A incidência do melanoma, tumor maligno que se origina dos melanócitos, vem crescendo em todo o mundo. História familial positiva da doença tem sido relatada em 8 a 14% dos pacientes afetados. Muitos estudos sugeriram o envolvimento da região 9p21, onde se encontra o gene CDKN2A, no surgimento dessa neoplasia. Este é um gene supressor tumoral clássico e a inativação dos dois alelos tem sido detectadas em linhagens celulares tumorais de famílias com melanoma hereditário e esporádico. Mutações em linhagens germinativas do gene CDKN2A têm sido identificadas em aproximadamente 20% das famílias com melanoma familial. Utilizando técnicas de biologia molecular como Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Conformação Estrutural de Fita Simples (SSCP) e seqüenciamento, este projeto estudou 22 pacientes com critérios clínicos de melanoma hereditário e encontrou uma mutação (P48T) em um paciente numa família de três afetados. Em 13 casos foi identificado pelo menos um dos três polimorfismos: 500 C>G (31,9%), 540 C>T (27,3%) e A148T (4,5%). Os resultados demonstram a importância da pesquisa de mutações no gene CDKN2A principalmente em famílias com dois ou mais membros afetados pela doença. / The incidence of melanoma, malign tumor that originates from melanocytes, is increasing all over the world. Positive familial history of disease has been related in 8 to 14% of affected patients. Several studies have suggest the 9p21 region evolvement, where is located the CDKN2A gene, in the arising of this neoplasia. It is a classic tumor suppressor gene and the inactivation of two alleles has been detected in tumor cells lines of families with hereditary and sporadic melanoma. Nowadays germeline mutations in CDKN2A gene have been identified in almost 20% of families with familial melanoma. Using molecular biology techniques like Polymerase Chain Reaction (PCR), Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) and sequencing, this project studied 22 patients with clinical pattern of hereditary melanoma and it found one mutation (P48T) in one patient belonged to a three affected family. Thirteen cases had at least one of the three polymorphisms: 500 C>G (31,9%), 540 C>T (27,3%) e A148T (4,5%). The results show the importance of the search for mutations in the CDKN2A gene mainly in families with two or more affected by disease.

O melanoma é uma neoplasia maligna derivada de melanócitos, o qual tem uma letalidade elevada devido a sua característica altamente invasiva e agressiva. O caule da E. tirucalli produz um látex de coloração branca usado na medicina popular para o tratamento de neoplasias, que possui diversos constituintes ativos, incluindo o eufol, euforbol e isoeuforal. O objetivo do trabalho foi estudar os efeitos antineoplásicos in vitro e in vivo do látex da Euphorbia tirucalli em alguns modelos experimentais in vitro e in vivo. Células de melanoma B16/F10 foram tratadas com as seguintes diluições seriadas do látex a partir de uma concentração inicial de 0,1037ug/uL: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048, 1/5096, 1/11192. A viabilidade celular foi avaliada por MTT às 24, 48 e 72 horas. No experimento primeiro in vivo, células de melanoma foram inoculadas no tecido subcutâneo dorsal lombar de camundongos BALB/c e 10 dias após tratados, ou não, com 0,467ug/25g em volume de 200uL de látex de E. tirucalli por gavagem durante 14 dias. No segundo experimento, camundongos C57BL/6 foram inoculados com células de melanoma B16/F10 na veia da cauda para colonização pulmonar. No experimento in vitro, observou-se uma diminuição da viabilidade celular nas diluições de 1/1024 e 1/11192 no tempo de 24h e ás 48h houve uma diminuição da viabilidade celular nas diluições de 1/128, 1/256, 1/2048 e 1/11192. No experimento in vivo, observou-se que o látex da E. tirucalli foi capaz de reduzir o volume dos tumores subcutâneos em 53,5%, enquanto que o grupo não tratado o volume aumentou em 818,1%. No experimento de inoculação na veia da cauda com melanoma B16/F10 a administração de látex da E. tirucalli foi capaz de reduzir a fração de área pulmonar ocupada pelas colônias para 10,5% enquanto que no grupo não tratado, a fração de área pulmonar com colônias de melanoma aumentou para 35%. Não foram observadas alterações histopatológicas em nenhum dos grupos experimentais em outros órgãos. Os efeitos de redução de tumor, redução das colônias pulmonares e da viabilidade celular podem ser devidos à ação dos constituintes do látex que já demonstraram ter atividade antiproliferativa e citotóxica em outros experimentos, como o eufol e o euforbol. Embora o látex seja uma substância tóxica, ela pode ter tido, nas maiores diluições utilizadas, um efeito positivo para o tratamento do tipo hormesis / Melanoma is a malignant neoplasm derived from melanocytes, which has a high lethality due to its highly invasive and aggressive trait. The E. tirucalli stem produces a white latex used in folk medicine for the treatment of cancer, this product has several active constituents, including euphol, euphorbol and isoeuphoral. The objective of this work was to study the antineoplastic effects of Euphorbia tirucalli latex in experimental models in vitro and in vivo. B16/F10 melanoma cells were treated with the following serial dilutions of the latex from an initial concentration of 0.1037ug/?l: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048, 1/5096, 1/11192. Cell viability was assessed by MTT at 24, 48 and 72 hours. In the first in vivo experiment, melanoma cells were inoculated into the lumbar dorsal subcutaneous tissue of BALB/c mice and 10 days later they were treated or not treated with 0.467ug/25g of body weight in of 200?L of E. tirucalli latex by gavage for 14 days. In the second experiment, C57BL/ 6 mice were inoculated with B16/F10 melanoma cells into the tail vein for lung colonization. In the in vitro experiment, a decrease in cell viability at 1/1024 and 1/11192 dilutions was observed at 24h, and at 48h there was a decrease in cell viability at the dilutions of 1/128, 1/256, 1/2048 and 1/11192. In the in vivo experiment it was observed that the latex of E. tirucalli could reduce the volume of the subcutaneous tumors in 53.5% while in the untreated group the volume increased 818.1%. In the experiment of inoculation into the tail vein with B16/F10 melanoma cells, E. tirucalli latex administration was able to reduce the fraction of lung area occupied by the colonies to 10.5% whereas in the untreated group, the fraction of lung area with colonies was 35%. No histopathological changes were observed in any of the experimental groups in other organs. The effects of tumor reduction, reduction of lung colonies and cell viability may be due to the action of latex constituents that have already demonstrated antiproliferative and cytotoxic activity in other experiments, such as euphol and euphorbol. Although latex is a toxic substance, it may have developed, at the low dilutions used, a positive effect for the treatment of the hormesis type

Galectina-3 é uma lectina animal que apresenta afinidade por b- galactosídeos e que tem sido associada à progressão tumoral e metástase. A expressão de galectina-3 encontra-se alterada durante a progressão tumoral de diferentes neoplasias. Em tumores como carcinoma de tiróide e bexiga a expressão de galectina-3 encontra-se aumentada, enquanto que em tumores como carcinoma de mama e ovário a expressão desta lectina encontra-se diminuída. Neste trabalho nós utilizamos um modelo de progressão tumoral de melanoma murino para investigar os mecanismos envolvidos na perda de expressão de galectina-3. Este modelo é composto por uma linhagem de melanócitos imortalizados (melan-a) e duas linhagens de melanoma de crescimento vertical (Tm1 e Tm5) estabelecidas após submeter a linhagem melan-a a inúmeros ciclos de de-adesão. Enquanto melan-a acumula grandes quantidades de galectina-3, as linhagens Tm1 e Tm5 deixaram de expressar o gene de galectina-3. Análise da região 5\' do gene de galectina-3 demonstrou que esta região apresentava grande conteúdo de dinucleotídeos CpG e vários sítios SP1. O seqüenciamento desta região após tratamento do DNA com bissulfito de sódio mostrou que esta região estava totalmente metilada nas linhagens Tm1 e Tm5 e desmetilada na linhagem melan-a. O tratamento da linhagem Tm1 com 5-Aza-2\'-deoxicitidina (5-Aza-CdR), um inibidor da DNA metiltransferase, provocou um decréscimo significativo nos níveis de metilação da região 5\' do gene de galectina-3 que por sua vez levou a re-expressão do RNAm e da proteína. O tratamento de Tm1 com os inibidores de histono deacetilases tricostatina A e 4-ácido-fenilbutírico em combinação com 5-Aza-CdR não aumentou os níveis de expressão do gene de galectina-3 e curiosamente, reverteu o efeito induzido por 5-Aza-CdR. Em adição, a expressão da enzima DNMT1 apresentou um discreto aumento nas linhagens Tm1 e Tm5 em relação a melan-a. Em conjunto esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos como a metilação estão envolvidos no controle de expressão do gene de galectina- 3 ao longo da progressão tumoral de melanoma murino. / Galectin-3 is a b-galactoside-binding animal lectin, shown to be involved in tumor progression and metastasis. Galectin-3 expression has been found altered along tumor progression of different tumors. In some types of cancers such as thyroid carcinoma and bladder carcinoma, galectin-3 expression has been found increased, whereas in tumors such as breast carcinoma and ovary carcinoma the expression of this lectin has been found decreased along tumor progression. In this study, we have used a murine melanoma model to investigate the mechanisms responsible for the loss of galectin-3 gene expression. This model consists of a cell line of immortalized melanocytes (melan-a) and two cell lines of vertical growth phase melanoma (Tm1 and Tm5) established after submitting melan-a cells to several deadhesion cycles. While melan-a expressed high amounts of galectin-3, both Tm1 and Tm5 cells lost galectin-3 gene expression. Analysis of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene demonstrated the presence of a high CpG content and several SP1 binding sites. Bisulfite sequencing of this region showed that it was fully methylated in Tm1 and Tm5 cells and unmethylated in melan-a cells. Treatment of Tm1 cells with 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), a DNA methyltransferase inhibitor, led to a marked decrease in the methylation levels of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene, which led to transcription of the galectin-3 gene. Treatment of Tm1 cells with the histone-deacetylase inhibitors trichostatin A and 4- acid-phenilbutyrate in combination with 5-Aza-CdR did not increase the levels of galectin-3 gene expression and intriguingly, reverted the effect of 5-Aza-CdR alone. In addition, the expression of DNMT1 showed a modest, but significant increase in Tm1 and Tm5 cells as compared with melan-a cells. Altogether these results indicate that epigenetic mechanisms such as methylation play a role in the regulation of the galectin-3 gene expression along murine melanoma progression.

Nos últimos 15 anos a utilização do complexo [[99mTc](H2O)3(CO)3]+ como intermediário para obtenção de radiofármacos de [99mTc]tecnécio, para aplicações em cardiologia, neurologia e oncologia tem se tornado mais intensa devido a facilidade de obtenção a partir de soluções aquosas e a facilidade de substituição das moléculas de H2O por átomos ligantes de outras moléculas. Neste projeto preparamos novos complexos do tipo [[99mTc](CMNS001-3)(H2O)(CO)3]+, onde (CMNS001) = N-[(4-metoxi)benzil]-1,2- diaminoetano e (CMNS003)= N,N\'-bis-[(4-metoxi)benzil]-1,2-diaminoetano e avaliamos a captação desses complexos, mais o radiofármaco [[99mTc](MIBI)6]+, utilizado como referência, em linhagens tumorais de melanoma (B16F10) e de mama (MCF-7 e MDA-MB-231). A captação in vitro de ambos derivados [[99mTc](CMNS001-3)(H2O)(CO)3]+ atingiu valores próximos a 5 % do total da dose inoculada, tendo sido superior ao 1 % obtidos com o [[99mTc](MIBI)6]+. A avaliação da distribuição subcelular mostrou concentração de dos novos complexos ocorre na fração da membrana, para a linhagem MDA-MB-231, enquanto para a linhagem B16F10 observamos uma concentração semelhante entre membrana celular e citoplasma, a concentração do [[99mTc](MIBI)6]+ em maior proporção no citoplasma. Estudo de biodistribuição em camundongos permitiram observar a captação máximo de 1,6 % da dose administrada por grama de tecido tumoral, para o complexo [[99mTc](CMNS001)(H2O)(CO)3]+, enquanto que outros órgão como coração, pulmão e músculo, apresentaram captação da ordem de 5,6 %, 6,4% e 2 %, respectivamente. Os complexos desenvolvidos neste trabalho mostraram alta taxa de captação in vitro, mas que não foi reproduzida no modelo in vivo, o qual pode estar relacionado à baixa concentração dos complexos no interior das células e a menor vascularização do tecido tumoral, com menor aporte dos complexos através do sistema sanguíneo. / Over least 15 years the complex [[99mTc](H2O)3(CO)3]+ has been used as an intermediary to obtain technetium radiopharmaceuticals for applications in cardiology, neurology and oncology. Two important characteristics of this molecule are the easily that compound is obtained from aqueous solutions and the ease of substitution of H2O molecules by atoms of other ligand molecules. In this project we prepared new complexes [[99mTc](CMNS001-3)(H2O)(CO)3]+, where (CMNS001) = N-[(4-methoxy) benzyl]-1,2-diaminoethane, (CMNS003) = N,N\'- bis-[(4-methoxy)benzyl]-1,2-diaminoethane, and assessed the uptake of these complexes in murine melanoma cancer cell B16F10 and breast cells MCF-7 and MDA-MD-231, and compared with [[99m](MIBI)6]+ uptake. In vitro uptake for both new technetium complex reached values close to 5%, for all cell lines, whereas the [[99mTc](MIBI)6]+ uptake was close to 1 %. The assessment of subcellular distribution showed high accumulation of the new complex in the membrane fraction, for MDAMB- 231, while for B16F10 accumulation occurred both in membrane and cytoplasm; the concentration of [[99mTc](MIBI)6]+ was mainly in the cytoplasm portion. Biodistribution study in mice allowed to observe the capture of up to 1.6% of the administered dose per gram of tumor tissue for the complex [[99mTc](CMNS001)(H2O)(CO)3]+, whereas other organs such as heart, lung and muscle, showed uptake of about 5.6%, 6.4% and 2%, respectively. The complexes in this work showed a high rate of uptake in vitro, but was not reproduced in vivo model, which can be related to low concentration of the complexes inside the cells and reduced vascularity of tumor tissue, with lower intake of complex through the blood system.

A heterogeneidade intratumoral é um fenômeno extremamente importante para entender a progressão tumoral e a resposta à intervenção terapêutica. A galectina-3 pertence à família das lectinas, possuem a função de reconhecimento e ligação à ?-galactosídeos ramificados de glicolipídeos e glicoproteínas, e está envolvida em processos fisiológicos e patológicos como o câncer. Nesse trabalho, a heterogeneidade intratumoral em relação à expressão de galectina-3 foi observada em amostras de diferentes lesões melanocíticas de pacientes. Além disso, o inóculo de células de melanoma murino negativas para galectina-3 em animais gal3-/- gerou tumores constituídos por uma fração de células tumorais que passaram a expressar de novo galectina-3, sugerindo que pressões do microambiente tumoral modulam a expressão dessa lectina em melanomas. A acidose extracelular atuou como regulador negativo de galectina-3 in vitro, diminuindo a expressão dessa lectina tanto em células de melanoma murino e humano quanto em melanócito murino. Entretanto, a hipóxia, seja pela exposição aguda ou intermitente, não alterou a expressão in vitro de galectina-3 em células de melanoma humano. Por fim, tumores originados pelo inóculo de células tumorais positivas e negativas para galectina-3 (mimetizando tumores heterogêneos) obtiveram a maior taxa de crescimento tumoral comparados aos tumores constituídos por uma única população de células, seja positiva ou negativa para galectina-3. Portanto, foram apresentadas evidências de que a heterogeneidade intratumoral em relação à galectina-3 parece estar envolvida com o sucesso evolutivo do melanoma e que a acidose é indicada como uma das pressões microambientais que contribuem para o estabelecimento e manutenção da fração de células tumorais negativas para galectina-3 dentro da massa tumoral / The intratumoral heterogeneity observed in human tumors is extremely important to understand tumor progression and its therapeutic response. Galectin-3 belongs to animal lectin family and it is a ?-galactosidase binding protein which is involved in physiological and pathological processes, including cancer. In this work, an intratumor heterogeneous galectin-3 expression was observed in tissue sessions containing different human melanocytic lesions. Moreover, negative galectin-3 murine cells injected into gal3-/- mice were able to generate tumors composed of a positive galectin-3 cell fraction, suggesting that selective forces in tumor microenvironment modulate galectin-3 expression in melanoma. Extracellular acidosis acts as a negative regulator to galectin-3 in vitro, decreasing its expression in murine and human melanoma cells and even in murine melanocytes. However, intermittent or acute hypoxia exposure did not alter galectin-3 expression in human melanoma cells in vitro. In addition, tumors originated from a mixture of positive and negative galectin-3 cells (mimicking heterogeneous tumors) showed higher growth rate compared to those derived from only galectin-3 positive or negative cells. Therefore, we showed evidences that galectin-3 intratumoral heterogeneity seems to be involved with the evolutionary success of melanoma and that acidosis may be the microenvironmental pressure responsible for the establishment and maintenance of galectin-3 negative cell fraction into the tumor bulk

Estudos recentes relataram oncogenes induzindo a reprogramação metabólica no câncer. Essa reprogramação é fundamental para que as células cancerosas tenham nutrientes e biomoléculas suficiente para manter sua alta taxa proliferativa. A mitocôndria tem um papel central no metabolismo energético da célula e alterações no seu genoma, tanto em relação a mutações como em número de cópias, já foram bastante observados em vários tipos tumorais. Além disso, deficiência no fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fundamental para a transcrição e estabilidade do mtDNA, já foi associada com o crescimento tumoral. Diante disso, nosso estudo teve como objetivo avaliar o papel da instabilidade do genoma mitocondrial no metabolismo energético e crescimento do melanoma. Para isso, nós medimos a instabilidade do mtDNA utilizando como parâmetros: o acúmulo de mutações no mtDNA, alterações no mtDNAcn e a expressão do TFAM. O impacto da instabilidade do mtDNA foi avaliado em três modelos diferentes de melanoma: um modelo in vitro de linhagens celulares, dados de expressão gênica de tumores de melanoma metastático proveniente do TCGA e um modelo murino induzível de melanoma (BrafV600E/Ptennull), adicionado a um background alternativo de deficiência para o TFAM/mtDNAcn. Esse modelo murino também nos permitiu avaliar a deficiência do TFAM limitada a células tumorais (Tfamflox) e tanto em células tumorais, como no seu microambiente (Tfam+/-). Nas análises in vitro, nós observamos correlações positivas entre o mtDNAcn e a expressão do TFAM com a taxa de consumo de glicose e produção de ATP, indicando um impacto desses parâmetros na bioenergética celular. Análises de expressão gênica, utilizando tanto as linhagens de melanoma como tumores de melanoma metastático, nos sugeriram que o TFAM regula genes indutores de angiogênese, a resposta imunológica humoral e vias metabólicas de aminoácidos. Nas análises in vivo, nós observamos um aumento dos tumores em camundongos Tfam+/-, indicando que a deficiência de TFAM/mtDNAcn em células tumorais e no seu microambiente induz a tumorigênese, o que confirma os dados de expressão gênica encontrados com linhagens e tecido de melanoma. Além disso, análises de metabolômica e transcriptômica combinadas nos sugeriram que as células de melanoma com deficiência no TFAM/mtDNAcn são mais dependentes do metabolismo de glutamina. Diante disso, nós concluímos que a deficiência do TFAM/mtDNAcn tem um papel importante no crescimento do melanoma, induzindo a expressão de genes pro-tumorigênicos e aumentando o consumo da glutamina para suprir as necessidades proliferativas das células cancerosas. Esses dados são relevantes e podem nos ajudar a entender melhor o papel da mitocondrial na progressão do melanoma. / Recent studies have shown many oncogenes triggering metabolic reprogramming in cancer. The metabolic switch in cancer cells is necessary to supply the high demand for nutrients and biomolecules for proliferative cells. In this context, mitochondria play a central role in the energetic metabolism of the cell and changes in its genome, such as an increased load of mutations and alterations in mtDNA content, have been reported in several cancers. In addition, deficiency in the Mitochondrial Transcription Factor A (TFAM), responsible for transcription and maintenance of mtDNA stability, was previously associated with tumor growth. Based on that, our goal was to evaluate the impact of the mitochondrial genome instability in the energetic metabolism and melanoma growth. mtDNA instability was inferred measuring mtDNA mutations load and content, as well as TFAM expression. Its impact was evaluated in three different melanoma models: an in vitro model using melanoma cell lines, gene expression data from metastatic melanoma tumors, publicly available at TCGA, and an inducible murine model of melanoma (BRAFV600E/PTENnull), crossed onto different TFAMdeficient backgrounds. The murine model also provides us a tractable model to examine the consequences of mtDNA instability limited to cancer cells (Tfamflox) and in both cancer cells and tumor microenvironment (Tfam+/-). In vitro analysis showed us a positive correlation between mtDNA copy number (mtDNAcn) and TFAM expression with glucose consumption and ATP production, pointing an impact of these parameters in cellular bioenergetics. Further gene expression analysis, using both cell lines and metastatic melanoma data, suggested that TFAM could regulate the expression of angiogenesis genes, humoral immunity and amino acid metabolism. In vivo analysis confirmed the gene expression data, and revealed a higher melanoma growth in Tfam+/-. Also, combined metabolomics and transcriptomics data suggested that TFAM/mtDNAcn deficient melanoma cells rely mostly on glutamine metabolism to supply their energetic requirements. In conclusion, these data indicate that TFAM/mtDNAcn influences melanoma growth by triggering pro-tumorigenic signals and inducing metabolic reprogramming towards glutamine metabolism. These results are relevant and might help us understand how mitochondria affect melanoma progression.

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira Halder / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T16:08:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abrantes_JuliaLauraFernandes_D.pdf: 4562084 bytes, checksum: fba9dbca16cd31c006b311ff23a0b41b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O melanoma é o tipo mais agressivo de câncer de pele. Seu tratamento permanece como um grande desafio, já que em estágio avançado torna-se extremamente refratário aos tratamentos convencionais. miR-34a é um microRNA supressor de tumor com expressão normalmente reduzida em células cancerosas. A fim de investigar o papel de miR-34a como supressor do melanoma, o principal objetivo deste estudo foi identificar alvos moleculares modulados pela expressão ectópica de miR-34a na linhagem celular de melanoma metastático humano SK-mel-103. miR-34a reduziu significativamente a viabilidade das células de melanoma, o que deve estar relacionado, pelo menos em parte, com o aumento na expressão da proteína pró-apoptótica Bax, ativação da caspase-3 e clivagem da PARP-1. Estes dados sugerem que miR-34a foi capaz de induzir apoptose nas células de melanoma. Além disso, houve redução na expressão de CDK4, CDK6, E2F3 e pRb, proteínas relacionadas com a progressão do ciclo celular. Aumento na expressão de p21, um inibidor de CDKs, também foi observado nessas células. Algumas moléculaschave envolvidas com os processos de proliferação celular e apoptose, como proteínas oncogênicas (Axl, AKT, ERK 1/2, ?-catenina e c-myc) e proteínas supressoras de tumor (p53 e PTEN), foram "down- e upreguladas" por miR-34a, respectivamente. Interessantemente, o fluxo autofágico foi aumentado por miR-34a, efeito que não foi correlacionado com alterações adicionais na viabilidade das células de melanoma. O aumento no fluxo autofágico ocorreu, provavelmente, como uma resposta celular ao estresse de retículo e a agregação de proteínas induzidos por miR-34a, fenômenos que também podem ter contribuído para a indução de apoptose nesse contexto. Os dados obtidos neste estudo trouxeram novos aspectos moleculares da ação de miR-34a como supressor tumoral, e permitem apontar este microRNA como um potencial alvo terapêutico contra o melanoma metastático humano / Abstract: Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Its treatment remains a big challenge, since in advanced stage it is extremely refractory to conventional treatments. miR-34a has emerged as an important tumor suppressor, and its expression is normally reduced in cancer cells. To provide more information about the role of miR-34a as a melanoma suppressor, the main goal of this study was to identify key molecular players modulated by ectopic expression of this microRNA in the metastatic melanoma cell line SK-mel-103. miR-34a caused a reduction of melanoma cells viability, what may be related, at least in part, with the increased expression of pro-apoptotic marker, Bax, activation of caspase 3 and PARP-1 cleavage, which indicates that miR-34a triggered apoptosis in melanoma cells. In addition, the expression of CDK4, CDK6, E2F3 and pRb, proteins related to the cell cycle progression, was reduced. An increase in p21 expression, a CDK inhibitor, was also detected in these cells. Some key molecules involved with proliferation and apoptosis processes, such as oncogenic proteins (Axl, AKT, ERK 1/2 kinases, ?- catenin and c-myc) and tumor suppressor proteins (p53 and PTEN), were down- and upregulated by miR-34a, respectively. Interestingly, the autophagic flux was stimulated by miR-34a, but this effect was not correlated with further alterations in cell viability. The increased autophagy occurred probably as a cellular response against the reticulum stress and the protein aggregation induced by miR-34a in melanoma cells, which can also be contributing to the cell death by apoptosis in this context. Our findings brought up novel molecular aspects about the role of miR-34a as melanoma suppressor. The broad action of this microRNA on key molecular players of melanoma aggressiveness was crucial for reprogramming these cells in favor of apoptosis. Altogether, this study pointed out miR-34a as a potential therapeutic agent against advanced melanoma / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: João Ernesto de Carvalho, Mary Ann Foglio / Tese ( doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T13:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marchetti_GabrielaMenezes_D.pdf: 5720320 bytes, checksum: c6c2d23bcc3202544d0784d655107680 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A pesquisa fitoquímica de espécies vegetais tem originado um grande número de novas substâncias e trabalha em conjunto com a pesquisa farmacológica que é responsável porá apontar o potencial terapêutico dessas moléculas e ou de seus derivados. Trabalhos anteriores revelaram que o extrato bruto diclorometânico das folhas de Calea pinnatifida(Asteraceae) apresenta atividade antiproliferativa, em cultura de células tumorais humanas e antitumoral em modelos in vivo de Tumor Ascítico e Sólido de Ehrlich. Os estudos fitoquímicos revelaram a presença de germacranolídeos (lactonas sesquiterpênicas) entre os princípios ativos responsáveis pela atividade antitumoral. Este trabalho teve como objetivo isolar e determinar o mecanismo de ação do arucanolídeo. Primeiramente o arucanolídeo foi obtido através do fracionamento do extrato bruto diclorometânico e precipitação de graxas e clorofila com o uso de uma solução de acetato básico de chumbo. Em cultura de células tumorais humanas de diferentes origens o arucanolídeo apresentou atividade citocida para todas, com seletividade para melanoma e rim. Os estudos sobre o tipo demorte celular revelaram que o arucanolídeo é capaz de induzir apoptose, pela via intrínseca,através da ativação de caspases, com geração de radicais livres em células de glioblastoma U-118 MG e de melanoma SK-MEL-2. Já nas células HeLa (adenocarcinoma de cervix) o mecanismo pelo qual o arucanolídeo atua pode ser diferente, pois a via intrínseca não é tão importante, nem a geração de radicais livres, sugerindo o envolvimento da via extrínseca de apoptose. O uso de células HeLa transfectadas com o gene de Bcl-xl, não interferiu na indução de apoptose pelo arucanolídeo, comprovando a pouca importância da mitocôndriano processo apoptótico nessa linhagem, enquanto nas células SK-MEL-2 Bcl-xL a indução de apoptose foi significativamente reduzida. Nas células melanoma murino B16-F10, o arucanolídeo induziu apoptose através da ativação das caspases. No entanto, em modelo animal utilizando essa linhagem, a redução do desenvolvimento tumoral não foi dependente do processo apoptótico, sugerindo que outro mecanismo de ação está envolvido na atividade in vivo. No modelo de metástase onde as células de melanoma B16-F10 foram inoculadas diretamente na corrente sanguínea, foi observada uma tendência na redução das metástases pulmonares no grupo tratado com arucanolídeo, com poucos sinais de toxicidade hepática. Com tudo isso, pode-se concluir que o arucanolídeo é capaz de induzir apoptose em células tumorais humanas e murinas, podendo atuar pela via intrínseca e ou extrínseca de apoptose, dependendo do tipo celular avaliado. A atividade antitumoral in vitro foi confirmada com a redução do crescimento tumoral in vivo, comprovando o potencial farmacológico desse composto / Abstract: Plants have provided a large number of new substances and many drugs have based for the synthesis of them. The dichloromethane crude extract presented antiproliferative activity inhuman tumor cell culture and in vivo antitumor activity against ascitic and solid Ehrlich tumor models. The results obtained with Calea pinnatifida, species from Asteraceae family,may result in the development of new chemotherapeutic agents by the presence of germacranolides (sesquiterpene lactones) in their chemical composition. The arucanolide was obtained by the fractionation of crude dichloromethane extract after the precipitation of chlorophyll and graxes using a lead acetate basic solution. Arucanolide shows antiproliferative activity in vitro against human tumor cells lines with selectivity for melanoma and kidney. It was proved that the arucanolide is capable of inducing apoptosis,by the intrinsic pathway, through caspase avtivation, generating free radicals in U-118 MG glioblastoma and SK-MEL-2 melanoma cells. At the adenocarcinoma of cervix cells HeLa the mechanism by which arucanolide acts may be different, because the intrinsic pathway seems to be not as important as in the others cells, suggesting the involvement of the extrinsic pathway of apoptosis. The use of HeLa cells transfected with the gene of Bcl-xl, has not hindered the induction of apoptosis in these cells, showing the lack of importance of mitochondria in this apoptotic process, while in SK-MEL-2 Bcl-xL cells, the arucanolide treatment significantly reduced the apoptosis induction. In the B16-F10 cells, the arucanolide induces caspase-dependent apoptosis in vitro and has antitumor activity in vivo against the same cell line, in a subcutaneous melanoma model. The apoptosis induction was not detected in vivo, suggesting that arucanolide could act by preventing the tumor cell proliferation in vivo. At the model of experimental metastasis with the melanoma cell lineB16-F10 there is a tendency to reduce lung metastasis in mice treated with arucanolide, showing few signs of liver toxicity. With all this results, we conclude that the arucanolídeois able to induce apoptosis in human and murine tumor cells lines, and its death pathway, depends on the cell type evaluated. This compound may act by intrinsic or extrinsic apoptosis pathways. The arucanolide also reduces tumor growth in vivo and it is a promising new chemotherapic for clinical research / Doutorado / Biologia Celular / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Carmen Silvia Passos Lima / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas. / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_Cristianede_M.pdf: 2437379 bytes, checksum: 5fff08e294a7f4c2d2e6e49723726b29 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os genes P53 e BAX (pró-apoptóticos) e MDM2 e BCL2 (antiapoptóticos) atuam na morte de células epiteliais danificadas por raios ultravioleta (UV) da luz solar e estão relacionados com a origem do melanoma cutâneo (MC). A proteína codificada pelo alelo selvagem Arg do polimorfismo P53 Arg72Pro induz melhor a apoptose do que a do alelo variante Pro. Os alelos variantes G e A dos polimorfismos MDM2 T309G e BCL2 C(-938)A e o alelo variante A do polimorfismo BAX G(-248)A estão relacionados com maior e menor expressão proteica, respectivamente, quando comparados aos alelos selvagens T, C e G. Como são incertos os papéis desses polimorfismos no risco e manifestações clínicas do MC, estes foram os principais objetivos do presente estudo. O DNA genômico de 150 pacientes e de 150 controles foi analisado por meio da reação em cadeia da polimerase e digestão enzimática. As frequências dos genótipos P53 ArgArg (58,7% vs 44,7%, P= 0,02) e BCL2 AA (28,0% vs 15,3%, P= 0,004) foram maiores em pacientes do que em controles. Portadores dos genótipos estiveram sob riscos 1,86 e 2,87 vezes maior de MC do que os demais, respectivamente. Excessos dos genótipos combinados P53 ArgArg + BCL2 AA (36,1% vs 16,9%, P= 0,002) e P53 ArgArg + BAX AA (29,5% vs 15,3%, P= 0,008) foram observados em pacientes comparados a controles. Indivíduos com os respectivos genótipos estiveram sob riscos 3,43 e 2,71 vezes maior de ocorrência do MC do que os demais, respectivamente. Concluímos que os polimorfismos P53Arg72Pro, BCL2 C(-938)A e BAX G(-248)A alteraram o risco de ocorrência do MC em nossa amostra e indivíduos com os genótipos ArgArg, AA e AA dos respectivos polimorfismos devem receber recomendações adicionais para proteção da pele dos efeitos nocivos dos raios UV e seguimento médico com exames dermatológicos periódicos, para prevenção e diagnóstico precoce do tumor / Abstract: The P53 and BAX (proapoptotic) and MDM2 and BCL2 (antiapoptotic) genes remove cells damaged by ultraviolet (UV) rays of the sunlight and, therefore, are related to the cutaneous melanoma (CM) origin. The Arg wild allele of the P53 Arg72Pro polymorphism is more efficient in inducing apoptosis than the variant Pro allele. The variant G and A alleles of the MDM2 T309G and BCL2 C(-948)A polymorphisms, and the A allele of the BAX G(-248) A polymorphism are related to higher and lower expressions of the encoded proteins, respectively, than the wild T, C and G wild alleles. Since the roles of the referred genetic polymorphisms on the risk and clinical manifestation of the tumor are still unclear, these were the main aims of the present study. Genomic DNA from 150 patients with CM and 150 controls was analyzed by polymerase chain reaction and enzymatic digestion. The frequencies of the P53 ArgArg and the BCL2 AA genotypes were higher in patients than in controls (58.7% versus 44.7%, P= 0.02) and (28.0% versus 15.3%, P= 0.004) respectively. Carriers of these genotypes had a 1.86 and 2.87-fold increased risks for MC than others, respectively. Excesses of the P53 ArgArg + BCL2 AA and P53 ArgArg + BAX AA were seen in patients when compared to controls (36.1% versus 16.9%, P= 0.002) and (29.5% versus 15.3%, P= 0.008), and carriers of these genotypes had a 3.43 and 2.71-fold increased risks for CM than others, respectively. We concluded that the P53 Arg72Pro, BCL2 C(-938)A and BAX G(-248)A polymorphisms alter the risk for CM in our sample. We believe that carriers of the ArgArg wild genotype and the variant AA genotypes of the respective genetic polymorphisms should receive additional recommendation to avoid exposition to sunlight and should be frequently evaluated by a dermatologist with the purpose of preventing and performing an early diagnosis of the disease, respectively / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Os melanomas são o tipo mais mortal de câncer de pele, apesar da baixa incidência, 80% das mortes de câncer de pele são devem-se ao melanoma metastático. Novas abordagens farmacológicas e a busca por novos compostos para a terapêutica do melanoma, em aplicações isolados ou em combinação com outros fármacos é imprescindível. Esta busca ocorre principalmente no campo das terapias de alvos específicos, devido à aquisição de resistência tumoral e recidiva. O resveratrol (RES) é um polifenol com atividade anti-oxidante, e seu efeito anti-tumoral foi mostrado pela indução de morte celular, porém o seu estudo não foi aprofundado pela inviabilidade do uso de altas doses in vitro para observação de efeitos celulares. Outro composto, o 2-methoxiestradiol (2ME) é um metabólito do estrógeno cujo efeitos anti-câncer já foi demonstrado em melanoma, porém sem elucidação das vias de sinalização envolvidas. O efeito em células com resistência adquirida também nunca foram testados. Neste estudo ampliamos o painel de linhagens celulares de melanoma humano, e demonstramos que o 2ME induz morte celular, inibe a proliferação destas células sendo que esta inibição está associada a indução de senescência. Pela primeira vez foi observada a inibição de proliferação pelo 2ME em células com a mutação BRAF V600E resistentes ao vemurafenibe (inibidor de BRAF) e duplo resistentes ao vemurafenibe e trametinibe (inibidor de MEK). A inibição de proliferação foi acompanhada pela modulação de p21Cip1, Ciclina B1, pRb, proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular. A exposição prolongada ao 2ME inibiu a formação de colônias em todas as linhagens de melanoma (não resistentes e resistentes), mas não teve o mesmo efeito em fibroblastos primários, mostrando efeito seletivo. Em modelo tridimensional de esferóides, foi observado que as linhagens resistentes (Sk-Mel-28R) e duplo resistentes (Sk- Mel-28RT) são mais invasivas que a parental (Sk-Mel-28). Neste modelo, o 2ME foi capaz de inibir a invasão e viabilidade destas células. No modelo de pele reconstituída, na ausência de tratamento, observa-se invasão das células de melanoma pela derme, porém este fenômeno é diminuído quando as peles são tratadas com 2ME. Estes resultados demonstram que o 2ME é um efetivo agente anti-melanoma, independente de sua resistência. / Melanomas are the deadliest type of skin cancer, and in spite of the low incidence, 80% of the skin cancer associated death cases are due to metastatic melanoma. New pharmacological approaches and the search of new compounds for melanoma therapeutics, for monotherapy or combination therapy, are essential. This search occurs mainly in the targeted therapy field because of the melanoma acquisition of resistance to the current treatments. Resveratrol (RES) is a polyphenol with anti-oxidant activity, and its anti-tumor effect has been shown through the induction of cell death. However, the study of this compound has been discontinued in this work due to the impossibility of using high doses in vitro for the observation of cellular effects. Another compound, 2-methoxyestradiol (2ME) is a metabolite from estrogen, and its anti-cancer effects has already been shown in melanoma, but with no elucidation of the signaling pathways involved. Furthermore, the effects in cells with acquired resistance have never been shown. In this study we used a broader panel of human melanoma cell lines and demonstrated that 2ME induces cell death, inhibits proliferation of these cells, and this inhibition is associated with the induction of cell senescence. The inhibition of proliferation caused by 2ME was observed for the first time in BRAF V600E cells that are resistant to Vemurafenib (BRAF inhibitor) and double resistant to Vemurafenib and Trametinib (MEK inhibitor). The proliferation inhibition was related to the modulation of p21Cip1,Cyclin B1 and pRb, which are proteins involved in cell cycle regulation. Long exposure to 2ME in colony formation assay showed the inhibition of colony in all melanoma cell lines (regardless of resistance and mutational status), but not in primary fibroblasts, showing selective effect. In three-dimensional spheroid model, it was observed that the resistant (Sk-Mel- 28R) and double-resistant (Sk-Mel-28RT) cell lines were more invasive than the parental cell line (Sk-Mel-28). In this model, 2ME was able to inhibit cell invasion and cell viability. In the skin reconstruct model, in the absence of treatment, melanoma cell invasion can be observed in the dermis layer. However, after the treatment with 2ME these cell invasion foci are inhibited. Altogether, these effects demonstrate that 2ME is an effective anti-melanoma agent, regardless of resistance.