O uso de Derivação Ventricular Externa (DVE) é necessário para o tratamento de muitas doenças, como Traumatismo Cranioencefálico (TCE) e Hemorragia Subaracnoide (HSA). As meningites e ventriculites são complicações frequentes desse uso. Neste trabalho buscamos determinar sensibilidade, especificidade e ponto de corte para o Índice de Celularidade (IC) em pacientes com TCE, HSA e acidente vascular cerebral hemorrágico (AVCh). Nossa população de estudo foi composta por pacientes com diferentes doenças de base e poucos resultados de cultura de líquor positiva. Para diagnóstico das infecções foram utilizados os critérios do CDC. A análise global do IC mostrou uma área sob a curva de 0,982. O ponto de corte geral do IC com o valor de 2,9 tem uma sensibilidade de 95% e uma especificidade de 92,9%. Nos pacientes com HSA obtivemos uma área sob a curva de 1,0 com o IC de 2,7. A sensibilidade e especificidade foram de 100%. Também foi analisada a variação relativa do IC. Para esta análise, a área sob a curva foi de 0,882 e um aumento de 4,33 vezes no IC demonstrou ser indicativo de infecção (p=0,002), dados estes semelhantes aos da literatura. Também foi feito Heatmap do IC, mostrando que ele dificilmente volta ao normal em pacientes com meningite, mesmo após o tratamento. Logo, o IC mostrou-se valioso para diagnóstico de infecção e inadequado para o acompanhamento do tratamento. Esperamos utilizar em nossa instituição o novo ponto de corte proposto por este trabalho com o intuito de melhorar desfechos clínicos. / The use of an external ventricular drain (EVD) is required for the treatment of many diseases, such as traumatic brain injury (TBI) and subarachnoid hemorrhage (SAH). Meningitis and ventriculitis are frequent complications arising from the use of EVD therapy. This study aimed to determine the sensitivity, specificity, and cutoff point for cellularity index (CI) in patients with TBI, SAH, and hemorrhagic stroke. Our study population consisted of patients with different underlying diseases and few culture-positive CSF samples. The diagnosis of infections was based on CDC criteria. Overall CI analysis showed an area under the curve (AUC) of 0.982. The cutoff of 2.9 for overall CI provided a sensitivity of 95% and a specificity of 92.9%. In patients with SAH, the AUC was 1.0 for a CI of 2.7; furthermore, sensitivity and specificity were 100%. The relative variation of the CI was also assessed. This analysis revealed an AUC of 0.882, and a 4.33-fold increase was found be indicative of infection (p=0.002), findings similar to those of the literature. Additionally, a heatmap analysis demonstrated that the CI is unlike to return to normal in patients with meningitis, even after treatment. Therefore, this index showed to be valuable for the diagnosis of infection, but was inadequate for monitoring treatment. We hope to use the new cutoff point proposed by this study in our institution to improve patient clinical outcomes.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / A meningite pneumocócica é umas das mais complexas e graves infecções do sistema nervoso central (SNC) associada com distúrbios neurológicos e neuropsicológicos. Os compostos bacterianos são mediadores pró-inflamatórios que induzem a resposta imune e a degradação do triptofano através da via da quinurenina e podem contribuir para lesão do SNC associada com meningite bacteriana. A falta de uniformidade nos danos gera dificuldade para avaliar a severidade e o grau dos prejuízos neuronais, criando obstáculos para novas terapias no tratamento. A vitamina B6 atua como co-fator de enzimas que catalisam um grande número de reações envolvidas no metabolismo do triptofano, impedindo o acúmulo de intermediários neurotóxicos, podendo prevenir danos ao hospedeiro. A vitamina B9 desempenha um papel importante na neuroplasticidade e preservação da integridade neuronal e tem sido postulada como anti-depressiva, anti-maníaca e neuroprotetora. No presente estudo, foram avaliados os efeitos da vitamina B6 e B9 sobre a memória, parâmetros de estresse oxidativo, níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e integridade da barreira hematoencefálica (BHE) no hipocampo e córtex de ratos Wistar adultos submetidos à meningite pneumocócica. Os animais receberam injeção na cisterna magna de 10 μL de suspensão de Streptococcus pneumoniae ou líquido cefalorraquidiano (LCR) artificial para o grupo controle. Grupos experimentais vitamina B6: controle/salina; controle/B6; meningite/salina e meningite/B6 e receberam 360 μL de vitamina B6 (600 mg/kg) ou salina estéril por via subcutânea em 0 e 18 horas após a indução da meningite. Grupos experimentais vitamina B9: controle/salina; controle/B9 10 mg/Kg; controle/B9 50 mg/Kg; meningite/salina, meningite/B9 10 mg/Kg e meningite/B9 50 mg/Kg. A vitamina B9 foi dissolvida em água e administrada via oral por gavagem iniciando o tratamento 18 horas após a indução e seguindo por 7 dias, 1 vez ao dia. Os parâmetros de estresse oxidativo foram avaliados em 24 horas e 10 dias após a indução da meningite. A integridade da BHE foi avaliada em 12, 18 e 24 horas após a indução. Os parâmetros comportamentais foram avaliados em 10 dias após a indução da meningite pelos testes de habituação ao campo aberto, esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. Após, os animais foram mortos por decapitação para avaliação dos níveis de BDNF. Em 24 horas após a indução da meningite houve um aumento dos níveis de TBARS, carbonilação de proteínas, nitrito/nitrato e atividade da MPO no hipocampo e córtex pré-frontal; a atividade da SOD foi diminuída no hipocampo e aumentada no córtex pré-frontal e não houve diferença na atividade da CAT no hipocampo, enquanto que no córtex pré-frontal foi diminuída no grupo meningite/salina. Dez dias após a indução, os parâmetros de estresse oxidativo se mantiveram aumentados. Houve quebra da BHE em todos os tempos avaliados e o tratamento com ambas as vitaminas preveniu essa disfunção. Nos animais submetidos à meningite o tratamento com vitamina B6 e B9 preveniu o comprometimento cognitivo e aumentou os níveis de BDNF no hipocampo. O tratamento com vitamina B6 e B9 foi capaz de prevenir estresse oxidativo, quebra da BHE, aumentar os níveis de BDNF e prevenir danos cognitivos em ratos Wistar submetidos à meningite por S. pneumoniae.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 198280 bytes, checksum: 2e22264df93097f0e349bfa39abd6bcd (MD5) Previous issue date: 2003-09-05 / The present work was developed with the objective to determine the efficiency of an autogenous bacterin against Streptococcus suis serotype 2 and to test route and inoculation doses. Two experiments were accomplished with 64 animals in each experiment. In the Experiment I, 32 animals were vaccinated and 32 animals received placebo, being both groups challenged at the 60 days of age. In the Experiment II, the animals were divided in four groups: NVIP - 16 animals not vaccinated and challenged by the intraperitoneal route; VIP - 16 vaccinated animals and challenged by the intraperitoneal route; NVIV - 16 animals not vaccinated and challenged by the intravenous route; and VIV - 16 vaccinated animals and challenged by the intravenous route. All the groups were challenged at the 88 days of age. In the Experiment I, it was not possible to detect significant difference in the protection, clinical signs and lesions (P>0.05) among the groups not vaccinated and vaccinated. However, the isolation of S. suis and the average of the bacterial count was higher (P <0.01) in the group not vaccinated. The results observed in Experiment II in the groups NVIV and VIV presented protection, clinical signs and lesions similar (P>0.05), and the number of animals with positive isolation of S. suis and the average of the bacterial count was higher in the group NVIV (P<0.05). The groups NVIP and VIP presented significant difference for protection, clinical signs, lesions, number of positive isolations and average of the bacterial agent count (P <0.01). The intravenous challenge route was not appropriate for that experiment type and the intraperitoneal route presented favorable aspects. The vaccine was efficient for prevention of the infection with high virulent S. suis serotype 2, protecting the animals with an efficiency of 87.5 percent. / O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de determinar a eficácia de uma bacterina autógena na proteção de suínos desafiados com Streptococcus suis sorotipo 2 de alta virulência e testar vias e doses de inoculação do agente. Foram realizados dois experimentos com 64 animais em cada experimento. No Experimento I, 32 animais foram vacinados aos 21 e 45 dias de idade, através de injeção intramuscular de 2 e 3 mL da bacterina, respectivamente. Os 32 animais restantes constituíram o grupo controle não vacinado. Aos 60 dias de idade os 64 animais foram desafiados via intravenosa, na dosagem de 8,6 x 109 UFC. No experimento II, 64 animais foram divididos em dois grupos de 32 animais. Um grupo foi vacinado aos 25 (2 mL) e 50 (3 mL) dias de idade, por via intramuscular, e o outro constituiu o grupo controle não vacinado. Os animais foram desafiados aos 88 dias de idade na dosagem de 7,2 x 109 UFC. Para efeito de desafio, os animais foram divididos em quatro grupos: NVIP - 16 animais não vacinados e desafiados pela via intraperitoneal; NVIV - 16 animais não vacinados e desafiados pela via intravenosa; VIP 16 animais vacinados e desafiados pela via intraperitoneal; e VIV - 16 animais vacinados e desafiados pela via intravenosa. No Experimento I, não foi possível detectar diferença significativa na proteção, sinais clínicos e lesões (p>0.05) entre os grupos não vacinado e vacinado. Só foi possível detectar diferença significativa no número de animais com isolamento positivo do S. suis e na média da contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de S. suis (P<0.01). Os resultados observados no Experimento II, foram: 1) os grupos NVIV e VIV apresentaram proteção, sinais clínicos e lesões similares (P>0.05), e o número de animais com isolamento positivo do S. suis e a média da contagem de colônias de S. suis foi mais elevada no grupo NVIV (P<0.01), confirmando os resultados apresentados no Experimento I; e 2) os grupos NVIP e VIP apresentaram diferenças significativas para proteção, sinais clínicos, lesões, número de isolamentos positivos e média da contagem bacteriana do agente (P<0.01). O grupo NVIP apresentou 5/16 mortes e 11/16 sobreviventes doentes, enquanto que o grupo VIP teve 14/16 sobreviventes sadios e 2/16 de sobreviventes doentes, não apresentando nenhuma morte. A temperatura retal no grupo NVIP foi, em média, 0,5o C superior à do grupo VIP (P<0.01). O escore médio dos sinais clínicos nos grupos NVIP e VIP foi de 1,10±0,10 e 0,34±0,05, respectivamente, sendo mais elevado no grupo não vacinado (P<0.05). O escore médio das lesões também foi mais elevado no grupo NVIP (0,89±0,19) em relação ao grupo VIP (0,20±0,08) (P<0.05). O isolamento do S. suis foi positivo em 9/16 animais do grupo NVIP, com média da contagem bacteriana de 295,25±91,62 UFC/mL, sendo que no grupo VIP não foi possível isolar o agente em qualquer dos animais. A proteção da vacina para os animais desafiados pela via intraperitoneal foi calculada em 87,5%. Portanto, a via de desafio utilizada influenciou nos sinais clínicos, lesões e isolamento bacteriano dos animais vacinados e não vacinados. A via intravenosa não se mostrou adequada para esse tipo de experimento e a via intraperitoneal apresentou aspectos favoráveis. Finalmente, a vacina mostrou ser eficaz na prevenção da infecção pelo S. suis sorotipo 2 de alta virulência, protegendo os animais com uma eficiência estimada de 87,5%.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeonamGC.pdf: 218692 bytes, checksum: 002840894937241c14e673ee875d7524 (MD5) Previous issue date: 2008-03-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Activation of the kynurenine (KYN) pathway (KP) by modulators of immune system has been observed during several neurological diseases. Here we assessed the association of chemo-/cytokine levels with the concentration of KP metabolites in cerebrospinal fluid (CSF) and plasma samples from patients with bacterial meningitis (BM). All samples were collected from 42 patients diagnosed with acute bacterial meningitis (ABM), aseptic meningitis, tuberculous meningitis and patients without infection neurological disorders. CSF and plasma concentration of metabolites from the KP was assessed by high pressure liquid chromatography (HPLC) and cytokines and chemokines by Bio-plex 200 suspension array system. Concentrations of the KP metabolites KYN and kynurenic acid (KYNA) were significantly higher in CSF of patients with ABM compared to other groups. Tryptophan (TRP), anthranilic acid (AA), 3-hydroxykynurenine (3HK) and 3-hydroxyanthranilic acid (3HAA) did not show statistical significance, although some of them presented a good accumulation during ABM. The expression of TNF-alpha, IL-6, IL-1beta, IFN-gamma, IL-10, IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra), MIP-1alpha, MIP-1beta, MCP-1 and G-CSF was about 100-fold higher in CSF from ABM patients than other infected groups. In all CSF and plasma samples, the concentration of IL-2, IL-12(p70), IL-4, IL-8 and GM-CSF was not significant. ABM still showed significant concentrations of IL-6, IL-10, IL-1Ra and MCP-1 in plasma samples. Based on the comparison of KP metabolites concentrations between plasma and CSF samples we conclude that the activation of the tryptophan pathway upon BM occurs within the brain. This increase in KP metabolites is most due to activation of the KP by molecules as IFN-gamma and TNF-alpha in response to infection. / A ativa??o da rota da quinurenina por moduladores do sistema imune tem sido observada durante diversas doen?as neurol?gicas. Neste trabalho foi avaliado a associa??o entre os n?veis de citocinas e quimiocinas com a concentra??o dos metab?litos da rota da quinurenina ( Kynurenine pathway KP) em amostras de l?quor e plasma de pacientes com meningite bacteriana. Todas as amostras foram coletadas de 42 pacientes hospitalizados com o diagn?stico de meningites bacteriana aguda, tubercul?sica, ass?ptica e pacientes cujo diagn?stico excluiu infec??o no sistema nervoso central. As concentra??es dos metab?litos da quinurenina foram avaliadas pela cromatografia l?quida de alta press?o enquanto os n?veis de citocinas e quimiocinas foram medidos pelo Bio-plex 200 suspension array system. Concentra??es de quinurenina e ?cido quinur?nico foram significativamente mais elevadas no l?quor de pacientes com meningite bacteriana aguda do que nos outros grupos. Ainda no l?quor, os n?veis de triptofano, ?cido antran?lico, 3-hidroxiquinurenina e ?cido 3-hidroxiantran?lico n?o mostraram signific?ncia estat?stica, embora alguns deles apresentaram um bom ac?mulo durante meningite bacteriana aguda. No l?quor dos pacientes com meningite bacteriana foram observados n?veis mais elevados de TNF-alfa, IL-6, IL-1beta, IFN-gama, IL-10, IL-1Ra, MIP-1alpha, MIP-1beta, MCP-1 e G-CSF do que os outros grupos infectados. Em todas as amostras, as concentra??es de IL-2, IL-12(p70), IL-4, IL-8 e GM-CSF n?o variaram significativamente. No grupo com meningite bacteriana aguda foram tamb?m observadas elevadas concentra??es de IL-6, IL-10, IL-1Ra e MCP-1 no plasma. Baseado na compara??o das concentra??es dos metab?litos da via quinurenina no l?quor e no plasma, conclui-se que a ativa??o desta via metab?lica durante a meningite ocorre primordialmente dentro do c?rebro. O aumento na concentra??o dos metab?litos da quinurenina durante a infec??o deve-se ativa??o da enzima idoleamina 2,3 dioxigenase por prote?nas da resposta imune hospedeira principalmente pelo IFN-gama, IL1beta e TNF-alfa.

A validação de limpeza de equipamentos é requisito regulatório para assegurar que os procedimentos de limpeza removem os resíduos de produto e agente de limpeza existentes até um nível de aceitação pré-determinado, garantindo que não haja contaminação cruzada. A metodologia analítica escolhida para monitorar a ocorrência de contaminação cruzada foi a determinação de carbono orgânico total (TOC) por ser uma técnica não específica permitindo assim quantificar os resíduos antes e após o procedimento de limpeza. Para execução desta validação foi selecionado o pior caso em relação ao contaminante. A vacina Hib foi escolhida como pior caso, pois possui maior aderência ao aço inox 316L, apresentando uma menor percentagem de recuperação, quando comparada à vacina Meningite A e C, sendo respectivamente de 93,0% e 98,4% para o tempo de extração de 30 segundos e 67,8% e 72,6% para o tempo de extração de 10 segundos. O resíduo aceitável de produto em água de rinsagem foi de 0,0007 g/mL de polissacarídeo (0,49 g/mL de TOC) e em swab foi de 0,006 g/mL de polissacarídeo (3,49 g/mL de TOC). As amostras retiradas para determinação de resíduo de produto foram analisadas e corrigidas pelo fator de recuperação deste resíduo para amostras de água de rinsagem que é de 98,5% e para amostras em swab que é de 98,4%. Já o resíduo aceitável para agente de limpeza (NaOH) foi de 3,5 g/mL que fornece um pH de 9,94, porém não existem evidências que a concentração calculada de resíduo de NaOH não interferirá quimicamente ao entrar em contato com a vacina. Assim o critério adotado foi o mesmo da água para injetáveis, segundo USP que é pH entre 5 e 7. As amostras retiradas para determinação de resíduo de agente de limpeza não foram corrigidas pelo fator de recuperação uma vez que o critério utilizado é muito mais crítico que o calculado. Todas as análises realizadas apresentaram resultados dentro dos parâmetros aceitáveis permitindo a conclusão de que o procedimento de limpeza para tanque de aço inox 316L é eficiente removendo os resíduos até níveis aceitáveis, evitando assim uma contaminação cruzada / The cleaning validation of equipments is a regulatory requirement to ensure that the procedure to remove residues of the product and the cleaning agent to a level of acceptance, ensuring no cross contamination. The analytical methodology chose to monitor the occurrence of cross-contamination was the determination of total organic carbon (TOC) as it is a non-specific technique allowing to quantify the residues before and after the cleaning procedure. For the execution of the validation it was selected the worst case regarding contaminant. The Hib vaccine was chosen as the worst case because it has greater adherence to stainless steel 316L, with a lower percentage of recovery when compared to vaccine meningitis A and C, being respectively 93.0% and 98.4% for the extraction time of 30 seconds and 67.8% and 72.6% for the extraction time of 10 seconds. The considered acceptable product residue in the rinsing water was 0.0007 mg/mL of polysaccharide (0.48 mg/mL of TOC) and in swab it was 0.006 mg/mL of polysaccharide (3.49 mg/mL of TOC). Samples took for determination of residual product has been analyzed and corrected by the recovery factor for this waste water samples by rinsing which is 98.5% and for samples in swab that is 98.4%. The acceptable residue for the cleaning agent (NaOH) was 3.512 mg/mL which provides a pH of 9.94, but there is no evidence that the concentration of residual NaOH does not chemically interfere in contact with the vaccine. Thus, the criterion used was the same as for water for injection, according to USP, that is between pH 5 and 7. Samples took for the determination of residual cleaning agent were not corrected by the recovery factor because the criterion used is much more critical than that calculated. All the analysis results were within the acceptable parameters allowing to conclude that the cleaning procedure for 316L stainless steel tank was effective, removing the waste to acceptable levels, thus, preventing from cross-contamination

O uso de Derivação Ventricular Externa (DVE) é necessário para o tratamento de muitas doenças, como Traumatismo Cranioencefálico (TCE) e Hemorragia Subaracnoide (HSA). As meningites e ventriculites são complicações frequentes desse uso. Neste trabalho buscamos determinar sensibilidade, especificidade e ponto de corte para o Índice de Celularidade (IC) em pacientes com TCE, HSA e acidente vascular cerebral hemorrágico (AVCh). Nossa população de estudo foi composta por pacientes com diferentes doenças de base e poucos resultados de cultura de líquor positiva. Para diagnóstico das infecções foram utilizados os critérios do CDC. A análise global do IC mostrou uma área sob a curva de 0,982. O ponto de corte geral do IC com o valor de 2,9 tem uma sensibilidade de 95% e uma especificidade de 92,9%. Nos pacientes com HSA obtivemos uma área sob a curva de 1,0 com o IC de 2,7. A sensibilidade e especificidade foram de 100%. Também foi analisada a variação relativa do IC. Para esta análise, a área sob a curva foi de 0,882 e um aumento de 4,33 vezes no IC demonstrou ser indicativo de infecção (p=0,002), dados estes semelhantes aos da literatura. Também foi feito Heatmap do IC, mostrando que ele dificilmente volta ao normal em pacientes com meningite, mesmo após o tratamento. Logo, o IC mostrou-se valioso para diagnóstico de infecção e inadequado para o acompanhamento do tratamento. Esperamos utilizar em nossa instituição o novo ponto de corte proposto por este trabalho com o intuito de melhorar desfechos clínicos. / The use of an external ventricular drain (EVD) is required for the treatment of many diseases, such as traumatic brain injury (TBI) and subarachnoid hemorrhage (SAH). Meningitis and ventriculitis are frequent complications arising from the use of EVD therapy. This study aimed to determine the sensitivity, specificity, and cutoff point for cellularity index (CI) in patients with TBI, SAH, and hemorrhagic stroke. Our study population consisted of patients with different underlying diseases and few culture-positive CSF samples. The diagnosis of infections was based on CDC criteria. Overall CI analysis showed an area under the curve (AUC) of 0.982. The cutoff of 2.9 for overall CI provided a sensitivity of 95% and a specificity of 92.9%. In patients with SAH, the AUC was 1.0 for a CI of 2.7; furthermore, sensitivity and specificity were 100%. The relative variation of the CI was also assessed. This analysis revealed an AUC of 0.882, and a 4.33-fold increase was found be indicative of infection (p=0.002), findings similar to those of the literature. Additionally, a heatmap analysis demonstrated that the CI is unlike to return to normal in patients with meningitis, even after treatment. Therefore, this index showed to be valuable for the diagnosis of infection, but was inadequate for monitoring treatment. We hope to use the new cutoff point proposed by this study in our institution to improve patient clinical outcomes.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:20:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RafaellaFabianaCarneiro_M.pdf: 1664553 bytes, checksum: 346b9075da4d999b30fc615fe83733fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neisseria meningitdis, ou meningococo, é uma bactéria comensal da nasofaringe humana. Contudo, algumas linhagens meningocócicas ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica e causam enfermidades como meningite e septicemia. Como a espécie humana é o único hospedeiro natural para esse patógeno, estudos in vitro com modelos celulares são uma ferramenta importante para a análise da interação entre o meningococo e seu hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes linhagens de N. meningitidis na adesão celular, morfologia e expressão de quimiocinas inflamatórias em culturas in vitro de células humanas. Tais parâmetros também foram avaliados em um sistema in vitro de co-cultura celular entre células de origem nervosa e endotelial a fim de mimetizar a barrreira hematoencefálica humana. Os resultados obtidos indicam que a adesão de diferentes linhagens bacterianas em células humanas de sítios específicos do processo infeccioso do meningococo, como Hep-2 (laringe), NCIH460 (pulmão), Hec1b (endotelial) e NG97 (neuroglia) foi capaz de mimetizar o processo fisiopatológico deste microrganismo. Em condições in vitro, células de origem nervosa mostraram-se mais suscetíveis à infecção nos parâmetros avaliados como uma elevada expressão de TNF-?, quimiocina característica em infecções meningocócicas. A linhagem B4 destacou-se entre as linhagens meningocócicas estudadas, apresentando elevados percentuais de adesão em células humanas com valor máximo de adesão em NG97. Células HEp-2 apresentaram poucas alterações morfológicas significativas frente à infecção por N. meningitidis. Tais resultados podem estar associados ao fato do trato respiratório superior ser o habitat natural do meningococo, no qual a interação entre este patógeno e as células hospedeiras seja comensal e não-invasiva. O modelo mimético de barreira hematoencefálica, realizado em transwell, indicou comunicação entre as células que o compõem e uma maior expressão dos níveis de quimiocinas inflamatórias quando comparada à infecção desta bactéria por cada uma das células estudadas isoladamente. Tal modelo foi capaz de mimetizar a barreira hematoencefálica, fato o que torna possível sua aplicação em estudos da passagem de fármacos e outros patógenos por essa barreira. / Abstract: Neisseria meningitidis,or meningococci, is a commensal bacterium of the human nasopharynx. However, occasionally some meningococcal strains can cross the respiratory mucosa and the blood-brain barrier and cause life-threatening diseases such as meningitis and septicaemia. Since the human species is the only natural host for this pathogen, in vitro studies with cellular models are an important tool for the analysis of the meningococci and its host. The aim of this present work was to value the influence of several strains of N. meningitidis in cellular adhesion, morphology and inflammatory chemokines expression in human cells cultivated in vitro. These parameters were also evaluated in a co-cultivated cellular system with glial and endothelial cells aiming mimicking the human blood brain barrier. The results indicate that the adhesion of different bacterial strains from specific sites of infectious process of meningococci as Hep-2 (larynges), NCIH460 (lung), Hec1b (endothelial) and NG97 (glial cells) was capable of mimicking, partially, the pathophysiology of this microorganism. In in vitro conditions, cells from nervous origin showed more susceptibility to infection then others in this evaluated parameters such as a high TNF-? expression, a common chemokine in meningococcals diseases. The B4 strain distinguished from the others by presenting high rates of adhesion in human cells with maximum value on NG97. HEp-2 cells showed few expressives morphologic alterations after meningococcal infection. These results may be associated with the fact that the upper human respiratory tract is the meningoccci natural habitat, in which the interaction between this pathogen and host cells are commensal and not-invasive.The mimicking blood-brain barrier model, performed in transweel, has demonstrated some communication between the cells and greater expression of inflammatory chemokines when compared to the infection in isolated cells. This model was capable of mimicing the blood-brain barrier, which makes its application possible in studies of drugs and others pathogens who might crossover though this barrier. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:47:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_DaniloAntonini_M.pdf: 4789463 bytes, checksum: cb7f3cabfd7df63e9dc00316cb7c8a10 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Vesículas da membrana externa ou outer membrane vesicles (OMV) são nanopartículas liberadas no meio de cultura durante o crescimento bacteriano resultantes de evaginações da membrana externa. A OMV é composta por antígenos presentes na membrana externa bacteriana, como porinas e lipo-oligossacarídeos - LOS, proporcionando a estas estruturas um efeito imuno-estimulatório, sendo alvo potencial para a produção de vacinas. Este trabalho teve como objetivo analisar a utilização de OMV de Neisseria meningitidis IAL 2443, linhagem pertencente ao sorogrupo B causadora de meningites no estado de São Paulo, com nanopartículas de sílica mesoporosa SBA-15 e SBA-16 no processo de imunização vacinal. Utilizou-se o processo fermentativo em estado semi-sólido para o crescimento bacteriano e um processo de ultracentrifugação para isolamento da OMV. Comparou-se a produção de OMV de linhagens de N. meningitidis selvagens IAL 2443 e C2135 e mutante knock-out para o gene responsável pela produção de pilina - C2135_pilE. A atividade imunológica foi verificada por meio da imunização em camundongos Swiss e a verificação da citotoxicidade foi realizada em cultura celular utilizando células VERO e NHI 3T3. Os resultados mostraram que as diferentes linhagens de N. meningitidis possuem cinéticas de produção de OMVs distintas em tempo e quantidade. A não expressão de pilE também afeta a cinética da produção dessas estruturas. O uso de adjuvantes de sílica mesoporosa SBA- 15 e SBA- 16 com a OMV IAL 2443 aumenta o reconhecimento pelo sistema imunológico, consequentemente elevando o número de anticorpos específicos frente a mesma cepa bacteriana e a outras linhagens do mesmo sorotipo e sorotipos diferentes. O teste de citotoxicidade em células VERO e NHI 3T3 demonstrou inocuidade nas preparações com SBA- 15 e SBA- 16, atestando a segurança no uso destas preparações como adjuvantes vacinais. O estudo demonstrou que a metodologia utilizada para produção de OMV é vantajosa do ponto de vista quantitativo e econômico e o uso de SBA- 15 e SBA- 16 apresenta potencial como adjuvante em vacinas baseadas em OMV / Abstract: Outer membrane vesicles or OMV are nanoparticles released into the culture medium during bacterial growth resulting from evaginations of the outer membrane. The OMV consists of antigens present in the bacterial outer membrane, like porins and lipooligosaccharides - LOS, these structures provide an immuno-stimulatory effect, and potential target for vaccine production. This study aimed to analyze the use OMV of Neisseria meningitidis IAL2443, belonging to serogroup B strain causing meningitis in São Paulo, as vaccine using the mesoporous silica SBA-15 and SBA-16 in the immunization process. Fermentation process was used in semi-solid state for bacterial growth and a process of ultracentrifugation for the isolation these OMV. It was compared to OMV production of strains of N.meningitidis strains IAL 2443 and C2135, and knock-out mutant for the gene responsible for producing pilin - C2135_pilE. The immunological activity was measured by immunization in Swiss mice and verification of cytotoxicity was performed in cell culture using VERO cells and NIH 3T3. The results showed that different strains of N. meningitidis have OMVs kinetics of production of different time and quantity. The expression does not pile also affects the kinetics of production of these structures. The use of adjuvants mesoporous silica SBA-15 and SBA-16 with the IAL2443 OMV increases the recognition by the immune system, thus bringing the number of specific antibodies against the same bacterial strain and other strains of the same serotype and different serotypes. The cytotoxicity test in NIH 3T3 cells showed VERO and safety in preparation adjuvanted with SBA-15 and SBA-16, confirming the safe use of these preparations as vaccine adjuvants. The study showed that the methodology used for the production of OMV is advantageous from the point of view of quantity and cost and use of SBA-15 and SBA-16 has potential as an adjuvant in vaccines based on OMV / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A tecnologia de conjugação melhorou a imunogeniddade de vacinas constituídas de polissacarídeo, especialmente em crianças. Polissacarídeos conjugados a proteínas carregadoras, como o toxóide tetânico, induzem resposta imunológica dependente de célula T e memória imunológica de longa duração. No entanto, esta tecnologia apresenta custo elevado. Assim, foi investigada a capaddade dos lipossomos de aumentar a resposta imunológica ao polissacarídeo C de Neisseria meningitidis (PSC). Camundongos foram imunizados com Iipossomos contendo PSC, conjugado toxóide tetânico-PSC ou PSC livre como controle, com dose de reforço constituída de PSC livre. Foram gerados anticorpos IgG e IgM contra PSC nos camundongos imunizados com conjugado ou Iipossomo. Os resultados mostram que lipossomos contendo PSC têm potencial para substituir a vadna conjugada toxóide tetânico-PSC. / Conjugation technology has improved the immunogenicity of polysaccharide vaccines, specially in small children. Polysaccharides conjugated to various carrier proteins, e.g. tetanus toxoid, stimulate a T cell-dependent antibody response and induce a long-term immunological memory. However, protein-polysaccharide conjugation technology is expensive and this could constitute an important drawback. Thus, immunopotentiation of Neisseria meningitidis serogroup C polysaccharide (PSC) by use of liposomes as an alternative to protein-polysaccharide C conjugates was investigated. Mice were immunized with liposomes containing PSC or tetanus toxoid-PSC conjugate or free PSC as control and boosted with free PSC. Immunogenicity of these different preparations was compared with each other. Conjugate and liposome containing PSC induced both IgG and IgM antibodies against the polysaccharide. These results show that liposomes containing entrapped PSC have potential to be used as an alternative to tetanus toxoid-PSC conjugate vaccine.

Enterovírus (HEV), herpesvírus 1 e 2 (HHV-1 e HHV-2) e adenovírus (HAdV) são importantes agentes de infecções do SNC. Neste trabalho, técnicas moleculares foram aplicadas para a detecção destes vírus em quadros de infecção do SNC. Amostras de líquor foram colhidas de pacientes atendidos no HU-USP entre agosto e novembro/2010 e fevereiro/2012 a janeiro/2013. Através da Nested-PCR HEV foram detectados em 9,8% das amostras, HAdV em 2,5% e HHV-1 e 2 em 1,1%, além de 3 casos de coinfecção, 2 entre HEV e HHV, e 1 entre HEV e HAdV. O material genético viral foi extraído através dos métodos Qiaamp DNA Blood (Qiagen®) e MagMAXTM Viral RNA Isolation (Ambiom), e este último pareceu mais adequado à aplicação na rotina clínica. A análise quimiocitológica do líquor mostrou-se importante no direcionamento da conduta clínica, mas a detecção do vírus é fundamental para a conclusão do diagnóstico. A PCR em tempo real, cuja padronização foi iniciada neste trabalho, consiste em importante ferramenta para a utilização futura no diagnóstico complementar das infecções virais do SNC. / Enteroviruses (HEV), herpesviruses 1 and 2 (HHV-1 and HHV-2) and adenoviruses (HAdV) are important causative agents of infections of the CNS. In this study, molecular techniques were applied to the detection of these viruses. CSF samples were collected from patients treated at the University Hospital of USP, between August and November, 2010, and February 2012 and January 2013. By the Nested-PCR reaction, HEV were detected in 9.8% of the samples, HAdV in 2.5% and HHV-1 and 2 in 1.1%. There were 3 cases of coinfection: 2 with HEV and HHV and other with HEV and HAdV. The viral genetic materials were extracted by QIAamp DNA Blood kit (Qiagen®) and MagMAXTM Viral RNA Isolation (Ambiom), and the second one showed to be more suitable for the application in clinical diagnosis. The CSF chemocytologic analysis proved to be important in directing the clinical conduct, but the detection of viruses is essential for the diagnosis. The real time PCR, which standardization was initiated in this work, will be an important tool for complementary diagnosis of viral infections of the CNS.