Made available in DSpace on 2014-12-17T15:43:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HaroldoAOJ_DISSERT.pdf: 2217261 bytes, checksum: 1a1221344f95ad964f692521743b5714 (MD5) Previous issue date: 2013-03-01 / The regeneration of bone defects with loss of substance remains as a therapeutic challenge in the medical field. There are basically four types of grafts: autologous, allogenic, xenogenic and isogenic. It is a consensus that autologous bone is the most suitable material for this purpose, but there are limitations to its use, especially the insufficient amount in the donor. Surveys show that the components of the extracellular matrix (ECM) are generally conserved between different species and are well tolerated even in xenogenic recipient. Thus, several studies have been conducted in the search for a replacement for autogenous bone scaffold using the technique of decellularization. To obtain these scaffolds, tissue must undergo a process of cell removal that causes minimal adverse effects on the composition, biological activity and mechanical integrity of the remaining extracellular matrix. There is not, however, a conformity among researchers about the best protocol for decellularization, since each of these treatments interfere differently in biochemical composition, ultrastructure and mechanical properties of the extracellular matrix, affecting the type of immune response to the material. Further down the arsenal of research involving decellularization bone tissue represents another obstacle to the arrival of a consensus protocol. The present study aimed to evaluate the influence of decellularization methods in the production of biological scaffolds from skeletal organs of mice, for their use for grafting. This was a laboratory study, sequenced in two distinct stages. In the first phase 12 mice hemi-calvariae were evaluated, divided into three groups (n = 4) and submitted to three different decellularization protocols (SDS [group I], trypsin [Group II], Triton X-100 [Group III]). We tried to identify the one that promotes most efficient cell removal, simultaneously to the best structural preservation of the bone extracellular matrix. Therefore, we performed quantitative analysis of the number of remaining cells and descriptive analysis of the scaffolds, made possible by microscopy. In the second stage, a study was conducted to evaluate the in vitro adhesion of mice bone marrow mesenchymal cells, cultured on these scaffolds, previously decellularized. Through manual counting of cells on scaffolds there was a complete cell removal in Group II, Group I showed a practically complete cell removal, and Group III displayed cell remains. The findings allowed us to observe a significant difference only between Groups II and III (p = 0.042). Better maintenance of the collagen structure was obtained with Triton X-100, whereas the decellularization with Trypsin was responsible for the major structural changes in the scaffolds. After culture, the adhesion of mesenchymal cells was only observed in specimens deccelularized with Trypsin. Due to the potential for total removal of cells and the ability to allow adherence of these, the protocol based on the use of Trypsin (Group II) was considered the most suitable for use in future experiments involving bone grafting decellularized scaffolds / A regenera??o de defeitos ?sseos com perda de subst?ncia permanece um desafio terap?utico na ?rea m?dica. ? consenso ser o osso aut?geno, o material mais adequado para esta finalidade, por?m h? limita??es at? para o seu uso, especialmente a quantidade insuficiente no pr?prio doador. Pesquisas de engenharia tecidual evidenciam que os componentes da matriz extracelular (MEC) s?o geralmente conservados entre as diferentes esp?cies sendo bem toleradas, mesmo em receptores xen?genos. Assim, diversos estudos t?m sido realizados na busca por um arcabou?o substituto do osso aut?geno atrav?s da t?cnica de descelulariza??o. Para a obten??o destes arcabou?os, os tecidos devem passar por um processo de remo??o celular, que cause m?nimos efeitos adversos na composi??o, atividade biol?gica e integridade mec?nica na matriz extracelular remanescente. Entretanto, h? controv?rsias acerca do melhor protocolo de descelulariza??o, j? que cada um desses tratamentos interfere de maneira diferente na composi??o bioqu?mica, ultraestrutura e comportamento mec?nico da matriz extracelular, afetando o tipo de resposta imunol?gica ao material. Ademais o baixo arsenal de pesquisas envolvendo a descelulariza??o de tecidos ?sseos representa mais um obst?culo ? chegada de um consenso protocolar. O presente estudo teve como objetivo avaliar a influ?ncia dos m?todos de descelulariza??o na produ??o de arcabou?os biol?gicos a partir de ?rg?os ?sseos de camundongos, visando sua utiliza??o para enxertia. Trata-se de um estudo laboratorial, sequenciado em duas etapas distintas. Na primeira fase foram avaliadas 12 hemi-calv?rias de camundongos, divididas em tr?s grupos (n=4) e submetidas a tr?s diferentes protocolos de descelulariza??o (SDS [Grupo I], Tripsina [Grupo II], Triton X-100 [Grupo III]). Buscou-se identificar aquele que promove a mais eficiente remo??o celular, simultaneamente a melhor preserva??o estrutural da MEC ?ssea. Para tanto, foi realizada an?lise quantitativa do n?mero de c?lulas remanescentes e an?lise descritiva dos arcabou?os, possibilitadas por microscopia. Na segunda etapa, foi realizado um estudo in vitro para avaliar a ades?o de c?lulas mesenquimais da medula ?ssea de camundongos, cultivadas sobre arcabou?os previamente descelularizados. Atrav?s da contagem manual de c?lulas nos arcabou?os, verificou-se total remo??o celular no Grupo II, remo??o praticamente completa no Grupo I, e perman?ncia de c?lulas e remanescentes no Grupo III. Os achados permitiram observar diferen?a significativa apenas entre os Grupos II e III (p=0,042). Melhor manuten??o da estrutura col?gena foi obtida com o Triton X-100, ao passo que a descelulariza??o com Tripsina foi respons?vel pelas maiores altera??es estruturais nos arcabou?os. Ap?s o cultivo, a ades?o de c?lulas mesenquimais s? foi observada nas calv?rias descelularizadas com Tripsina. Devido ao potencial de remo??o total das c?lulas e ? capacidade de permitir a ades?o destas, o protocolo baseado no uso da Tripsina (Grupo II) foi considerado o mais adequado para uso em experimentos futuros, que envolvam enxertia de arcabou?os ?sseos descelularizados

A matriz extracelular e as células musculares lisas das vias aéreas estão intimamente interrelacionadas. Poucos estudos porém, avaliaram a composição dos diferentes componentes da matriz extracelular e seus reguladores na camada do músculo liso brônquico na asma. Utilizando um programa de análise de imagens, a área fracionada do colágeno total e das fibras elásticas foi quantificada no interior do músculo liso brônquico de 35 indivíduos que faleceram devido a um ataque de asma (Asma Fatal), e comparada com 10 casos de indivíduos com asma e que faleceram de outras causas (Asma Não Fatal), e com 22 indivíduos controles sem patologia pulmonar. Expressão dos colágenos I e III, fibronectina, versicam, metaloprotease (MMP)-1, 2, 9 e 12, e inibidores de metaloprotease 1 e 2 foram quantificados no interior do músculo liso brônquico de 22 casos de asma fatal e 10 controles. Nas grandes vias aéreas dos casos de asma fatal, a área fracionada das fibras elásticas foi significativamente maior na camada do músculo liso brônquico quando comparada com os grupos de Asma Não Fatal e Controle. Semelhantemente, fibronectina, MMP-9 e MMP-12 estavam aumentadas no músculo liso das grandes vias aéreas nos casos de asma fatal quando comparadas aos controles. Apenas aumento das fibras elásticas foi observado nas pequenas vias aéreas na Asma Fatal, e somente quando comparadas aos casos de Asma Não Fatal. O conjunto dos resultados mostra que há uma composição alterada dos elementos da matriz extracelular e um ambiente de degradação protéica no músculo liso brônquico de indivíduos que morreram por asma, o qual pode acarretar importantes conseqüências nas funções sintéticas e mecânicas do músculo liso das vias áreas. / There is an intimate relationship between the extracellular matrix (ECM) and smooth muscle cells within the airways. Few studies have comprehensively assessed the composition of different ECM components and its regulators within the airway smooth muscle (ASM) in asthma. With the aid of image analysis, the fractional area of total collagen and elastic fibres was quantified within the ASM of 35 subjects with Fatal Asthma (FA) and compared with 10 Nonfatal Asthma (NFA) patients and 22 nonasthmatic control cases. Expression of collagen I and III, fibronectin, versican, matrix metalloprotease (MMP)-1, 2, 9 and 12 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 and 2 was quantified within the ASM in 22 FA and 10 control cases. In the large airways of FA cases, the fractional area of elastic fibres within the ASM was increased compared with NFA and controls. Similarly, fibronectin, MMP-9 and MMP-12 were increased within the ASM in large airways of FA cases compared with controls. Elastic fibres were increased in small airways in FA only in comparison with NFA cases. The results shower that, there is altered extracellular matrix composition and a degradative environment within the airway smooth muscle in fatal asthma patients, which may have important consequences for the mechanical and synthetic functions of airway smooth muscle.

Em termos de importância no processo de invasão de tumores e metástases, o desequilíbrio entre a expressão das gelatinases e seus inibidores teciduais resulta em degradação do principal constituinte da matriz extracelular, o colágeno tipo IV, favorecendo os processos de invasão tumoral e metástase. Foram avaliadas 53 lesões de 47 cães submetidos a cirurgia excisional com confirmação diagnóstica de mastocitoma por avaliação histopatológica e imuno-histoquímica para MMP-2, MMP- 9, TIMP-2 e TIMP-1. Os mastocitomas foram classificados em graus I (bem diferenciados), II (moderadamente diferenciados) a III (pouco diferenciados), segundo os critérios estabelecidos por Patnaik, Ehler e Macewen (1984) e as mesmas lesões foram classificadas em alto e baixo grau de malignidade de acordo com o sistema proposto por Kiupel et al. (2011). Os resultados obtidos através da imuno-positividade de mastócitos e leucócitos polimorfonucleraes para as quatro proteínas foram comparados as duas graduações estabelecidas, bem como ao tempo de sobrevida pós-cirúrgica e a mortalidade em função do tumor. Verificou-se que as metaloenzimas e seus inibidores não demonstram nenhum tipo de associação de expressão entre elas. Dentre os marcadores imuno-histoquímicos, a expressão mastocitária de TIMP-1 apresentou associação com o tempo de sobrevida, independente do tratamento quimioterápico adjuvante. Quanto menor a expressão de TIMP-1 nos mastócitos, maiores as taxas de mortalidade e menores os períodos de sobrevida. Enquanto que MMP-2, MMP-9 e TIMP-2 não foram indicadores prognósticos para esta neoplasia. Assim, nossos resultados mostram que o TIMP-1 apresentou-se como bom indicador de sobrevida e, portanto, sugere-se que a utilização deste índice prognóstico adicional a classificação histológica pode aumentar a precisão de prognostico dos mastocitomas em cães auxiliando na adequação de terapias apropriadas / In terms of importance regarding to tumor invasion process and metastasis , the imbalance between the expression of gelatinases and their tissue inhibitors results in degradation of the main constituent of the extracellular matrix, collagen type IV, favoring the processes of tumor invasion and metastasis. Fifty-three lesions, of 47 dogs submitted to surgical excision confirmed the diagnosis of mast cell tumor were evaluated by histopathologic examination and immunohistochemistry for MMP-2, MMP-9, TIMP-2 and TIMP-1. Mast cell tumors were histologically classified as grades I (well differentiated), II (moderately differentiated) to III (poorly differentiated), according to the criteria established by Patnaik, Ehler and MacEwen (1984) and the same lesions were classified as high and low-grade of malignancy according to the system proposed by Kiupel et al. (2011). The results obtained by the immunopositivity of mast cells and polymorphonuclear leukocytes to the four proteins were compared with two established graduations, as well as to post-surgical survival times and mortality due to mast cell disease. It could be verified that metalloenzymes and their inhibitors do not establish any association between the expression of the cell types evaluated. Within the immunohistochemical markers, mast cell expression of TIMP-1 was associated with survival time, independent of adjuvant chemotherapy. The lower the expression of TIMP-1 in mast cells, higher the mortality rates and smaller post-cirurgical survival time. While MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 levels were not prognostic indicators for this cancer. Thus, our results show that the TIMP-1 appeared as a good indicator of survival time and therefore it is suggested that the use of this prognostic index as additional histological classification can increase the accuracy of prognosis of mast cell tumors in dogs assisting in the adaptation of appropriate therapies

O Trypanosoma cruzi libera para o meio, vesículas contendo material de sua superfície e aparentemente estas vesículas seriam uma maneira de ativar e preparar a célula hospedeira para a invasão, além de induzir um aumento na expressão de alguns componentes da matriz extracelular. Neste trabalho demonstramos que essas vesículas aumentam a expressão de fibronectina na matriz, sendo este aumento dose-dependente e linear ao longo do tempo. Porém, para laminina não conseguimos observar o mesmo comportamento. Nossos resultados também mostram que os constituintes lipídicos das vesículas podem ser os responsáveis pelo aumento da expressão de fibronectina em cultura de células epiteliais. Os dois grandes grupos de glicoproteínas encontradas na superfície do parasita e nas vesículas, mucinas e Tc85 não parecem estar envolvidos no processo. As culturas celulares tratadas com os lipídeos extraídos das vesículas apresentaram um aumento de fibronectina também dose-dependente, porém, com uma resposta linear ao longo do tempo e uma expressão máxima atingida em tempos menores / Trypanosoma cruzi releases to the environment plasma membrane vesicles. Apparently, these vesicles could be a signal released by the parasite to prepare the host cell for the invasion. This study demonstrated that these vesicles induce a dosisdependent expression of fibronectin, linear over time. The same behavior has not been observed for laminin. Our results also show that lipids from the vesicles are involved in the increase of expression of fibronectin by epithelial cells. The two major surface membrane glycoproteins, Tc85 and mucins, also present in the vesicles do not participate in this phenomenon. Cell cultures that have been treated with lipids extracted from T. cruzi membrane vesicles also provoked a dosis-dependent increase in fibronectin and linear over time

Metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco-dependentes conhecidas por degradar componentes do tecido conjuntivo em processos fisiológicos e patológicos. A regulação da atividade das MMPs pode ser feita pelos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). A doença periodontal (DP) é a inflamação crônica em que atividade excessiva das MMPs e mieloperoxidase (MPO) são apontadas como responsáveis pela destruição dos tecidos suporte dos dentes. Os componentes da saliva são derivados da vascularização local sendo possível encontrar neste fluido o reflexo de muitas moléculas presentes no plasma. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: 1) Comparar os níveis de MMPs, TIMPs e MPO na saliva total estimulada (STE) e plasma de pacientes com DP antes (DA) e após (DT) o tratamento periodontal não cirúrgico, e em voluntários saudáveis no início do estudo (CA) e após 3 meses (CT); 2) Avaliar se existe correlação entre os resultados. Foram realizadas as dosagens de MMP-8, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2 pelo método de ELISA; a atividade gelatinolítica das formas da MMP-9 por zimografia; e a atividade da MPO por ensaio colorimétrico. Houve uma menor atividade gelatinolítica, assim como menores concentrações de MMP-8 e TIMP-2 na STE de DT quando comparadas a DA (p < 0,05). A atividade de MPO foi superior no grupo DA em relação a CA (p < 0,05). Foram encontradas correlações moderadas e estatisticamente significantes entre a MMP-9 quantificada por ELISA no plasma e todos os parâmetros resultantes da zimografia de STE, isto é, MMP-9 de massa molecular de 92 kDa (r = 0,37, p = 0,002), 130 kDa (r = 0,35, p =0,003 ), a soma da sua atividade gelatinolítica (130 + 92 kDa) (r = 0,43, p = 0,0002), gelatinase de 180 kDa (r = 0,35, p = 0,003), e soma da atividade gelatinolítica total (180+130+92 kDa ) (r = 0,37, p = 0,002). A MMP-8 plasmática apresentou correlação com a atividade gelatinolítica das bandas de 92 kDa (r = 0,30 e p = 0,01) e soma da atividade gelatinolítica (130 + 92 kDa) (r = 0,24 e p= 0,04) presentes na STE. Também foi possível observar uma correlação fraca entre a atividade gelatinolítica da MMP-9 de 92 kDa do plasma e a atividade gelatinolítica da banda de 180 kDa (r = 0,26 e p = 0,03), e uma correlação moderada entre o TIMP-2 do plasma e o TIMP-2 da STE (r = 0,32 e p =0,04). Os resultados mostram que a atividade gelatinolítica da STE pode estar refletindo as concentrações de marcadores inflamatórios sistêmicos tais como a MMP-8 e MMP-9, assim como a concentração de TIMP-2 na STE pode estar refletindo a concentração de TIMP-2 circulante. A avaliação conjunta destes resultados sugere que existe uma atenuação de alguns dos marcadores inflamatórios analisados na STE e no plasma após o tratamento da DP, e que os níveis salivares e plasmáticos de alguns destes marcadores se correlacionam. Como a coleta de saliva é menos invasiva, mais estudos sobre a correlação destes marcadores nestes dois fluidos pode ser muito interessante. / Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of zinc-dependent endopeptidases known to cleave components of the connective tissue in physiological and pathological processes. The regulation of MMP activities is done by the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Periodontal disease (PD) is a chronic inflammation with excessive activity of MMPs, which degrade the tooth supporting tissues. The saliva components are derived from the local blood supply, and this fluid may therefore reflect the plasma. So, the objectives of this study were: 1) to compare the levels of MMPs, TIMPs and MPO in stimulated whole saliva (SWS) and plasma of PD patients before (PB) and 3 months after (PT) the non-surgical periodontal treatment, and in healthy volunteers at baseline (CB) and 3 months after baseline (CT), and 2) to evaluate the correlations between the results found. Measurements of MMP-8, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were performed by ELISA. Gelatinolitic activity of MMP-9 forms were determined by zymography, and the MPO activity was determined by colorimetric assay. There was lower gelatinolitic activity, and lower concentrations of MMP-8 and TIMP-2 in SWS on PT group compared with PB group (p <0.05). MPO activity was higher in PB compared to CB (p <0.05). Statistically significant moderate correlations were observed in all associations between MMP-9 performed by ELISA in plasma and gelatinolitic activity bands of STE: MMP-9 molecular form of 92 kDa (r = 0,37, p = 0,0017), MMP-9 molecular form of 130 kDa (r = 0,35, p = 0,003), the sum of its gelatinase activity (130 +92 kDa) (r = 0,43, p = 0,0002), gelatinase of 180 kDa (r = 0,35, p = 0,003), and the sum of total gelatinase activity (180+130+92 kDa) (r = 0,37, p = 0,002). Circulating MMP-8 levels correlate with salivary gelatinase activity bands of 92 kDa (r = 0,30, p = 0,01) and the sum of gelatinase activity (130 +92 kDa) (r = 0,24, p = 0,04). In addition, a weak correlation between gelatinase activity of plasmatic 92 kDa MMP-9 and gelatinase of 180 kDa in SWS (r= 0,26 p = 0,03) was found, and a moderate correlation between plasmatic TIMP-2 and TIMP-2 of SWS (r = 0,32, p = 0,004). The results show that the gelatinase activity of SWS may reflect the concentrations of systemic inflammatory markers such as MMP-8 and MMP-9, also the concentration of TIMP-2 in the SWS may reflect the circulating concentration of TIMP-2. The evaluation of these results suggests that there is an attenuation of some inflammatory markers analyzed in the SWS and in plasma after treatment of PD. Furthermore, there are correlations between salivary and plasma levels in some of these markers. Because saliva sampling is less invasive, more studies about the correlations between these markers in these two fluids are necessary.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-04-05T13:00:34Z No. of bitstreams: 1 Ivo Vieira de Sousa Neto - Disserta????o 2017.pdf: 2737065 bytes, checksum: 1cd7648ac58e3666049799e60c295c9a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T13:00:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ivo Vieira de Sousa Neto - Disserta????o 2017.pdf: 2737065 bytes, checksum: 1cd7648ac58e3666049799e60c295c9a (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Matrix metalloproteinases (MMPs) play an important physiological role in tissue remodeling. However, the effect of resistance training (RT) volume on MMP activity in different tissues and serum remains to be determined. Thus, the aim of the present study was to investigate the effects of different RT volume on MMP activity in skeletal muscle, visceral adipose tissue and in the circulation. Twenty-one four-month-old Wistar rats were randomly divided into three groups (n=7 per group): sedentary control (SC); RT with four ladder climbs (RT-4; 50%, 75%, 90% and 100% of their maximal carrying capacity) and TR with eight ladder climbs (RT-8 with two sets for each load). The eightweek RT consisted of climbing a 1.1-m vertical ladder with weights secured to the animals??? tails. MMP-2 and -9 activity were analyzed by zymography. RT-8 group displayed higher active MMP-2 activity as compared with SC and RT-4 in skeletal muscle (p < 0.05). There was no significant difference between groups for pro-MMP-2 and intermediate-MMP-2 activity in visceral adipose tissue, while RT-8 group presented lower active MMP-2 activity as compared with SC (p < 0.05). Plasma pro and active MMP-2 and MMP-9 activity was lower in RT-8 as compared with RT-4 (p < 0.05). These results suggest that higher volume RT is able to positively modulate the activity of MMPs in skeletal muscle (up-regulating), visceral adipose tissue and circulation (downregulating). These effects are important for the physiological and homeostatic functions of tissues. / As metaloproteinases de matriz (MMPs) desempenham papel fisiol??gico importante na remodela????o dos tecidos. Contudo, os efeitos do volume do treinamento de for??a (TF) sobre a atividade das MMPs em diferentes tecidos e na circula????o ainda precisam ser investigados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do TF em diferentes volumes sobre a atividade da MMPs no m??sculo esquel??tico, no tecido adiposo visceral e na circula????o. Vinte e um ratos Wistar de quatro meses de idade foram divididos aleatoriamente em tr??s grupos (n = 7 por grupo): controle sedent??rio (CS); TF com quatro escaladas (TF-4; 50%, 75%, 90% e 100% da capacidade de carga m??xima) e TF com oito escaladas (TF-8; com duas s??ries para cada carga). O TF de oito semanas consistiu em escalar uma escada vertical de 1,1 m com sobrecargas atadas ??s caudas dos animais. A atividade das MMP-2 e -9 foi analisada pela t??cnica de zimografia. TF-8 apresentou maior atividade da isoforma ativa da MMP-2 em compara????o com CS e TF-4 no m??sculo esquel??tico (p<0,05). N??o houve diferen??a significativa entre os grupos na atividade das isoformas pr?? e intermedi??ria da MMP-2 no tecido adiposo visceral; por outro lado, TF-8 apresentou menor atividade da isoforma ativa da MMP-2 quando comparado ao grupo CS (p<0,05). Em rela????o ??s isoformas pr?? e ativa da MMP-2 e MMP-9 na circula????o, TF-8 apresentou menor atividade em compara????o com TF-4 (p <0,05). Estes resultados sugerem que um maior volume de TF ?? capaz de modular, de forma positiva, a atividade da MMPs, principalmente a isoforma ativa da MMP-2 , tanto no m??sculo esquel??tico (aumentando) como no tecido adiposo visceral e circula????o (diminuindo), sendo estes efeitos importantes para as fun????es fisiol??gicas e homeost??ticas dos tecidos.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-10-30T11:56:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_EfeitoCombinadoExercicio.pdf: 1981802 bytes, checksum: 346bd99c27a8afade2424caa5ea11ae2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-10-30T14:50:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_EfeitoCombinadoExercicio.pdf: 1981802 bytes, checksum: 346bd99c27a8afade2424caa5ea11ae2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T14:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_EfeitoCombinadoExercicio.pdf: 1981802 bytes, checksum: 346bd99c27a8afade2424caa5ea11ae2 (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O acidente vascular cerebral (AVC) é a maior causa de mortes e incapacidades neurológicas no Brasil, e mais de 80% deles são decorrentes de evento isquêmico. Os sobreviventes de AVC apresentam uma variedade de déficits motores, cognitivos e sensoriais, que prejudicam suas atividades de vida diária, limitando assim sua independência. Portanto, torna-se cada vez mais necessário elaborar estratégias terapêuticas que promovam a recuperação funcional de pacientes acometidos por AVC. Após isquemia do tecido nervoso, ocorre no meio extracelular a super expressão de moléculas inibitórias a regeneração neuronal e à plasticidade sináptica, como os proteoglicanos de sulfato de condroitina (PGSCs), o principal componente das redes perineuronais (RPNs). A remoção destas moléculas com a ação da enzima condroitinase ABC (ChABC) tem sido usada como estratégia para induzir a plasticidade neuronal. Outro fator que tem sido utilizado para estimular a neuroplasticidade é o exercício físico específico para o membro afetado após AVC. O exercício físico está relacionado à liberação de neurotrofinas, importantes para a regeneração do sistema nervoso. Portanto, a remoção dos PGSCs junto com o exercício físico pode potencializar a indução da plasticidade cerebral e recuperação funcional após lesão isquêmica experimental na área sensório-motora de ratos. Para testar nossa hipótese, utilizamos n=16 ratos (Ratus norvergicus) da linhagem Wistar, divididos nos seguintes grupos experimentais (todos com sobrevida de 21 dias após AVC isquêmico): Grupo Controle ou BSA (Isquemia experimental, implante de Elvax saturado com BSA); Grupo Exercício (Isquemia experimental, implante de Elvax saturado com BSA + exercício físico específico); Grupo ChABC (Isquemia experimental, implante de Elvax saturado com ChABC); e Grupo ChABC + Exercício (Isquemia experimental, implante de Elvax saturado com ChABC + exercício físico específico). A lesão isquêmica foi induzida através de microinjeções do vasoconstritor Endotelina-1 (ET-1) no córtex sensório-motor, na representação da pata anterior. Logo em seguida foi implantado uma microfatia de polímero de Etileno vinil acetato saturado com ChABC (grupos ChABC e ChABC + Exercício) ou BSA (grupos Controle e Exercício). Foram avaliadas a área de lesão e a degradação dos PGSCs, além da recuperação funcional da pata afetada através do teste da exploração vertical e do teste da escada horizontal. Avaliamos a área de lesão (mm²) com auxílio do programa ImageJ (NIH, USA), delimitando a área com palor celular e também marcada com azul de colanil que estava presente na solução de injeção do peptídeo vasoconstritor ET-1 e verificamos que não houve diferença significativa no tamanho da área de lesão entre os grupos Controle (0,48±0,12), Exercício (0,46±0,05), ChABC (0,50±0,18) e ChABC + Exercício (0,55±0,05) (ANOVA, pós-teste de Tukey, ***p<0,001; **<0,01; *p<0,5). Animais que foram submetidos à remoção enzimática dos PGSCs apresentaram imunomarcação para o anticorpo anti-condroitin-4-sulfato (C4S) na área de lesão ao final da sobrevida, não havendo evidencias de degradação de PGSCs nos grupos Controle e Exercício. Verificamos ainda no teste do cilindro que a indução da lesão isquêmica não provocou perda funcional ampla, não alterando o comportamento exploratório, nem a frequência de uso da pata anterior afetada dos animais após a lesão (grupo Controle: pré-lesão ou baseline (0,33±0,10), 3 (0,29±0,17), 7 (0,30±0,10), 14 (0,29±0,16) e 21 (0,27±0,13) dias após a lesão; grupo Exercício: pré-lesão ou baseline (0,30±0,12), 3 (0,32±0,24), 7 (0,19±0,37), 14 (0,31±0,10) e 21 (0,32±0,09) dias após a lesão; grupo ChABC: pré-lesão ou baseline (0,34±0,07), 3 (0,20±0,11), 7 (0,23±0,07), 14 (0,33±0,14) e 21 (0,39±0,16) dias após a lesão; grupo ChABC + Exercício: pré-lesão ou baseline (0,34±0,04), 3 (0,20±0,09), 7 (0,26±0,04), 14 (0,18±0,08) e 21 (0,27±0,04) dias após a lesão) (ANOVA, pós-teste de Tukey, ***p<0,001; **<0,01; *p<0,5). O grupo que teve apenas a remoção dos PGSCs apresentou um melhor desempenho motor no teste da escada horizontal, mantendo sua frequência de acertos quando comparado aos demais grupos, sendo que ao final da sobrevida de 21 dias, os grupos Controle e ChABC + Exercício alcançaram uma recuperação espontânea (equivalente ao teste pré-lesão), se aproximando do grupo ChABC. Apenas o grupo tratado somente com Exercício não alcançou a recuperação espontânea, apresentando um desempenho motor significativamente inferior aos demais grupos em todos os momentos de reavaliação (grupo Controle: pré-lesão ou baseline (7,70±0,54), 3 (5,30±0,71), 7 (5,4±1,14), 14 (5,20±0,37) e 21 (6,70±0,48) dias após a lesão; grupo Exercício: pré-lesão ou baseline (8,40±0,28), 3 (4,30±0,48), 7 (4,75±0,50), 14 (5,35±0,41) e 21 (5,05±0,67) dias após a lesão; grupo ChABC: pré-lesão ou baseline (7,65±0,97), 3 (6,90±0,65), 7 (7,80±0,37), 14 (7,15±0,87) e 21 (7,45±0,32) dias após a lesão; e grupo ChABC + Exercício: pré-lesão ou baseline (8,10±0,22), 3 (3,65±1,48), 7 (4,95±1,06), 14 (7,35±0,37) e 21 (6,70±0,48) dias após a lesão (ANOVA, pós-teste de Tukey, ***p<0,001; **<0,01; *p<0,5). Portanto, a remoção dos PGSCs, o exercício físico forçado precoce e sua associação não influenciaram no tamanho da área de lesão após isquemia focal no córtex sensório-motor. Porém, apenas a remoção dos PGSCs das redes perineuronais melhorou precocemente o desempenho motor do membro afetado após isquemia focal no córtex sensório-motor. Enquanto que a remoção dos PGSCs associada ao exercício físico melhorou o desempenho motor do membro afetado após a lesão, porém essa melhora foi tardia. E o exercício físico aplicado precocemente após isquemia focal no córtex sensório-motor prejudicou o desempenho motor do membro afetado. / Cerebrovascular diseases are major cause of neurological disability and death in Brazil, and more than 80% of them are caused by ischemic stroke. The survivors subsist with a variety of sensory, cognitive and motor deficits. Therefore, it becomes necessary to develop therapeutic strategies to promote functional recovery in this patients. After ischemia, there is an increase in the inhibitory molecules expression as proteoglycans of chondroitin sulfate (CSPGs) presents in the extracellular matrix of the nervous tissue. The removal of these molecules, as well as physical exercise, have been used as strategy to induce another window of brain plasticity and improve functional recovery. In this work, we running experimental ischemic injury on sensorimotor areas forepaw representation (S1/M1) and tested associations between removal of CSPGs and physical exercise in n=16 Wistar rats (Rattus norvegicus). To delivery drugs to the forepaw representation in the cerebral cortex, we used a biomembrane previously ChABC-saturated or BSA-saturated and all animals had 21 days of survival divided in: Control group or BSA; Exercise group; ChABC group; and ChABC + Exercise group. The lesion area was no different across groups (control: 0,48±0,12; exercise: 0,46±0,05; ChABC: 0,50±0,18; ChABC+exercise: 0,50±0,18; ANOVA and Tukey post-test). Animals that were subjected to CSPGs enzymatic removal showed immunostaining for anti-chondroitin-4-sulphate (C4S) antibody in lesion area at the end of survival, with no evidence of CSPGs degradation in Control and Exercise groups. We evaluated the functional recovery of affected paw running vertical exploration test and ladder rung walking test. The vertical exploration test showed ischemic injury did not cause extensive functional loss, not changing exploratory behavior, or the use frequency of the affected forepaw after injury (Control group: baseline (0,03±0,10), 3d (0,29±0,17), 7d (0,30±0,10), 14d (0,29±0,16) e 21d (0,27±0,13) days after injury; Exercise group: baseline (0,30±0,12), 3d (0,32±0,24), 7d (0,19±0,37), 14d (0,31±0,10) e 21d (0,32±0,09) days after injury; ChABC group: baseline (0,34±0,07), 3d (0,20±0,11), 7d (0,23±0,07), 14d (0,33±0,14) e 21d (0,39±0,16) after injury; ChABC + Exercício group: baseline (0,34±0,04), 3d (0,20±0,09), 7d (0,26±0,04), 14d (0,18±0,08) e 21d (0,27±0,04) after injury (ANOVA and Tukey post-test). The group that only had removing CSPGs presented a better performance on Ladder rung walking test but at the end of the 21-day survival, the control groups and ChABC + Exercise reached a spontaneous recovery (equivalent to pre-injury test) reaching the ChABC group. The group treated with Exercise did not achieve the spontaneous recovery showing a motor performance significantly lower than other groups at all times of reevaluation (baseline: 8,40±0,28; 3d: 4,30±0,48; 7d: 4,75±0,50; 14d 5,35±0,41; 21d: 5,05±0,67; ANOVA and Tukey post-test). We conclude that the removal of CSPGs early improves motor performance in the affected forepaw after stroke on sensoriomotor cortex but associate with specific physical exercise doesn’t improve functional recovery.

Perdas gestacionais, malformações, restrição de crescimento intrauterino (IUGR) são associadas a gestações diabéticas. Para ampliar o conhecimento nesse tema, nosso grupo desenvolveu um modelo de gestação complicada por diabetes tipo 1 em camundongos que, nessa tese, foi utilizado para analisar o ciclo estral, desenvolvimento fetal e organização placentária. O diabetes foi induzido por aloxana e estudado em dois períodos 30-50D (curto prazo) e 90-110D (longo prazo). Placentas e fetos foram coletados, pesados, e submetidos a técnicas moleculares, bioquímicas e morfológicas. Detectaram-se alterações no perfil temporal do ciclo estral. O grupo 30-50D apresentou altas taxas de perdas embrionárias e IUGR, e o 90-110D malformações, mortes fetais, IUGR e aumento no peso placentário. As placentas diabéticas apresentaram aumento e desorganização da zona juncional, redução do labirinto e vasodilatação. A expressão dos colágenos I e III aumentou e a do V diminuiu em 30-50D, porém, a deposição destes aumentou concomitante com a redução da atividade da MMP9. A deposição dos colágenos III e V e a atividade da MMP2 aumentaram em 90-110D. Nossos resultados reiteram a importância do fator temporal nas complicações do diabetes sobre a gestação. / Gestational loss, malformations and intrauterine growth restriction (IUGR) are often associated with pregnancies. To increase the knowledge about this topic, our group has developed a model of pregnancy complicated by type 1 diabetes in mice. In this study, was analyzed the estrous cycle and the fetal and placental development. For this, diabetes was induced by alloxan and studied in two time-periods 30-50D (short term) and 90-110D (long term). Placentas and fetuses were collected, weighed and analyzed by biochemical, morphological and molecular procedures. We detected changes in the temporal profile of the estrous cycle. The 30-50D group showed high rates of embryonic loss and IUGR whereas malformations, fetal death, IUGR and increased placental weight was detected in 90-110D. Increase and disorganization of junctional zone, reducing labirinth and vasodilation characterize diabetic placentas. The expression of collagen I and III was increased whereas collagen V decreased in the 30-50D. The deposition of this collagen, however increased concomitant with the reduction of MMP9 activity. In 90-110D deposition of collagen III and V and the MMP2 activity was increased. Together, our results reinforce the relevance of the time factor in the complications of diabetes on pregnancy.

O Trypanosoma cruzi libera para o meio, vesículas contendo material de sua superfície e aparentemente estas vesículas seriam uma maneira de ativar e preparar a célula hospedeira para a invasão, além de induzir um aumento na expressão de alguns componentes da matriz extracelular. Neste trabalho demonstramos que essas vesículas aumentam a expressão de fibronectina na matriz, sendo este aumento dose-dependente e linear ao longo do tempo. Porém, para laminina não conseguimos observar o mesmo comportamento. Nossos resultados também mostram que os constituintes lipídicos das vesículas podem ser os responsáveis pelo aumento da expressão de fibronectina em cultura de células epiteliais. Os dois grandes grupos de glicoproteínas encontradas na superfície do parasita e nas vesículas, mucinas e Tc85 não parecem estar envolvidos no processo. As culturas celulares tratadas com os lipídeos extraídos das vesículas apresentaram um aumento de fibronectina também dose-dependente, porém, com uma resposta linear ao longo do tempo e uma expressão máxima atingida em tempos menores / Trypanosoma cruzi releases to the environment plasma membrane vesicles. Apparently, these vesicles could be a signal released by the parasite to prepare the host cell for the invasion. This study demonstrated that these vesicles induce a dosisdependent expression of fibronectin, linear over time. The same behavior has not been observed for laminin. Our results also show that lipids from the vesicles are involved in the increase of expression of fibronectin by epithelial cells. The two major surface membrane glycoproteins, Tc85 and mucins, also present in the vesicles do not participate in this phenomenon. Cell cultures that have been treated with lipids extracted from T. cruzi membrane vesicles also provoked a dosis-dependent increase in fibronectin and linear over time

Em termos de importância no processo de invasão de tumores e metástases, o desequilíbrio entre a expressão das gelatinases e seus inibidores teciduais resulta em degradação do principal constituinte da matriz extracelular, o colágeno tipo IV, favorecendo os processos de invasão tumoral e metástase. Foram avaliadas 53 lesões de 47 cães submetidos a cirurgia excisional com confirmação diagnóstica de mastocitoma por avaliação histopatológica e imuno-histoquímica para MMP-2, MMP- 9, TIMP-2 e TIMP-1. Os mastocitomas foram classificados em graus I (bem diferenciados), II (moderadamente diferenciados) a III (pouco diferenciados), segundo os critérios estabelecidos por Patnaik, Ehler e Macewen (1984) e as mesmas lesões foram classificadas em alto e baixo grau de malignidade de acordo com o sistema proposto por Kiupel et al. (2011). Os resultados obtidos através da imuno-positividade de mastócitos e leucócitos polimorfonucleraes para as quatro proteínas foram comparados as duas graduações estabelecidas, bem como ao tempo de sobrevida pós-cirúrgica e a mortalidade em função do tumor. Verificou-se que as metaloenzimas e seus inibidores não demonstram nenhum tipo de associação de expressão entre elas. Dentre os marcadores imuno-histoquímicos, a expressão mastocitária de TIMP-1 apresentou associação com o tempo de sobrevida, independente do tratamento quimioterápico adjuvante. Quanto menor a expressão de TIMP-1 nos mastócitos, maiores as taxas de mortalidade e menores os períodos de sobrevida. Enquanto que MMP-2, MMP-9 e TIMP-2 não foram indicadores prognósticos para esta neoplasia. Assim, nossos resultados mostram que o TIMP-1 apresentou-se como bom indicador de sobrevida e, portanto, sugere-se que a utilização deste índice prognóstico adicional a classificação histológica pode aumentar a precisão de prognostico dos mastocitomas em cães auxiliando na adequação de terapias apropriadas / In terms of importance regarding to tumor invasion process and metastasis , the imbalance between the expression of gelatinases and their tissue inhibitors results in degradation of the main constituent of the extracellular matrix, collagen type IV, favoring the processes of tumor invasion and metastasis. Fifty-three lesions, of 47 dogs submitted to surgical excision confirmed the diagnosis of mast cell tumor were evaluated by histopathologic examination and immunohistochemistry for MMP-2, MMP-9, TIMP-2 and TIMP-1. Mast cell tumors were histologically classified as grades I (well differentiated), II (moderately differentiated) to III (poorly differentiated), according to the criteria established by Patnaik, Ehler and MacEwen (1984) and the same lesions were classified as high and low-grade of malignancy according to the system proposed by Kiupel et al. (2011). The results obtained by the immunopositivity of mast cells and polymorphonuclear leukocytes to the four proteins were compared with two established graduations, as well as to post-surgical survival times and mortality due to mast cell disease. It could be verified that metalloenzymes and their inhibitors do not establish any association between the expression of the cell types evaluated. Within the immunohistochemical markers, mast cell expression of TIMP-1 was associated with survival time, independent of adjuvant chemotherapy. The lower the expression of TIMP-1 in mast cells, higher the mortality rates and smaller post-cirurgical survival time. While MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 levels were not prognostic indicators for this cancer. Thus, our results show that the TIMP-1 appeared as a good indicator of survival time and therefore it is suggested that the use of this prognostic index as additional histological classification can increase the accuracy of prognosis of mast cell tumors in dogs assisting in the adaptation of appropriate therapies