O estudo da dor abrange diferentes modelos e abordagens. A lesão de um nervo periférico esta relacionada a ocorrência de dor neuropática e a uma serie de alterações neuroquímicas e neuroanatômicas importantes, que se estendem desde o local da injúria nervosa ate os territórios de projeção central dos neurônios sensoriais. A medula espinal constitui um dos primeiros centros de processamento da informação nociceptiva, sendo de grande interesse o estudo dos possíveis moduladores neuroquímicos envolvidos neste processo. Dentre estes merecem destaque as espécies reativas de oxigênio (ROS), formadas durante o metabolismo energético celular e que em condições fisiológicas estão em equilíbrio com atividade de sistemas de defesa antioxidante. Em condições de dor neuropática tem se evidenciado um aumento na produção das ROS na medula espinal, decorrentes da diminuição de importantes sistemas antioxidantes e/ou de alterações no metabolismo energético deste tecido nervosa. Também a participag5o de vias de sinalização celular nos eventos que se seguem a lesão nervosa periférica tem sido descrita. Dentre estes, a ativação de vias de sobrevivência neuronal e também de moléculas pró-apoptóticas. Neste contexto, o presente estudo analisou os efeitos temporais da secc5o do nervo isquiático sobre as atividades das enzimas tiorredoxina redutase (TrxR) e glicose-6- fostato-desidrogenase (G6PDH), quantificação do antioxidante ácido ascórbico (AA), e determinação da expressão do fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (NrF2) e do fator de indução de apoptose (AIF) em medula espinal, nos intervalos de 3, 7 e 15 dias após a lesão periférica. Para isso, foram utilizados ratos Wistar, machos e adultos, subdivididos nos grupos controle (sem manipulação experimental), sham (sofreram apenas isolamento e manipulação do nervo isquiático) e denervado (submetidos à seção unilateral completa do nervo isquiático), com n=6 para cada grupo. Estes animais foram testados quanta a ocorrência de hipersensibilidade mecânica, pelo teste de Von Frey, e pelo teste da marca das patas, a fim de se obter o índice funcional do isquiático (IFI). Aos 3, 7 e 15 dias foi realizada a decapitag5o dos animais sham e denervado, e paralelamente do grupo controle, para remoção da medula espinal lombossacral que foi submetida as analises bioquímicas e de express5o protéica. Foi demonstrado que aos 3 e 7 dias os animais denervados apresentaram hipersensibilidade ao estimulo mecânico e que a secção do nervo ciático resultou na diminuição do IFI nestes animais em todos os períodos estudados. Já as alterações na atividade das enzimas TrxR e G6PDH ocorreram tanto nos animais denervados coma nos sham; a TrxR mostrou-se reduzida em todos os períodos experimentais, com uma leve restauração da atividade aos 15 dias nos animais sham, mesmo período em que a G6PDH apresentou redução na atividade nos grupos sham e denervado. O AA também diminuiu na medula espinal destes animais, nos períodos de 7 e 15 dias. Quanta a expressão protéica, observou-se um aumento na expressão do NrF2 aos 15 dias da secção do nervo isquiático na fração, citoplasmática do tecido nervosa espinal, enquanto o AIF não apresentou variag5o entre os grupos e períodos experimentais analisados. Estes resultados evidenciam que tanto a secção do nervo isquiático como a manipulação deste nervo constituem importantes estímulos para a modulação de sistemas enzimáticos e não enzimáticos na medula espinal, os quais podem estar intimamente relacionados as alterações no metabolismo da glicose e ativação de vias de sinalização celular. Neste contexto, o NrF2 parece estar sendo mobilizado para a recuperação da proteção antioxidante da medula espinal. No entanto, são necessárias análises complementares para melhor avaliar a participação deste fator de transcrição em períodos mais recentes, já que não foi evidenciada a indução de apoptose pela via do AIF neste tecido.

Diferentes modelos experimentais podem ser empregados no estudo da injúria às fibras nervosas periféricas, sendo este um modelo de dor neuropática. Inúmeros estudos vêm relatando a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) no processamento da informação nociceptiva e na perpetuação de anormalidades decorrentes da secção nervosa periférica (Kim et al, 2004; Gao et al, 2007). A informação nociceptiva percorre desde centros de processamento espinais até as regiões mais superiores do neuroeixo, incluindo o córtex cerebral. Neste sentido, alguns pesquisadores observaram que a axotomia periférica promove alterações em regiões supraespinais (Pankova, 2009; Taschibana et al, 2008). Porém são escassos ou mesmo inexistentes os trabalhos que avaliam o envolvimento das espécies reativas e das defesas antioxidantes neste modelo experimental, nas regiões encefálicas e, especialmente, em distintas espécies animais, o que proporcionaria uma abordagem comparativa. Assim, este trabalho avaliou parâmetros de estresse oxidativo e defesas antioxidantes em regiões encefálicas de duas espécies distintas de vertebrados, rãs e ratos, em condições basais e após a secção do nervo isquiático. Para tanto se empregaram ratos Wistar e rãs Rana catesbeiana, machos, adultos, os quais foram separados nos seguintes grupos experimentais: controle (animais sem qualquer manipulação cirúrgica) e desnervados (animais com secção do nervo isquiático). As diferentes espécies foram mortas por decapitação aos três e sete dias após os procedimentos cirúrgicos. Nos ratos ainda separou-se um grupo sham (animais onde o nervo foi exposto, porém não seccionado), sendo estes mortos nos mesmos intervalos de tempo. As estruturas nervosas centrais escolhidas para estudo foram o neocórtex e tronco encefálico, nos ratos, e prosencéfalo e tronco encefálico nas rãs. Para avaliação dos parâmetros oxidativos realizaram-se as medidas das atividades antioxidantes das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa transferase (GST), além da quantificação do teor de ácido ascórbico e grau de lipoperoxidação nas regiões encefálicas das diferentes espécies. No encéfalo de ratos e rãs em estado basal, a SOD e o ácido ascórbico apresentaram valores semelhantes entre as espécies, com concentração de ácido ascórbico ligeiramente maior em tronco encefálico de rãs. As atividades da GST e CAT foram peculiares entre as espécies de animais, sendo o valor da atividade da CAT aproximadamente o dobro daquele observado em rato nas duas regiões encefálicas, e o da GST maior apenas no prosencéfalo de rãs. Aos três dias após a secção do nervo isquiático, observou-se aumento significativo da lipoperoxidação nas duas regiões encefálicas de ratos, porém nas rãs este acréscimo foi observado aos 3 e 7 dias no prosencéfalo e apenas aos 3 dias no tronco encefálico. Nos ratos a atividade da CAT aumentou apenas no córtex, não mostrando qualquer modificação significativa nos tecidos de rãs. A enzima SOD mostrou aumento em sua atividade nas duas regiões encefálicas de ratos nos períodos experimentais em estudo, mas teve esta atividade reduzida nas regiões encefálicas de rãs aos 3 dias após a axotomia periférica. Os ratos do grupo sham também mostraram aumentos em seus valores de lipoperoxidação nas regiões estudadas, mas apenas aos 3 dias após a lesão. Os valores de ácido ascórbico não variaram significativamente nas regiões do encéfalo de ratos, mas tiveram aumento significativo nas regiões de rãs aos 7 dias. Diferentemente dos ratos, as regiões encefálicas de rãs diminuíram a atividade da GST aos 3 dias após a secção nervosa periférica. Estes resultados mostram que a secção nervosa periférica, bem como as diferentes intensidades de estimulação nociceptiva (grupos sham e desnervado), é capaz de alterar o estado redox das células em estruturas encefálicas de distintas espécies de vertebrados. Além disso, a injúria nervosa periférica parece ativar diferentes mecanismos de defesa antioxidante no encéfalo de rãs e ratos.

Estudos mostram o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (EROs) nos distintos tipos de dor, porém ainda se desconhece o papel efetivo dessas espécies no sistema nervoso central (SNC). Um modelo para o estudo da dor neuropática (dor originada como consequência direta de uma lesão ou doença afetando o sistema somatossensorial, em seus elementos periféricos ou no SNC) é a constrição nervosa periférica. Nesta condição um quadro de estresse oxidativo é estabelecido no local da lesão. A administração de N-acetilcisteína (NAC) tem efeito analgésico nesses animais, o qual parece resultar do papel antioxidante dessa molécula no local da lesão. Como a NAC atravessa a barreira hematencefálica, a hipótese do presente estudo foi que o efeito analgésico dessa molécula também envolveria ação no SNC. Assim, este trabalho avaliou os efeitos temporais da administração intraperitoneal de NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, sobre parâmetros nociceptivo e de estresse oxidativo e nitrosativo em medula espinal de ratos com constrição no nervo isquiático direito. Como controle foi utilizado administração de solução salina nas mesmas condições. O projeto que antecedeu o presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso de animais da UFRGS (número de protocolo: 19037). Para a realização desse estudo 72 ratos Wistar machos, pesando 200-300g, foram divididos em 3 grupos (n=24/grupo): controle (animais que não sofreram nenhuma intervenção cirúrgica), sham (animais onde o nervo isquiático direito foi exposto, mas não sofreu constrição) e com constrição nervosa (animais onde o nervo isquiático direito foi exposto e recebeu 4 amarraduras em seu terço inicial). Estes grupos experimentais foram subdivididos em subgrupos (n=6/subgrupo) que receberam administração intraperitoneal de solução salina ou de NAC, na dose de 150 mg/Kg/dia, por período de 3 e 10 dias. Os testes de Von Frey e da placa quente avaliaram as sensibilidades mecânica e térmica, respectivamente, antes da lesão e 1 e 3 dias, e 1, 3, 5, 7 e 10 dias após a lesão periférica nos grupos 3 e 10 dias, respectivamente. Após, os animais foram decapitados, a medula espinal lombossacral retirada e usada para as determinações de peróxido de hidrogênio (H2O2) (técnica de oxidação do vermelho fenol), atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx, pela técnica descrita por Flohé e Gunzler, 1984) e glutationa transferase (GST, pela técnica descrita por Habig, 1974), razão entre glutationa reduzida e oxidada (GSH/GSSG, conforme técnica descrita por Akerboom e Sies, 1981), e nitritos+nitratos (pela reação de Griess). De cada animal ainda foi coletada uma amostra de sangue para avaliação de indicadores plasmáticos de função hepática (gama glutamiltransferase, transaminase glutâmica oxalacética, transaminase glutâmica pirúvica e bilirrubina) e renal (creatinina), por meio de utilização de kits comerciais. Foi coletada também uma amostra de fígado dos ratos que receberam administração de solução salina e de NAC nos intervalos considerados nesse estudo para determinação da morfologia dos hepatócitos pela técnica de hematoxilina e eosina. As sensibilidades aumentaram no dia 1 pós-lesão nos grupos constrição nervosa, e permaneceram elevadas nos demais períodos analisados apenas no grupo constrição nervosa tratado com solução salina. No grupo constrição nervosa que recebeu tratamento com NAC, os valores das sensibilidades foram similares aos do pré-lesão nos períodos de 3, 5, 7 e 10 dias. No grupo sham, o aumento da sensibilidade mecânica ocorreu apenas no dia 1, permanecendo nos demais períodos analisados similar ao valor pré-lesão, tanto nos ratos tratados com solução salina como naqueles que receberam NAC. Porém, enquanto a sensibilidade térmica aumentou nos períodos de 3 e 5 dias após a lesão tecidual nos ratos tratados com NAC, nenhuma alteração significativa ocorreu no grupo que recebeu solução salina (ANOVA de amostras repetidas, p<0,05). Paralelamente a estas alterações de sensibilidades, na medula espinal lombossacral ocorreu redução estatisticamente significativa nos valores de H2O2 nos grupos com constrição nervosa, independente do tratamento recebido, nos períodos de 3 e 10 dias. A razão GSH/GSSG aumentou significativamente aos 3 dias após a constrição nervosa nos animais que receberam solução salina. Nesse mesmo período ocorreu aumento estatisticamente significativo na atividade da GST nesses animais. A atividade dessa enzima também teve acréscimo nos ratos Sham que receberam solução salina e nos animais constrição nervosa tratados com NAC, ambos por 10 dias. Nesse mesmo período, a atividade da GPx estava significativamente aumentada nesses grupos experimentais (sham tratado com solução salina e constrição nervosa tratado com NAC). Os valores de nitritos+nitratos aumentaram significativamente apenas no grupo constrição nervosa que recebeu administração de solução salina por 3 dias. Nesse período, os valores desses metabólitos estavam significativamente reduzidos nos grupos constrição nervosa e sham tratados com NAC. Aos 10 dias, foi observada redução significativa nos valores de nitritos+nitratos apenas no grupo sham tratado com solução salina (ANOVA de três vias, seguida do pós-teste de Tukey, p< 0,05). Estes resultados mostram que a administração intraperitoneal de NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, reproduz o efeito analgésico dessa molécula e modifica parâmetros de estresse oxidativo e nitrosativo na medula espinal, os quais possivelmente se relacionam com as mudanças de sensibilidades nos ratos sham e com constrição nervosa. Assim, o efeito analgésico da NAC também envolve sua ação no SNC.

O estudo da dor abrange diferentes modelos e abordagens. A lesão de um nervo periférico esta relacionada a ocorrência de dor neuropática e a uma serie de alterações neuroquímicas e neuroanatômicas importantes, que se estendem desde o local da injúria nervosa ate os territórios de projeção central dos neurônios sensoriais. A medula espinal constitui um dos primeiros centros de processamento da informação nociceptiva, sendo de grande interesse o estudo dos possíveis moduladores neuroquímicos envolvidos neste processo. Dentre estes merecem destaque as espécies reativas de oxigênio (ROS), formadas durante o metabolismo energético celular e que em condições fisiológicas estão em equilíbrio com atividade de sistemas de defesa antioxidante. Em condições de dor neuropática tem se evidenciado um aumento na produção das ROS na medula espinal, decorrentes da diminuição de importantes sistemas antioxidantes e/ou de alterações no metabolismo energético deste tecido nervosa. Também a participag5o de vias de sinalização celular nos eventos que se seguem a lesão nervosa periférica tem sido descrita. Dentre estes, a ativação de vias de sobrevivência neuronal e também de moléculas pró-apoptóticas. Neste contexto, o presente estudo analisou os efeitos temporais da secc5o do nervo isquiático sobre as atividades das enzimas tiorredoxina redutase (TrxR) e glicose-6- fostato-desidrogenase (G6PDH), quantificação do antioxidante ácido ascórbico (AA), e determinação da expressão do fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (NrF2) e do fator de indução de apoptose (AIF) em medula espinal, nos intervalos de 3, 7 e 15 dias após a lesão periférica. Para isso, foram utilizados ratos Wistar, machos e adultos, subdivididos nos grupos controle (sem manipulação experimental), sham (sofreram apenas isolamento e manipulação do nervo isquiático) e denervado (submetidos à seção unilateral completa do nervo isquiático), com n=6 para cada grupo. Estes animais foram testados quanta a ocorrência de hipersensibilidade mecânica, pelo teste de Von Frey, e pelo teste da marca das patas, a fim de se obter o índice funcional do isquiático (IFI). Aos 3, 7 e 15 dias foi realizada a decapitag5o dos animais sham e denervado, e paralelamente do grupo controle, para remoção da medula espinal lombossacral que foi submetida as analises bioquímicas e de express5o protéica. Foi demonstrado que aos 3 e 7 dias os animais denervados apresentaram hipersensibilidade ao estimulo mecânico e que a secção do nervo ciático resultou na diminuição do IFI nestes animais em todos os períodos estudados. Já as alterações na atividade das enzimas TrxR e G6PDH ocorreram tanto nos animais denervados coma nos sham; a TrxR mostrou-se reduzida em todos os períodos experimentais, com uma leve restauração da atividade aos 15 dias nos animais sham, mesmo período em que a G6PDH apresentou redução na atividade nos grupos sham e denervado. O AA também diminuiu na medula espinal destes animais, nos períodos de 7 e 15 dias. Quanta a expressão protéica, observou-se um aumento na expressão do NrF2 aos 15 dias da secção do nervo isquiático na fração, citoplasmática do tecido nervosa espinal, enquanto o AIF não apresentou variag5o entre os grupos e períodos experimentais analisados. Estes resultados evidenciam que tanto a secção do nervo isquiático como a manipulação deste nervo constituem importantes estímulos para a modulação de sistemas enzimáticos e não enzimáticos na medula espinal, os quais podem estar intimamente relacionados as alterações no metabolismo da glicose e ativação de vias de sinalização celular. Neste contexto, o NrF2 parece estar sendo mobilizado para a recuperação da proteção antioxidante da medula espinal. No entanto, são necessárias análises complementares para melhor avaliar a participação deste fator de transcrição em períodos mais recentes, já que não foi evidenciada a indução de apoptose pela via do AIF neste tecido.

Diferentes modelos experimentais podem ser empregados no estudo da injúria às fibras nervosas periféricas, sendo este um modelo de dor neuropática. Inúmeros estudos vêm relatando a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) no processamento da informação nociceptiva e na perpetuação de anormalidades decorrentes da secção nervosa periférica (Kim et al, 2004; Gao et al, 2007). A informação nociceptiva percorre desde centros de processamento espinais até as regiões mais superiores do neuroeixo, incluindo o córtex cerebral. Neste sentido, alguns pesquisadores observaram que a axotomia periférica promove alterações em regiões supraespinais (Pankova, 2009; Taschibana et al, 2008). Porém são escassos ou mesmo inexistentes os trabalhos que avaliam o envolvimento das espécies reativas e das defesas antioxidantes neste modelo experimental, nas regiões encefálicas e, especialmente, em distintas espécies animais, o que proporcionaria uma abordagem comparativa. Assim, este trabalho avaliou parâmetros de estresse oxidativo e defesas antioxidantes em regiões encefálicas de duas espécies distintas de vertebrados, rãs e ratos, em condições basais e após a secção do nervo isquiático. Para tanto se empregaram ratos Wistar e rãs Rana catesbeiana, machos, adultos, os quais foram separados nos seguintes grupos experimentais: controle (animais sem qualquer manipulação cirúrgica) e desnervados (animais com secção do nervo isquiático). As diferentes espécies foram mortas por decapitação aos três e sete dias após os procedimentos cirúrgicos. Nos ratos ainda separou-se um grupo sham (animais onde o nervo foi exposto, porém não seccionado), sendo estes mortos nos mesmos intervalos de tempo. As estruturas nervosas centrais escolhidas para estudo foram o neocórtex e tronco encefálico, nos ratos, e prosencéfalo e tronco encefálico nas rãs. Para avaliação dos parâmetros oxidativos realizaram-se as medidas das atividades antioxidantes das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa transferase (GST), além da quantificação do teor de ácido ascórbico e grau de lipoperoxidação nas regiões encefálicas das diferentes espécies. No encéfalo de ratos e rãs em estado basal, a SOD e o ácido ascórbico apresentaram valores semelhantes entre as espécies, com concentração de ácido ascórbico ligeiramente maior em tronco encefálico de rãs. As atividades da GST e CAT foram peculiares entre as espécies de animais, sendo o valor da atividade da CAT aproximadamente o dobro daquele observado em rato nas duas regiões encefálicas, e o da GST maior apenas no prosencéfalo de rãs. Aos três dias após a secção do nervo isquiático, observou-se aumento significativo da lipoperoxidação nas duas regiões encefálicas de ratos, porém nas rãs este acréscimo foi observado aos 3 e 7 dias no prosencéfalo e apenas aos 3 dias no tronco encefálico. Nos ratos a atividade da CAT aumentou apenas no córtex, não mostrando qualquer modificação significativa nos tecidos de rãs. A enzima SOD mostrou aumento em sua atividade nas duas regiões encefálicas de ratos nos períodos experimentais em estudo, mas teve esta atividade reduzida nas regiões encefálicas de rãs aos 3 dias após a axotomia periférica. Os ratos do grupo sham também mostraram aumentos em seus valores de lipoperoxidação nas regiões estudadas, mas apenas aos 3 dias após a lesão. Os valores de ácido ascórbico não variaram significativamente nas regiões do encéfalo de ratos, mas tiveram aumento significativo nas regiões de rãs aos 7 dias. Diferentemente dos ratos, as regiões encefálicas de rãs diminuíram a atividade da GST aos 3 dias após a secção nervosa periférica. Estes resultados mostram que a secção nervosa periférica, bem como as diferentes intensidades de estimulação nociceptiva (grupos sham e desnervado), é capaz de alterar o estado redox das células em estruturas encefálicas de distintas espécies de vertebrados. Além disso, a injúria nervosa periférica parece ativar diferentes mecanismos de defesa antioxidante no encéfalo de rãs e ratos.

Objetivo: validar a Children’s and Infants’ Postoperative Pain Scale (CHIPPS) em crianças brasileiras de zero a 60 de meses idade. Pacientes e métodos: 100 crianças saudáveis de zero a 60 meses recebendo vacinação por via parenteral foram estudadas. A escala foi traduzida e testada para confiabilidade interobservador, consistência interna, validades de conteúdo, construção e critério concorrente. O comportamento das crianças foi gravado em vídeo antes, durante e após a vacinação na unidade básica de saúde. Três observadores independentes analisaram o comportamento através dos filmes. Resultados: a escala mostrou excelente confiabilidade interobservador (coeficiente de correlação intraclasse 0,89) e muito boa consistência interna com alfa de Cronbach de 0,86. A correlação positiva entre a CHIPPS e a MBPS (Modified Behavioral Pain Scale) confirma a validade de critério concorrente (coeficiente de Spearman 0,70 antes e 0,81 após a vacinação). A validade de construção foi determinada pela comparação dos escores de cada criança antes da vacinação (sem dor) e após o procedimento (com dor), tendo a diferença nos escores de dor sido estatisticamente significativa (teste de Wilcoxon, p<0,001). Os especialistas que revisaram a escala concordaram com a validade de conteúdo. Conclusão: Com base nos dados obtidos através do presente estudo, podemos inferir que a CHIPPS é uma escala válida e confiável para ser usada em crianças brasileiras pré-verbais. / Objective: This study was designed to validate the Children’s and Infants’ Postoperative Pain Scale (CHIPPS) in Brazilian children aged zero to 60 months. Methods: 100 healthy children receiving parenteral vaccination were studied. The scale was translated and tested for inter-rater reliability, internal consistency, and construct, content, and concurrent validity. The children’s behavior was videotaped before, during and after the vaccination in primary care unit. Three observers then rated pain behavior from videotapes. Results: The scale had showed excellent inter-rater reliability (intraclass correlation coefficient 0.89) and a very good internal consistency, with Cronbach’s alpha of 0.86.The positive correlation between CHIPPS and MBPS (Modified Behavior Pain Scale) supports concurrent (criterion) validity (Spearman coefficient 0.70 before and 0.81 after vaccinations). The construct validity was determined by comparing the scores of each child before vaccination (without pain) and during the procedure (experiencing pain), and the difference in pain scores was statistically significant (Wilcoxon signed rank test; p<0.001). Content validity (by expert review) was very good. Conclusions: Based on the results obtained, we can infer that CHIPPS is a valid and reliable tool for Brazilian children aged zero to five years old.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.

O óxido nítrico (NO) é um gás produzido através da ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), e age como um neurotransmissor no sistema nervoso de moluscos gastrópodos adultos. Não há informações, até o momento, da presença de neurônios contendo NOS em caracóis da espécie Megalobulimus abbreviatus, tanto jovens quanto adultos. Consequentemente, foi utilizada a técnica histoquímica da NADPH-d para mapear a distribuição nitrérgica no sistema nervoso central (SNC) de animais adultos e jovens. A reação foi observada em neurônios e fibras em todos os gânglios (pedais, pleural direito, pleural esquerdo, parietal direito, parietal esquerdo, visceral, cerebral e bucal) do SNC de caracóis jovens e adultos, e foi particularmente forte nos gânglios pedais e cerebral, onde neurônios positivos foram encontrados agrupados simetricamente nos gânglios pareados. Estes resultados fornecem evidência da existência de um sistema nitrérgico em M. abbreviatus jovens e adultos, onde a NOS foi encontrada em regiões específicas do SNC. Para estabelecer um possível envolvimento do NO no circuito nociceptivo neste caracol, usando histoquímica para NADPH-d e análise semiquantitativa de densidade óptica, foram caracterizados os neurônios produtores de NO nos gânglios pedais de M. abbreviatus jovens e adultos, sujeitos a estímulo térmico aversivo. Os animais foram sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12 e 24h) após o estímulo. A atividade enzimática foi detectada em diferentes grupos celulares e processos neuronais. Em todas as sub-regiões dos gânglios pedais estudadas, a densidade óptica de neurônios positivos (p<0,05) e da área neuropilar 1 (p<0,01) foi significativamente diferente em animais tratados quando comparados com os controles. O aumento na atividade nitrérgica induzida por estímulo nociceptivo sugere o envolvimento do NO no circuito nociceptivo de M. abbreviatus, o que foi verificado através do estudo da ação do NO na resposta de latência do caracol M. abbreviatus após estímulo térmico e químico, e na atinocicepção mediada por opióides. Doses do inibidor da NOS NG-nitro-L-arginina-metil ester, L-NAME (1 μg/kg, 10 μg/kg e 25 μg/kg) e do agente liberador de NO S-nitro-Nacetilpenicilamida, SNP (1 μg/kg, 10 μg/kg e 25 μg/kg) foram administradas para determinar o efeito do NO nas respostas de latência. Com a dose mais alta de L-NAME (25 μg/kg), a resposta de latência foi significativamente maior (p<0,001) e com a dose mais alta de SNP (25 μg/kg) a resposta de latência foi significativamente menor (p<0,001) quando comparadas com as outras doses, e com os grupos controle e salina. A dose de 25 μg/kg de L-NAME produziu um efeito analgésico similar ao da morfina. Também foi observado que a antinocicepção induzida por morfina foi significativamente potencializada por L-NAME (p<0,05) e reduzida, mas não bloqueada, por SNP (p<0,05) em animais submetidos aos estímulos térmico e químico, demonstrando que o NO apresenta um efeito pró nociceptivo neste modelo animal. / Nitric oxide (NO) is a gas produced through the action of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) and acts as a neurotransmitter in the nervous system of adult gastropod molluscs. There appears to be no information on the presence of NOS-containing neurons in adult and young Megalobulimus abbreviatus. Accordingly, we used NADPH-d histochemistry to map the nitrergic distribution in the central nervous systems (CNS) of young and adult animals. The reaction was observed in neurons and fibers in all CNS ganglia of both young and adult snails (pedal, right pleural, left pleural, right parietal, left parietal, visceral, cerebral and buccal), and was particularly strong in the pedal and cerebral ganglia where positive neurons were found clustered symmetrically in the paired ganglia. These results provide evidence for the existence of a nitrergic signaling system in young and adult M. abbreviatus where NOS was found in specific regions of the CNS. In order to establish a probably involvement of NO in the nociceptive circuit in M. abbreviatus, using NADPH-d histochemistry and semi-quantitative optical densitometry, were characterized the NO-producing neurons in the pedal ganglia of young and adult Megalobulimus abbreviatus, subjected to aversive thermal stimulus. The animals were sacrificed at different times (3, 6, 12 and 24h) following stimulus. The enzymatic activity was detected in different cellular subsets and neuronal processes. In all the studied pedal ganglia subregions, the optical density of positive neurons (p<0.05) and neuropilar area 1 (p<0.01) was significantly different in treated animals when compared to controls. The increase in nitrergic activity induced by nociceptive stimulus suggests the involvement of NO in the nociceptive circuit of M. abbreviatus, which was verified through the study of the action of NO in the latency response of the snail M. abbreviatus after thermal and chemical stimuli, and in the antinociception mediated by opioid. Doses of the NO synthase inhibitor NG-nitro-L-argininemethyl ester, L-NAME (1 μg/kg, 10 μg/kg and 25 μg/kg) and the NO-releasing agent S-nitro-Nacetylpenicillamide, SNP (1 μg/kg, 10 μg/kg and 25 μg/kg) were administered to determine the effect of NO on latency responses. With the highest L-NAME dose (25 μg/kg), the response latency was significantly longer (p<0.001) and with the highest SNP dose (25 μg/kg) the response latency was significantly shorter (p<0.001) when compared with the other doses, control and saline groups. The 25 μg/kg dose of L-NAME produced an analgesic effect similar to that of morphine. We also observed that morphine-induced antinociception was significantly potentiated by L-NAME (p<0.05) and reduced, but not blocked, by SNP (p<0.05) in animals submitted to thermal and chemical stimuli, showing that NO presents a pronociceptive effect in this animal model.

Estudos mostram o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (EROs) nos distintos tipos de dor, porém ainda se desconhece o papel efetivo dessas espécies no sistema nervoso central (SNC). Um modelo para o estudo da dor neuropática (dor originada como consequência direta de uma lesão ou doença afetando o sistema somatossensorial, em seus elementos periféricos ou no SNC) é a constrição nervosa periférica. Nesta condição um quadro de estresse oxidativo é estabelecido no local da lesão. A administração de N-acetilcisteína (NAC) tem efeito analgésico nesses animais, o qual parece resultar do papel antioxidante dessa molécula no local da lesão. Como a NAC atravessa a barreira hematencefálica, a hipótese do presente estudo foi que o efeito analgésico dessa molécula também envolveria ação no SNC. Assim, este trabalho avaliou os efeitos temporais da administração intraperitoneal de NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, sobre parâmetros nociceptivo e de estresse oxidativo e nitrosativo em medula espinal de ratos com constrição no nervo isquiático direito. Como controle foi utilizado administração de solução salina nas mesmas condições. O projeto que antecedeu o presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso de animais da UFRGS (número de protocolo: 19037). Para a realização desse estudo 72 ratos Wistar machos, pesando 200-300g, foram divididos em 3 grupos (n=24/grupo): controle (animais que não sofreram nenhuma intervenção cirúrgica), sham (animais onde o nervo isquiático direito foi exposto, mas não sofreu constrição) e com constrição nervosa (animais onde o nervo isquiático direito foi exposto e recebeu 4 amarraduras em seu terço inicial). Estes grupos experimentais foram subdivididos em subgrupos (n=6/subgrupo) que receberam administração intraperitoneal de solução salina ou de NAC, na dose de 150 mg/Kg/dia, por período de 3 e 10 dias. Os testes de Von Frey e da placa quente avaliaram as sensibilidades mecânica e térmica, respectivamente, antes da lesão e 1 e 3 dias, e 1, 3, 5, 7 e 10 dias após a lesão periférica nos grupos 3 e 10 dias, respectivamente. Após, os animais foram decapitados, a medula espinal lombossacral retirada e usada para as determinações de peróxido de hidrogênio (H2O2) (técnica de oxidação do vermelho fenol), atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx, pela técnica descrita por Flohé e Gunzler, 1984) e glutationa transferase (GST, pela técnica descrita por Habig, 1974), razão entre glutationa reduzida e oxidada (GSH/GSSG, conforme técnica descrita por Akerboom e Sies, 1981), e nitritos+nitratos (pela reação de Griess). De cada animal ainda foi coletada uma amostra de sangue para avaliação de indicadores plasmáticos de função hepática (gama glutamiltransferase, transaminase glutâmica oxalacética, transaminase glutâmica pirúvica e bilirrubina) e renal (creatinina), por meio de utilização de kits comerciais. Foi coletada também uma amostra de fígado dos ratos que receberam administração de solução salina e de NAC nos intervalos considerados nesse estudo para determinação da morfologia dos hepatócitos pela técnica de hematoxilina e eosina. As sensibilidades aumentaram no dia 1 pós-lesão nos grupos constrição nervosa, e permaneceram elevadas nos demais períodos analisados apenas no grupo constrição nervosa tratado com solução salina. No grupo constrição nervosa que recebeu tratamento com NAC, os valores das sensibilidades foram similares aos do pré-lesão nos períodos de 3, 5, 7 e 10 dias. No grupo sham, o aumento da sensibilidade mecânica ocorreu apenas no dia 1, permanecendo nos demais períodos analisados similar ao valor pré-lesão, tanto nos ratos tratados com solução salina como naqueles que receberam NAC. Porém, enquanto a sensibilidade térmica aumentou nos períodos de 3 e 5 dias após a lesão tecidual nos ratos tratados com NAC, nenhuma alteração significativa ocorreu no grupo que recebeu solução salina (ANOVA de amostras repetidas, p<0,05). Paralelamente a estas alterações de sensibilidades, na medula espinal lombossacral ocorreu redução estatisticamente significativa nos valores de H2O2 nos grupos com constrição nervosa, independente do tratamento recebido, nos períodos de 3 e 10 dias. A razão GSH/GSSG aumentou significativamente aos 3 dias após a constrição nervosa nos animais que receberam solução salina. Nesse mesmo período ocorreu aumento estatisticamente significativo na atividade da GST nesses animais. A atividade dessa enzima também teve acréscimo nos ratos Sham que receberam solução salina e nos animais constrição nervosa tratados com NAC, ambos por 10 dias. Nesse mesmo período, a atividade da GPx estava significativamente aumentada nesses grupos experimentais (sham tratado com solução salina e constrição nervosa tratado com NAC). Os valores de nitritos+nitratos aumentaram significativamente apenas no grupo constrição nervosa que recebeu administração de solução salina por 3 dias. Nesse período, os valores desses metabólitos estavam significativamente reduzidos nos grupos constrição nervosa e sham tratados com NAC. Aos 10 dias, foi observada redução significativa nos valores de nitritos+nitratos apenas no grupo sham tratado com solução salina (ANOVA de três vias, seguida do pós-teste de Tukey, p< 0,05). Estes resultados mostram que a administração intraperitoneal de NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, reproduz o efeito analgésico dessa molécula e modifica parâmetros de estresse oxidativo e nitrosativo na medula espinal, os quais possivelmente se relacionam com as mudanças de sensibilidades nos ratos sham e com constrição nervosa. Assim, o efeito analgésico da NAC também envolve sua ação no SNC.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / A queimadura e uma experiencia traumatica com importante repercussao social, economica e de Saúde publica que necessita de atencao de orgaos governamentais de forma multidisciplinar, estando entre as principais causas de morbidade e mortalidade devido a complexidade do tratamento. Objetivo: Avaliar a qualidade de vida, autoestima, capacidade funcional e dor em pacientes apos queimadura. Metodos: Estudo transversal, analitico e multicentrico. Foram incluidos no estudo 30 pacientes com idades entre 18 e 59 anos, com 6 a 24 meses de tempo apos a queimadura. Utilizou-se instrumento para coleta de dados demograficos e clinicos. A avaliacao foi realizada por meio dos questionarios SF-36, instrumento especifico para queimaduras BSHS-R, Escala de autoestima de Rosenberg/UNIFESP-EPM, instrumento de avaliacao da capacidade funcional HAQ-20, e para avaliacao da dor, a Escala Visual Analogica. Para a analise estatistica foram utilizados o Teste t de Student, Analise de Variancia (ANOVA), teste de Tukey, Kruskal-Wallis, Dunn e Spearman's. Resultados: Dos 30 pacientes, 56,7 % eram do genero masculino, com idade media de 36,1 anos. A principal causa da queimadura foi o liquido inflamavel (50 % dos pacientes) e a media da superficie corporea queimada foi de 21 %. Houve diferenca estatisticamente significante entre os generos nos dominios do SF-36 Aspecto Emocional (p = 0,023) e Saúde Mental (p = 0,047). Em ambos os dominios os homens apresentaram melhores resultados. Tambem tiveram diferenca estatisticamente significante os dominios do SF-36 Dor (p=0,025), Vitalidade (p=0,041) e Saúde Mental (p=0,023) com relacao ao consumo de alcool e tambem com as escalas BSHS-R (P=0,015), Rosenberg (p=0,044) e a EVA (p=0,007). O uso de drogas apresentou diferenca estatisticamente significante com relacao ao dominio Dor do SF-36 (P=0,008). Conclusao: A qualidade de vida de pacientes apos queimadura apresentou correlacao positiva com a autoestima, capacidade funcional e dor / Background: Burn injury is a traumatic experience that has social, economic and public health implications and deserves the attention of governmental agencies and multidisciplinary teams. Objective: To evaluate quality of life, self-esteem, functional ability, and pain in burn patients. Methods: This was a multicenter, cross-sectional, analytical study. Thirty patients aged 18 to 59 years, who had suffered burn injury during the past 6 to 24 months, were included in the study. A questionnaire was used to collect clinical and demographic data. Patients were assessed with the Short Form 36 Health Survey (SF-36), Burn Specific Health Scale-Revised (BSHS-R), Rosenberg Self-Esteem Scale (RSE)/EPMUNIFESP, Health Assessment Questionnaire (HAQ-20), and Visual Analog Scale (VAS) for pain. Statistical analysis was performed using Student’s t-test, analysis of variance (ANOVA), Tukey’s test, KruskalWallis test, Dunn’s test, and Spearman's test. Results: Most of the patients (56.7 %, n=17) were men and the mean age was 36.1 years. Buns were mainly caused by flammable liquids (50 % of patients) and the mean burn size was 21 % total body surface area. Men reported significantly better health status on the role emotional (p=0.023) and mental health (p=0.047) SF-36 subscales. A significant association was found between “alcohol use” and SF-36 scores on the bodily pain (p=0.025), vitality (p=0.041), and mental health (p=0.023) subscales, BSHS-R scores (p=0.015), RSE scores (p=0.044), and VAS pain scores (p=0.007), and between “drug use” and SF-36 scores on bodily pain (p=0.008). Conclusion: Burn injuries had a negative impact on the health-related quality of life, functional ability, selfesteem, and pain. / BV UNIFESP: Teses e dissertações