionados para coloração em hematoxilina-eosina e em Azul de Toluidina para evidenciação e contagem do número de mastócitos. As características do processo reparativo foram descritas por meio de avaliação qualitativa dos seguintes componentes: extensão de áreas necróticas; intensidade de edema intersticial; tipo e intensidade do infiltrado inflamatório; graus de reepitelização, tecido de granulação e neovascularização. Os cortes corados em HE também tiveram seus campos digitalizados e analisados morfometricamente, para quantificação da reepitelização, mensurações do tecido de granulação, celularidade e edema. Os resultados da análise histológica semiquantitativa evidenciaram que o diclofenaco e a dexametasona acarretaram menor infiltrado inflamatório em relação ao controle na fase inflamatória do reparo, porém na fase produtiva a dexametasona exibiu menor intensidade de reepitelização e de neovascularização em relação aos demais grupos. Os resultados da análise histomorfométrica mostraram significativamente menor edema no grupo do diclofenaco em 6h (p=0,0041) e em 24h (p=0,0429), bem como menor porcentagem da celularidade em 6 horas no grupo da dexametasona (p<0,0001). O grupo diclofenaco ainda exibiu menor área de lesão em 120h do que os demais grupos (p=0,0060), indicando maior eficiência de reparo. Quanto à quantidade de mastócitos em 24, 48 e 120 horas, o grupo controle exibiu significativamente os maiores valores (p<0,0001). Com base nesses resultados, conclui-se que o grupo da dexametasona apresentou pior desempenho em relação à reparação; que o diclofenaco sódico apresentou um melhor efeito sobre o fechamento da ferida cirúrgica e redução mais intensa do infiltrado inflamatório, e que ambos provocam redução de mastócitos na área lesionada. / Inflammation is a protective response to rid the body of the initial cause of cell damage and its consequences, but when excessive and unmodulated, may cause progressive destruction of tissue. The aim of this study is to clarify the influence of two anti-inflammatory, diclofenac sodium and dexamethasone on the inflammatory phase of tissue repair process, as well as on the number of mast cells in different stages of repair. It was used 60 Wistar rats, divided into 3 groups (1, 2 and 3), medicated 30 minutes before surgery (lesion 3 mm in diameter in the ventral tongue), with intramuscular injection of 0.235 mg / kg dexamethasone, 4, 45mg/Kg of diclofenac sodium or sterile saline, respectively. The 3 groups were subdivided into a, b, c, d, according to the time of sacrifice, 6, 24, 48 and 120 hours after surgery. The lesions were photographed immediately at surgical time and at sacrifice, the photos were used for clinical analysis of the repair process and morphometry. The tongues were excised and sent for histological processing, the slices were directed for staining with hematoxylin-eosin and toluidine blue, for disclosure and count of the number of mast cells. The characteristics of the repair process were described through qualitative evaluation of the following components: extension of necrotic areas; intensity of interstitial edema, type and intensity of inflammatory infiltrate; degrees of reepithelialization, granulation tissue and neovascularization. Slices stained with HE also had their fields scanned and analyzed morphometrically to quantify reepithelialization, measurements of the granulation tissue, cellularity and edema. The results of semiquantitative histological analysis showed that diclofenac and dexamethasone led to lower inflammatory infiltrate compared to control in the inflammatory phase of repair, although in the productive phase dexamethasone showed less intensity of reepithelialization and neovascularization compared to the other groups. The results of the histomorphometric analysis showed significantly less edema in the diclofenac group at 6h (p = 0.0041) and 24 (p = 0.0429), as well as a lower percentage of cellularity in 6 hours in the dexamethasone group (p <0.0001). The diclofenac group also exhibited lower lesion area at 120h than the other groups (p = 0.0060), indicating greater efficiency of repair. Regarding the quantity of mast cells 24, 48 and 120 hours, the control group exhibited significantly higher values (p <0.0001). Based on these results, we conclude that the dexamethasone group showed the worst performance in relation to repair; that diclofenac sodium showed a better effect on surgical wound closure and greater reduction of inflammatory infiltration, and that both cause a reduction of mast cells in the injured area.

Está estabelecido que o processo de glicosilação é essencial para a conformação estrutural e função efetora dos anticorpos. Entretanto, não está completamente claro como diferenças nos carboidratos ligados aos anticorpos podem interferir na sua atividade biológica. Foi previamente descrito que anticorpos IgG1 murinos podem ser divididos em anafiláticos ou não-anafiláticos, de acordo com a sua capacidade de induzir in vivo reação de anafilaxia. Somado a isso, foi verificado que a cadeia de oligossacarídeos N-ligada à molécula de IgG1 é fundamental para a manutenção da sua função efetora. O objetivo do presente trabalho é estudar diferenças estruturais entre os subtipos de IgG murinos que poderiam determinar a sua atividade biológica. O seqüenciamento dos nucleotídeos que codificam os domínios CH2 e CH3 dos dois subtipos de IgG1 permitiu constatar homologia de 100% dessas regiões nas duas moléculas estudadas. Entretanto, ao analisar o padrão de carboidratos N-ligados aos anticorpos IgG1 foi observado maior conteúdo de ácido siálico e fucose na cadeia N-ligada ao anticorpo anafilático em relação à do não-anafilático. Contudo, a remoção de resíduos de ácido siálico por tratamento enzimático do anticorpo IgG1 anafilático resultou na perda da capacidade desta molécula de induzir desgranulação celular in vitro e reação anafilática in vivo, semelhante ao anticorpo IgG1 deglicosilado. Em contraste, a remoção de fucose não afetou a sua função anafilática. A análise por PCR em tempo real da expressão dos genes das enzimas envolvidas no processo de glicosilação das proteínas revelou menor expressão gênica de algumas glicosidases, principalmente as sialiltransferases, no hibridoma e linfócitos B secretores do subtipo IgG1 não-anafilático em relação ao obtido no hibridoma e linfócitos B que secretam a IgG1 anafilática. Além disto, foi observada menor atividade enzimática das sialiltransferases obtidas do hibridoma produtor da IgG1 não-anafilática em relação à do hibridoma que produz a IgG1 anafilática. Em conjunto, estes resultados comprovam que a capacidade de anticorpos IgG1 murinos de induzir anafilaxia é diretamente dependente do conteúdo de ácido siálico presente na cadeia de oligossacarídeos ligada à região Fc do anticorpo, além disso sugerem fortemente que essa maior sialilação observada no tipo anafilático seja resultante da maior expressão gênica destas enzimas e assim da sua atividade enzimática no momento da síntese dos anticorpos. / It is well established that the glycosylation process is essential for the structural conformation and effector function of the antibodies. However, it is quite clear how differences in the carbohydrates attached to the antibodies may interfere with their biological activities. It was previously reported that murine IgG1 antibodies can be divided into anaphylactic or nonanaphylactic according to their ability to induce anaphylaxis. Furthermore, it was demonstrated that the oligosaccharide chain N-linked to the IgG1 is essential for its conformation and biological activity. The objective of this work is to study structural differences between these subtypes of murine IgG1 that could determine their biological activity. The sequencing of the nucleotides encoding the CH2 and CH3 domains of these two subtypes of IgG1 showed 100% of homology in the Fc regions of these molecules. In contrast, the analysis of the carbohydrates N-linked to the IgG1 antibodies demonstrated higher sialic acid and fucose contents in the chain attached to the anaphylactic antibody than in the nonanaphylactic IgG1. However, the removal of sialic acid residues by enzymatic treatment of anaphylactic IgG1 antibody resulted in the abrogation of its ability to induce mast cells degranulation in vitro and anaphylactic reaction in vivo as observed to deglycosylated IgG1 antibody. On the other hand, the removal of fucose did not change the anaphylactic activity. The analysis by real time PCR of the gene expression of enzymes that are involved in the protein glycosylation showed lower gene expression of some glycosyltransferases, mainly sialyltransferases, in the hybridoma and B lymphocytes that produce the non-anaphylactic IgG1 compared to those verified in the hybridoma and B cells producer of the anaphylactic IgG1. Furthermore, it was verified lower enzymatic activity of sialyltransferases purified from the hybridoma producer of the non-anaphylactic IgG1 in relation to the hybridoma producer of the anaphylactic antibody. Together, these results prove that the ability of murine IgG1 to induce anaphylaxis is directly dependent of the sialic acid content in the carbohydrate core attached to the antibody Fc region. It is also strongly suggested that this higher sialylation observed in the anaphylactic IgG1 may be resultant of the higher gene expression and enzymatic activity of some sialyltransferases during the antibody synthesis.

O veneno da Bothrops jararaca (VBj) causa inflamação aguda local. Os mastócitos secretam mediadores que desencadeiam a inflamação por sua ação direta ou pelo recrutamento de células. Este trabalho avalia o papel dos mastócitos na inflamação induzida por VBj em camundongos geneticamente selecionados para alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda. Os animais foram tratados com o inibidor de mastócito Cromoglicato de Sódio (CROM) e receberam o VBj, e apresentaram formação de edema similar em resposta ao veneno. Os animais AIRmax apresentaram maior dor que os AIRmin, sendo esta inibida por CROM. O VBj aumentou o número de células peritoneais em AIRmax, bem como o número de macrófagos, e diminuiu o número de mastócitos. O VBj também aumentou neutrófilos e a produção de ROS em AIRmax, efeito inibido por CROM. Os resultados mostram, portanto, que os animais AIRmax apresentam maior dor, migração de neutrófilos e macrófagos e produção de ROS que os AIRmin, e que essas reações são reduzidas quando os mastócitos são inibidos. / Bothrops jararaca venom (BjV) causes acute local inflammation. Mast cells acts secreting mediators that trigger inflammatory events through their direct action or the recruitment of other cells. This study aims to evaluate the role of mast cells in inflammation induced by BjV in mice genetically selected for maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory response. Animals were treated with mast cell degranulation inhibitor cromolyn (CROM) and received BjV, and showed similar edema formation in response to BjV. AIRmax mice exhibited greatest pain than AIRmin, which was inhibited by CROM. BjV increased peritoneal cells number in AIRmax, as well as the number of macrophages, and diminished the number of mast cells. BjV also increased neutrophils and ROS production in AIRmax, which was inhibited by CROM. These results shows, therefore, that AIRmax mice exhibit more pain, macrophage and neutrophil migration, and ROS production than AIRmin mice, being all these reactions reduced when mast cells are inhibited.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANNELISE CARRILHO CORREA DE CASTRO.pdf: 753705 bytes, checksum: 5d1101ab7100c09cec08b3f615f42a08 (MD5) Previous issue date: 2007-11-21 / Nifedipine is a diidropirine widely used for the control of arterial hypertension, wich because of its vessel dilating, in particular for the blockade by the entry of calcium. However, the chronic use of this calcium channel blocker is associated with the gingival overgrowth, resulting in the esthetic, phonetic and mastication problems. Data from the literature aren t unanimous in suggesting that cells density alterations of gingival tissues might be caused by nifedipine. The aim of this study was to analyze the variations in mast cells densities and associated with collagen and vasculature degrees of the gingival tissues by effect of nifedipine. In order to do so, fourteen samples of gingival tissue of patients undergoing chronic treatment with nifedipine were obtained. For comparative purposes, fifteen samples of gingival tissues of healthy patients who did not use drugs associated with gingival overgrowth were used. The samples were analysed in the department of oral pathology, Federal University of Goiás. The histochemical analysis of the collagen degree was made using picrosirius staining. To evaluate mast cells and blood vessels density, the samples were processed by standard immunoperoxidase immunohistochemical technique using mast cell tryptase and CD31 antibodies. The results showed that the number of tryptase-positive mast cells in nifedipine group was significantly higher than the number of tryptasepositive mast cells in the control group (Mann-Whitney test, P=0,02). However, there wasn t relationship between mast cells density and the degree of angiogenesis (Pearson test, P=0,3). The number of tryptase-positive mast cells was not correlated with collagen degree (Spearman test, P=0,6). Also there wasn t relationship between mast cells density and dose or duration of the nifedipine therapy (Pearson test, P=0,2 and P=0,7). Microscopic alterations observed in the connective tissue of nifedipine users suggest that this drug might be associated to alterations observed in tryptase-positive mast cells density. / A nifedipina é uma diidropiridina amplamente utilizada no tratamento antihipertensivo devido à sua ação vasodilatadora, especialmente, por bloquear o influxo de cálcio. Entretanto, o uso crônico deste bloqueador dos canais de cálcio está associado ao aumento da mucosa gengival, gerando problemas estéticos, fonéticos e mastigatórios. Os dados da literatura não são unânimes em sugerir que a nifedipina possa resultar na alteração da densidade celular do tecido gengival. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a densidade de mastócitos e sua relação com os processos de colagenização e vascularização no tecido gengival sob efeito da nifedipina. Para este fim, foram utilizadas 14 amostras de tecido gengival de pacientes usuários de nifedipina. Para fins comparativos, foram utilizadas 15 amostras de tecido gengival de indivíduos saudáveis. As amostras foram avaliadas no departamento de Patologia Bucal da Universidade Federal de Goiás. A análise histoquímica do grau de colagenização foi realizada por meio da coloração de picrosirius. Para a avaliação da densidade de mastócitos, foi realizado um estudo quantitativo destas células a partir da técnica imunoistoquímica com marcação pelo anticorpo anti-triptase. A mensuração da densidade de vasos sangüíneos foi avaliada através de técnica imunoistoquímica com marcação pelo anticorpo anti-CD 31. Os resultados revelaram que os pacientes usuários de nifedipina apresentavam um aumento estatisticamente significante do número de MCs-triptase+, quando comparados ao grupo controle (Mann-Whitney, P=0,02). No entanto, não houve correlação entre a densidade de vasos e a densidade de mastócitos (Teste de Pearson, P=0,3), assim como não houve correlação entre o grau de colagenização e a densidade de mastócitos (Teste de Spearman, P=0,6). Também não foi observada correlação entre a densidade de MCs e a dose e/ou duração da terapia com nifedipina (Teste de Pearson, P=0,2 e P=0,7, respectivamente). As alterações microscópicas observadas no tecido conjuntivo de pacientes usuários de nifedipina sugerem que esta medicação está relacionada às alterações na densidade dos MCs-triptase+.