Die fünf CSS-Domänen Phosphodiesterasen aus Escherichia coli K12 (E. coli) gehören zu den weit verbreiteten c-di-GMP-PDEs. Ein Vertreter, PdeC, wurde bereits von Herbst et al. (2018) charakterisiert. Durch DsbA/DsbB geförderte Disulfidbrückenbindung (DSB) in der CSS-Domäne von PdeC wird die PDE-Aktivität des Proteins gehemmt. Gegenteilig ist die freie Thiolform, in Abhängigkeit von der TM2 als Dimerisierungs-Domäne, enzymatisch aktiver. Diese Form wird von den periplasmatischen Proteasen DegP und DegQ prozessiert. Ein irreversibel aktiviertes TM2+EAL-Fragment wird generiert, dass durch weitere Proteolyse langsam entfernt wird. Die Reduktion der CSS-Domäne von PdeC zur der freien Thiolform stimuliert die PDE-Aktivität der EAL-Domäne in vitro. Zusammen mit den Daten von Herbst et al. (2018) wird die CSS-Domäne in dieser Arbeit als eine neue sensorische Domäne charakterisiert, dessen Aktivität durch einen DSB/Thiol-Schaltmechanismus reguliert wird. Alle fünf CSS-Domänen-PDEs von E. coli K12 weisen eine ähnliche Domänenarchitektur auf, jedoch unterscheiden sich Redox-Biochemie, Proteolyse und PDE-Aktivität innerhalb dieser Proteinfamilie. Auf Basis der PDE-Aktivität von Nicht-DSB-Varianten wurden PdeB, PdeC und PdeG als aktivierbare (Reduktion steigert die PDE-Aktivität) und PdeD und PdeN als nicht aktivierbare (Reduktion inaktiviert PDEs) charakterisiert. Ein weiterer Vertreter de CSS-Domänen PDEs, PdeN, scheint nicht über die Ausbildung einer DSB in der CSS-Domäne reguliert und aktiviert zu werden. Nach erfolgter Proteinbiosynthese wird die Proteinkonzentration vielmehr über den N-Terminus reguliert, wobei saure Wachstumsbedingungen das Protein maßgeblich induzieren und die Aktivität erhöhen. Wird das Protein erfolgreich in die Membran eingelagert, kann es bedingt durch die strukturelle DSB seine PDE-Aktivität entfalten und die Biofilmmatrixproduktion maßgeblich beeinflussen. / The five CSS domain phosphodiesterases from Escherichia coli K12 (E. coli) belong to the widespread group of c-di-GMP PDEs. One representative, PdeC, has already been characterized by Herbst et al. (2018). DsbA/DsbB promoted disulfide bond (DSB) formation in the CSS domain of PdeC inhibits the PDE activity of the protein. On the contrary, the free thiol form is more enzymatically active, depending on the TM2 as the dimerization domain. This form is processed by the periplasmic proteases DegP and DegQ. An irreversibly activated TM2 + EAL fragment is generated that is slowly removed by further proteolysis. The reduction of the CSS domain of PdeC to the free thiol form stimulates the PDE activity of the EAL domain in vitro. Together with the data from Herbst et al. (2018) the CSS domain is characterized as a new sensory domain whose activity is regulated by a DSB / thiol switch mechanism. All five E. coli K12 CSS domain PDEs share a similar domain architecture, but redox biochemistry, proteolysis, and PDE activity differ within the protein family. On the basis of the PDE activity of non-DSB variants, PdeB, PdeC and PdeG were characterized as activatable (reduction increases PDE activity) and PdeD and PdeN as non-activatable (reduction inactivated PDE activity). Another representative of the CSS domain PDEs, PdeN, does not seem to be regulated and activated by forming a DSB in the CSS domain. After protein biosynthesis the protein concentration is rather regulated via the N-terminus, with acidic growth conditions significantly inducing the protein and increasing its activity. If the protein is successfully inserted in the membrane, it can develop its PDE activity due to the structural DSB and influence the biofilm matrix production significantly.

Die Entstehung unterschiedlicher Zellformen ist eine zentrale Frage der Biologie und von besonderer Bedeutung für ein umfassendes Verständnis des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Form und Integrität dieser Hefen werden durch die Eigenschaften ihrer Zellwand bestimmt. Die mechanischen Prozesse in der Zellwand während der Morphogenese von Hefen sind jedoch wenig verstanden. Zwei Arten der Morphogenese, Knospung und Paarung, wurden hier untersucht, um gemeinsame Prinzipien und Unterschiede hinsichtlich ihrer Zellwandmechanik zu finden. Dabei wurden AFM-basierte Techniken sowie theoretische Modelle verwendet, um räumliche und zeitliche Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften zu beurteilen. Im ersten Teil wird ein biophysikalisches Modell der Knospung vorgestellt, das auf einem Unterschied der mechanischen Zellwandeigenschaften von Mutter und Knospe beruht und die Volumenentwicklung einzelner Zellen beschreiben kann. Da Messungen keinen ausreichenden Unterschied in der Zellwandelastizität zwischen beiden Kompartimenten zeigten, wird deren Viskoplastizität als Unterscheidungsmerkmal vorgeschlagen. Eine Kalibrierung des Modells an Einzelzellmessungen lieferte neben Schätzungen dieser Zellwandviskoplastizität auch die anderer wichtiger Wachstumsparameter. Im zweiten Teil werden nanorheologische Messungen genutzt, um zu zeigen, dass die Zellwand hauptsächlich elastisch ist und ein strukturelles Dämpfungsverhalten aufweist. Dabei wird diskutiert, die Zellwand analog zu einem „soft glassy“ Material zu beschreiben. Im letzten Teil wird die Notwendigkeit eines spezifischen Elastizitätsmusters der Zellwand für das gerichtete Wachstum während der Paarungsmorphogenese beschrieben, welches weicheres Material am Schaft sowie steiferes Material am Apex einschließt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass räumlich und zeitlich veränderliche viskoelastisch-plastische Zellwandeigenschaften die Morphogenese von S. cerevisiae bestimmen. / Morphogenesis is a central field in biology and of particular importance for a comprehensive understanding of the model organism Saccharomyces cerevisiae. Shape and integrity of yeast cells are determined by its cell wall. However, mechanical processes underlying yeast morphogenesis and are poorly understood. Two modes of yeast morphogenesis, budding and mating, have been studied to find common principles and differences in cell wall mechanics. AFM-based techniques as well as computational models were used to assess spatial and temporal differences in the mechanical properties. In the first part, a biophysical model for the expansion during budding is presented that bases on a difference in the mechanical cell wall properties of mother and bud and accurately describes the volume dynamics of single cells. Since measurements revealed no difference in the cell wall elasticity between both compartments, visco-plastic properties are proposed as distinguishing feature. Fitting the model to single-cell volume trajectories, provided estimations for the visco-plasticity of the cell wall and other key growth parameters. In the second part, nano-rheology measurements were used to confirm that the cell wall is mainly elastic and demonstrate that it shows structural damping behavior. Furthermore, the possibility to describe the cell wall analogous to a “soft glassy” material is discussed. In the last part, the necessity of a specific elasticity pattern of the cell wall for directed growth during yeast mating morphogenesis is shown, including softer material at the shaft and stiffer material at the apex. By showing that spatially and temporally varying viscoelastic-plastic cell wall properties govern the morphogenesis of S. cerevisiae, this work contributes to deciphering molecular mechanisms underlying the growth of yeast and other walled cells.

Die Photodynamische Inaktivierung von Mikroorganismen (PDI) ist eine vielversprechende Methode zur Bekämpfung verschiedener Mikroorganismen. Grundlage der PDI ist die Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in toxischer Dosis, insbesondere von Singulettsauerstoff (1O2). Die Generierung von 1O2 erfolgt durch die Wechselwirkung eines Photosensibilisators mit Licht und molekularem Sauerstoff. Ein direkter Nachweis von 1O2 ist nur durch die Detektion seiner Phosphoreszenz bei 1269 nm (1O2 Lumineszenz) möglich. Die Kinetik der 1O2 Lumineszenz erlaubt Rückschlüsse auf die Mikroumgebung des Photosensibilisators. Die Phosphoreszenz-Quantenausbeute des 1O2 ist sehr gering und die spektrale Lage der 1O2 Lumineszenz bedingt geringe Detektionseffizienz und hohes Rauschen. Daher erfordert die zeitaufgelöste Detektion der 1O2 Lumineszenz hohen Aufwand an Technik und Fachwissen. Bisher gelang die zeitaufgelöste Detektion von 1O2 Lumineszenz an Mikroorganismen nur in Suspensionen. In dieser Arbeit werden Grundlagen für die Nutzung der orts- und zeitaufgelösten Detektion der 1O2 Lumineszenz auf Oberflächen als Werkzeug für die Evaluierung der PDI auf Oberflächen vorgestellt. Um diese Grundlagen zu schaffen, wurde ein Messplatz zur orts- und zeitaufgelösten Detektion von 1O2 Lumineszenz auf Oberflächen geplant, konstruiert, charakterisiert und getestet. In Untersuchungen an vier verschiedenen Mikroorganismen mit zwei Photosensibilisatoren gelingt erstmals der direkte, zeitaufgelöste Nachweis von 1O2 an Oberflächen kultivierter Mikroorganismen. Durch den Vergleich von Fluoreszenz-Scans und 1O2 Lumineszenz-Scans können Aussagen über das Diffusionsverhalten der Photosensibilisatoren und das 1O2 Lumineszenz Quenching der Mikro-organismen getroffen werden. Eine Analyse der 1O2 Lumineszenzkinetik zeigt, dass die Detektion der 1O2 Lumineszenz und die Bestimmung der 1O2 Lumineszenzkinetik im Zeitraum der PDI aller untersuchten Mikroorganismen möglich ist. / The Photodynamic Inactivation of Microorganisms (PDI) is a promising method to combat different microorganisms. The mechanism of PDI is based on the selective generation of reactive oxygen species, particularly of singlet oxygen (1O2), in a lethal dose. 1O2 is generated via the interaction of a photosensitizer with light and molecular oxygen. The only method for directly detecting 1O2 is the measurement of its characteristic phosphorescence at 1269 nm (1O2 luminescence). The kinetics of the 1O2 luminescence can be utilized to draw conclusions about the microenvironment of the photosensitizer. Due to the extremely low phosphorescence quantum yield of 1O2 and low detection efficiency because of its spectral position, the detection of 1O2 luminescence requires a considerable amount of specialised knowledge and technical efforts. Hitherto, the time-resolved detection of 1O2 luminescence at microorganisms has only been successful in suspensions. This thesis presents fundamentals for the use of laterally and time-resolved detection of 1O2 luminescence as a tool for evaluating PDI of microorganisms on surfaces. To provide these fundamentals, a setup for lateral and time-resolved 1O2 luminescence detection was planned, constructed and characterised. In studies regarding four different microorganisms and two photosensitizer, the direct time-resolved detection of 1O2 luminescence on the surface of cultured microorganisms was succeeded for the first time. The comparison of fluorescence and 1O2 luminescence scans allows gathering information about the diffusion properties of the photosensitizer as well as the quenching properties of the microorganisms. The analysis of the 1O2 luminescence kinetics exemplifies, that the determination of the 1O2 luminescence kinetics is possible over the period of the microorganisms’ PDI.

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