Les G-quadruplexes (G4) sont des structures non canoniques des acides nucléiques qui peuvent être formés dans des régions d’ADN ou d’ARN riches en guanines. Les ligands G4 (LG4), sont des molécules capables d’interagir et de stabiliser les structures G4, qui présentent de nombreuses propriétés anti-cancéreuses. Nous avons travaillé avec le LG4 20A, appartenant à la famille des triarylpyridines, qui stabilise efficacement les structures G4 in vitro. Les objectifs de ce travail ont été de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables des effets anti-prolifératifs du 20A dans des cellules cancéreuses. Dans cette étude, nous avons montré que le 20A induit un arrêt de la croissance cellulaire de cellules en culture et dans un modèle de xénogreffe tumorale, grâce à l’induction de la sénescence et de la mort cellulaire par apoptose. Ces réponses sont associées à l’activation de la voie des réponses aux dommages à l’ADN (DDR) via la kinase ATM, qui favorise l’autophagie (un processus catabolique) et la sénescence, tout en protégeant les cellules de l’apoptose. De plus, nous avons observé que le 20A induit un échec de la cytokinèse, conduisant à l’accumulation de cellules binucléées qui présentent une résistance à la mort cellulaire. De façon inattendue, nous avons trouvé que le 20A s’accumule dans les lysosomes, induisant une augmentation de la taille de ces derniers. La combinaison du 20A et de l’agent lysomotropique chloroquine, potentialise de façon importante la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP) et la mort cellulaire. En particulier, cette combinaison sensibilise de façon notable ces cellules binucléées à la mort cellulaire. L’ensemble de ces résultats révèle une relation entre les processus de mort cellulaire et de sénescence induits par le LG4 20A, et les voies de DDR et lysosomales. Ces régulations devraient être prises en considération lors de l’utilisation d’agents antiprolifératifs susceptibles d’interférer avec les fonctions lysosomales. / G-quadruplexes (G4) are unusual nucleic acid structures that can be formed by guanine-rich DNA and RNA. Through their ability to stabilize G4 structures, G4 ligands (G4L) have been described to display potent anticancer properties. Here, we studied the G4L 20A belonging to the triarylpyridine family of compounds that have the ability to efficiently bind to and stabilize G4 structures in vitro. The objectives of this work were to determine the molecular and cellular mechanisms responsible for the anti-proliferative effects of 20A in cancer cells. In this study, we showed that 20A causes cancer cell growth arrest in cell culture and a mice tumour xenograft model, through induction of senescence and apoptotic cell death. These cellular responses are associated with the induction of the DNA damage response pathway (DDR), in particular ATM activation, which promotes the induction of both autophagy (a lysosomal catabolic pathway) and senescence, while protecting cells against apoptosis. Furthermore, we found that 20A induces failure of cytokinesis which results in the accumulation of binucleated cells that display marked resistance to 20A-induced cell death. Unexpectedly, we found that 20A accumulates in the lysosomal compartment and causes lysosome enlargement. The combination of a lysosomotropic agent, chloroquine, and 20A promotes a significant induction of lysosomal membrane permeabilization (LMP) and a robust cell death. In particular, this combination significantly sensitizes binucleated cells to cell death. Altogether, our results uncover the relationship of the DDR and lysosomal pathways to cell death and senescence induced by the G4L 20A. Such regulation should also be taken into account when using antiproliferative drugs susceptible to interfere with the lysosomal functions.

Francisella tularensis, l'agent de la tularémie, est une bactérie intracellulaire capable d'infecter un grand nombre de cellules dont les macrophages. Le système immunitaire inné cytosolique est capable de détecter la bactérie à différents stades de son cycle d'infection. Dans un premier temps, le macrophage détecte la bactérie cytosolique et produit de l'interféron de type I. Cet interféron induit l'expression de milliers de gènes. Le macrophage est ensuite capable de détecter l'ADN cytosolique de la bactérie via un récepteur spécifique AIM2. La liaison AIM2-ADN entraine la formation d'un complexe multi-protéique appelé inflammasome et se composant de AIM2-ASC-caspase-1. L'activation de ce complexe conduit à la maturation de la caspase-1. Caspase-1 permet la sécrétion de deux cytokines majeures antimicrobiennes : l'IL-1beta et l'IL-18. De plus, caspase-1 induit une mort programmée des cellules infectées appelée pyroptose. La sécrétion de cytokines et la pyroptose sont deux évènements majeurs pour lutter contre les pathogènes. Ma thèse a consisté à identifier le lien entre l'interféron et l'activation de l inflammasome AIM2 dans des macrophages infectés par la bactérie Francisella. En réalisant un crible a l'aide d'ARNs interférents, j'ai découvert que 2 protéines sont impliquées dans l'activation de cet inflammasome, les guanylate binding proteins 2 et 5 (GBP2 et GBP5). En collaboration avec l'équipe du Dr. Broz en Suisse, nous avons démontré que les GBPs étaient impliquées dans le contrôle de la réplication intracellulaire de Francisella et également dans la lyse de la bactérie permettant le relargage d'ADN et l'activation de l'inflammasome AIM2. Les GBPs sont induites par l'interféron de type I mais très majoritairement par l'interféron de type II (IFN- gamma). Nous avons mis en évidence que le contrôle de la réplication bactérienne est GB dépendant et inflammasome-dépendant en absence d'IFN- gamma mais qu'il devient totalement GB dépendant et inflammasome-indépendant dans des macrophages pré-stimulés avec de l'IFN- gamma. De plus, la mort des macrophages pré-stimulés avec de l'IFN- gamma et infectés par Francisella est également GBP-dépendante et inflammasome-indépendante. En prenant en compte tous ces résultats, nous concluons que les GBPs sont des protéines impliquées dans l'immunité des macrophages infectés par Francisella mais qu'elles ont un double rôle : d'une part celui d'induire l'activation de l'inflammasome (la pyroptose) sous le contrôle de l'interféron de type I et d'autre part, d'induire une mort cellulaire et la lyse des bactéries cytosoliques de manière indépendante de l'inflammasome sous le contrôle d'IFN- gamma. Nos résultats placent donc les GBPs comme les effecteurs majeurs de l'immunité cytosolique antibactérienne suite au traitement par l'IFN-gamma / Francisella tularensis is an intracellular bacterium, and the causative agent of tularemia, capable of infecting a large number of cells including macrophages. The innate cytosolic immune system is capable of detecting the bacterium at different stages of its infection cycle. Macrophages first detect the DNA of the cytosolic bacterium and produce type I interferon. Type I interferon subsequently induces the expression of thousands of genes. The macrophages then detect the cytosolic DNA of the bacterium via a cytosolic DNA sensor called AIM2. The AIM2-DNA binding results in the formation of a multi-protein complex called the AIM2 inflammasome composed of AIM2-ASC-caspase-1. Activation of this complex leads to the maturation of caspase-1. Caspase-1 activation leads to the secretion of two major antimicrobial cytokines, IL-1ß and IL-18. In addition, caspase-1 induces a programmed cell death termed pyroptosis. Cytokine secretion and pyroptosis are two major events in the control of pathogens. My PhD focused in identifying the link between interferon and activation of the AIM2 inflammasome in macrophages infected with the pathogenic bacterium Francisella. I performed a RNA interference screening and identified two proteins involved in the activation of the AIM2 inflammasome: guanylate binding proteins 2 and 5 (GBP2 and GBP5). In collaboration with Dr. Broz’s team in Switzerland, we demonstrated that GBPs are involved in the control of intracellular replication of Francisella and also in the lysis of the bacterium allowing the release of bacterial DNA and the activation of inflammasome AIM2. GBPs are induced by type I interferon but to a much greater extent by type II interferon (IFN-gamma). In the second part of my work, we demonstrate that the control of bacterial replication is GBP-dependent and inflammasome-dependent in the absence of IFN-gamma but that it becomes fully GBP-dependent and inflammasome-independent in macrophages primed with IFN-gamma. Cell-death of macrophages primed with IFN-? and infected with Francisella is also GBP-dependent and inflammasome-independent. Taken together, these results demonstrate that GBPs are innate immunity proteins involved in the death of macrophages and the bacterial growth restriction through two differents pathways : one induces the activation of inflammasome (induction of Pyroptosis) controlled with type I interferon signaling and, another induces cell-death and bacterial killing in an inflammasome-independent manner under the control of IFN-gamma. Our results thus discriminates the antimicrobial action of the inflammasome and of GBPs and position GBPs as the master antibacterial effectors of IFN-gamma, a key cytokine to fight cytosolic bacteria

La résistance bactérienne aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. L'émergence et la propagation de bactéries multi-résistantes, associées au nombre limité d'antibiotiques en cours de développement, ont conduit à une impasse thérapeutique. La découverte de molécules antibactériennes innovantes, capables d'agir par de nouveaux modes d'action, est donc devenue indispensable. Dans cette étude, nous avons recherché dans les plantes et, plus précisément, dans leurs huiles essentielles des molécules susceptibles d'inhiber la croissance de bactéries pathogènes. Pour cela, nous avons criblé 11 huiles essentielles par la méthode de diffusion par disque, en vue d'évaluer leur activité contre Staphylococcus aureus. Les huiles essentielles d'Inula graveolens et de Santolina corsica, qui se sont révélées particulièrement efficaces contre cette bactérie Gram positive, ont été sélectionnées afin de caractériser leur mode d'action. Leurs effets sur la croissance et l'ultrastructure bactériennes ont été déterminés par mesure de la concentration minimale inhibitrice, expérience de mort cellulaire, bactériolyse et microscopie électronique à transmission. Ces deux huiles bactéricides n'entraînent pas de lyse bactérienne et semblent agir simultanément sur la paroi cellulaire et la membrane plasmique. L'huile essentielle de Cistus ladaniferus inhibe également la croissance de S. aureus mais son spectre d'action est plus large car il s'étend à plusieurs pathogènes, incluant des bactéries Gram positives (Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes) et des bactéries Gram négatives (Enterobacter aerogenes, Campylobacter jejuni), ainsi qu'à une bactérie Gram négative multi-résistante (Enterobacter aerogenes EA289). Dans le but d'identifier les molécules responsables de cette activité, l'huile de C. ladaniferus a été séparée chimiquement en une fraction hydrocarbonée et trois fractions oxygénées. La fraction oxygénée qui concentre les alcools terpéniques, démontre la plus haute activité contre toutes les bactéries testées. La souche multi-résistante est particulièrement sensible à l'action de cette classe de molécules, qui semble s'exercer sur la paroi bactérienne

Le parvovirus H-1 (PVH-1) montre plusieurs propriétés anti-cancéreuses. Il se réplique préférentiellement dans les cellules transformées humaines (oncotropisme). Ceci peut mener à la destruction de ces cellules (oncolyse) et à la libération, dans le milieu extracellulaire, de particules virales néo-formées, pouvant à leur tour infecter et détruire les cellules transformées avoisinantes. Ces propriétés observées in vitro sont complétées par des données in vivo, qui montrent que le PVH-1 protège les animaux de laboratoire du développement tumoral (oncosuppression). Toutes ces caractéristiques font du PVH-1 une potentielle alternative thérapeutique aux traitements antimitotiques actuels. L'éventuelle utilisation du PVH-1 en clinique nécessite cependant une connaissance plus approfondie de son mode de fonctionnement. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux problèmes rencontrés avec les traitements actuels, afin de voir si le PVH-1 pouvait y apporter une réponse satisfaisante. La spécificité des molécules actuelles est relativement limitée, et celles-ci peuvent donc porter atteinte aux cellules saines de l'organisme. Dans une cellule humaine non transformée, le PVH-1 ne présente généralement pas d'effet délétère. En effet, le promoteur parvoviral P4 n'y est pas activé, et la protéine NS1, principal acteur de la toxicité induite par le PVH-1, n'est donc pas produite. Nous avons cependant cherché à savoir ce qu'il adviendrait si la protéine NS1 venait à être exprimée dans une cellule normalement insensible à l'infection parvovirale. Pour cela, nous avons utilisé un modèle permettant l'expression ectopique de NS1, contrôlée par un promoteur fort, constitutivement actif, dans un type particulier de cellules embryonnaires humaines, non immortalisées et présentant un phénotype normal, les cellules MRC-5. Nos travaux montrent que, dans ce modèle, l'expression massive de la protéine NS1 induit des modifications importantes du réseau d'actine du cytosquelette et la mort de ces cellules. L'utilisation d'une construction permettant l'expression d'une forme de NS1 mutée au niveau de son résidu de sérine en position 473 empêche à la fois les déformations du cytosquelette et la mort cellulaire. En revanche, alors que les cellules MRC-5 SV2, équivalents transformés des MRC-5, meurent sous l'effet de la surexpression des formes native et mutante de NS1, la mutation de la sérine 473 empêche l'induction de la déformation du cytosquelette. Un autre problème rencontré avec les thérapies oncologiques actuelles est la possibilité de résistance au traitement. De récents travaux démontrent que le PVH-1 peut être efficace contre des tumeurs résistantes à certains traitements classiques, notamment dans le cas de gliomes et de certains cancers du pancréas. Nous nous sommes intéressés à des cellules humaines de cancer du sein présentant un haut risque de formation de métastases, les cellules de la lignée SK-BR-7. Ces cellules montrent une résistance à l'apoptose, par l'intermédiaire d'un système autocrine inhibant l'induction de celle-ci. Nos travaux montrent que ces cellules sont sensibles à l'infection par le PVH-1, qui induit leur lyse. L'infection par le parvovirus H-1 n'induit pas l'expression de la caspase 3 comme le modèle autocrine initial aurait pu le laisser penser. En revanche, il ne nous a pas été possible de déterminer la nature exacte des voies de mort mises en oeuvre par le PVH-1. En effet, après avoir examiné les effets d'un composé non commercial, critique pour l'utilisation du modèle étudié, et dont l'activité inhibitrice du système s'est révélée défaillante, des délais prolongés dans la production de nouvelles doses de ce composé par nos collaborateurs nous ont empêché de formuler des conclusions certaines quant aux résultats obtenus pour ce projet.

L'athérosclérose est une pathologie artérielle complexe à évolution lente définie par un remodelage de la paroi vasculaire, associée à des réactions inflammatoires, à des processus de prolifération, de mort cellulaire et à une accumulation de lipides oxydés tels que les oxystérols (dérivés oxydés du cholestérol) dont le rôle est fortement suspecté dans le développement de l'athérome.<br /><br />Le travail réalisé a été effectué sur des cellules monocytaires humaines U937 et THP-1, aortiques de rat A7R5 et carcinomateuses humaines MCF-7 (déficientes en caspase-3). Différents oxystérols, présents en quantité importante dans les lésions athéromateuses, ont été utilisés (7-cétocholestérol (7KC), 7Β-hydroxycholestérol, 25-hydroxycholestérol, cholestérol-5Α, 6Α-epoxide, cholestérol-5Β, 6Β-epoxide) ainsi que du cholestérol.<br /><br />La première partie du travail a montré que la mort cellulaire induite par le 7KC est un phénomène complexe présentant des caractéristiques apoptotiques accompagnées d'une synthèse de structures multilamellaires cytoplasmiques appelées corps myéliniques visualisés par microscopie électronique à transmission. La synthèse rapide de ces structures précède les effets cytotoxiques : chute du potentiel membranaire mitochondrial, augmentation de la perméabilité à l'iodure de propidium et modifications de la morphologie nucléaire (condensation, fragmentation, gonflement des noyaux). L'isolement de ces structures par ultracentrifugation après coloration à la monodansylcadavérine (fluorochrome lysosomotropique acide) ou au Nile Red (fluorescence jaune en présence de lipides neutres et rouge en présence de lipides polaires) a permis de montrer qu'elles sont riches en lipides polaires (sphingomyéline, phosphatidylcholine) et en cholestérol et qu'elles accumulent le 7KC. Au sein de ces corps myéliniques, une co-localisation du 7KC avec les lipides polaires a été démontrée par la technique de FRET réalisée par microscopie confocale mono- et bi-photonique. Les caractéristiques morphologiques et biochimiques des figures myéliniques ont permis d'établir que le 7-cétocholestérol est un puissant inducteur de phospholipidose.<br /><br />Compte tenu des modifications lipidiques spatiotemporelles, quantitatives et qualitatives, induites par le 7KC et révélé par le Nile Red, la seconde partie du travail a précisé les relations entre la mort cellulaire, la synthèse de corps myéliniques, l'accumulation de lipides polaires et l'activité caspase. Avec les différents oxystérols étudiés, les corps myéliniques ne sont observés qu'avec des composés cytotoxiques (7KC, 7Β-hydroxycholestérol, cholestérol-5Β, 6Β-epoxide) et leur synthèse est indépendante d'activité caspase. En revanche, l'accumulation de lipides polaires induite par le 7KC est inhibée en présence de z-VAD-fmk (inhibiteurs de caspases large spectre) et de z-VDVAD-fmk (inhibiteur de caspase-2). Certaines caspases et en particulier la caspase-2 pourraient contribuer à l'accumulation de lipides polaires.<br /><br />La troisième partie du travail a conduit à étudier les effets de la Vitamine-E (VitE) sur la mort cellulaire induite par le 7KC en raison de ses propriétés anti-apoptotiques et anti-oxydantes. La VitE protège de la mort cellulaire induite par le 7KC. Les effets protecteurs pourraient en partie être dus à la capacité de la VitE à maintenir fonctionnelle la voie PI3-K/c-Akt en s'opposant aux déphosphorylations de PDK-1 et de c-Akt, et en préservant l'activité PI3-K. Par ailleurs, la VitE s'oppose aux modifications lipidiques au niveau de la membrane cytoplasmique et à l'accumulation de lipides polaires. La VitE réduit aussi la dégradation de la pro-forme de la caspase-2L et augmente les taux d'ARNm correspondants.<br /><br />Ces travaux montrent des relations entre la mort cellulaire induite par des oxystérols et le métabolisme des lipides. Ils révèlent aussi que la VitE protège de la mort induite par le 7KC en agissant au niveau de la voie PI3-K/c-Akt. Par ailleurs, la VitE s'oppose aux modifications lipidiques membranaires et cytoplasmiques associées à la mort cellulaire induite par le 7KC.

La toxine stable à la chaleur de type b (STb) est une des toxines produites par les souches Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) impliquée dans le développement de la diarrhée. Une étude antérieure par Goncalves et al. (2009) a démontré que les cellules ayant internalisé la toxine STb démontraient une morphologie qui rappelle l’apoptose. Le changement du potentiel membranaire observé par Goncalves et al. (2009) nous a incité à vérifier la capacité de la toxine STb à induire l’apoptose des cellules HRT-18 et IEC-18 par la voie intrinsèque. Les cellules HRT-18 et IEC-18 ont été traitées avec de la toxine purifiée pour une durée de 24 heures puis ells ont été récoltées et examinées pour des caratéristiques de l’apoptose. L’activation des caspases-9 et -3, mais pas de la caspase-8, a été observée dans les deux lignées cellulaires à l’aide des substrats fluorescents spécifiques pour chaque caspase. L’ADN extrait des cellules HRT-18 et IEC-18 a révélé une fragmentation lorsque migré sur gel d’agarose. La condensation et la fragmentation des noyaux ont été observées en microscopie à fluorescence suite à une coloration de l’ADN au Hoechst 33342. Les indices apoptotiques des cellules HRT-18 et IEC-18 traitées avec des quantités croissantes de STb montrent une dose-réponse pour les deux lignées. L’activation de la caspase-9 est une indication que la voie intrinsèque de l’apoptose est activée dans les cellules HRT-18 et IEC-18. L’absence de l’activation de la caspase-8 démontre que la voie extrinsèque n’est pas impliquée dans la mort cellulaire médiée par STb. / Heat-stable toxin b (STb) is one of the toxins produced by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains implicated in the development of diarrhea. A previous study conducted by Goncalves et al. (2009) showed that cells having internalized STb toxin demonstrated apoptotic-like morphology. The change in the mitochondrial membrane potential observed by Goncalves et al. (2009) prompted us to verify the ability of STb toxin to induce apoptosis via the intrinsic pathway in HRT-18 and IEC-18 cells. Both cell lines were treated with purified STb toxin for a period of 24 hours, harvested, and examined for apoptotic features. Activation of caspases-9 and -3, but not -8, was observed in HRT-18 and IEC-18 cells as determined with the use of fluorescent substrates specific to each caspase. Extracted DNA revealed DNA laddering when migrated on agarose gels. Nuclear condensation and fragmentation of Hoechst 33342 stained DNA of HRT-18 and IEC-18 cells were visualized by fluorescence microscopy. Apoptotic indexes of HRT-18 and IEC-18 cells treated with increasing amounts of STb toxin revealed dose-dependent responses in both cell lines. The activation of caspase-9 is an indication of the intrinsic pathway being activated in HRT-18 and IEC-18 cells by STb toxin. The lack of caspase-8 activation demonstrates that the extrinsic pathway of apoptosis is not involved in the programmed cell death mediated by STb.

Cotesia congregata est une guêpe parasitoïde qui se développe à l’intérieur de la larve du Lépidoptère, Manduca sexta. Ce parasitoïde a développé une stratégie de virulence qui utilise un symbionte viral de la famille des Polydnavirus nommé Cotesia congregata bracovirus. Mon travail de thèse a permis de caractériser le dialogue moléculaire au cours de l’interaction par des approches de transcriptomique à haut débit et de physiologie. Ces travaux ont permis d’établir la première carte fonctionnelle du génome viral et de visualiser l’ensemble des gènes de M. sexta régulés au cours du parasitisme. La régulation des gènes de l’immunité a révélé que le parasitisme n’empêche pas l’induction de peptides antimicrobiens, mais entraine la sous-expression de gènes impliqués dans la réponse cellulaire. De plus j’ai pu mettre en évidence une réduction du nombre de cellules adhérentes au cours de l’interaction et décrire l’induction d’un phénotype de type apoptose d’une catégorie de cellules immunitaires. Ces résultats permettent d’identifier des gènes acteurs de l’interaction et apportent de nouvelles connaissances relatives aux interactions hôtes-parasitoïdes. / Cotesia congregata is a parasitoid wasp that develops inside the lepidopteran larvae, Manduca sexta. This parasitoid wasp has evolved virulence strategies using an obligate viral symbiont from the Polydnavirus family named Cotesia congregata bracovirus. My thesis work has allowed us to characterize the molecular dialogue during the interaction by physiological and high-throughput transcriptomic approaches. This work allowed to obtain the first functional map of the viral genome and to identify all M. sexta genes regulated during parasitism. Regulation of immune genes revealed that parasitism does not prevent induction of antimicrobial peptides, but leads to the down-regulation of genes involved in the cellular response. Moreover, I was able to demonstrate a reduction in the number of adherent cells during the interaction and to describe this induction as an apoptosis-like phenotype targeting a specific population of immune cells. These findings open the way to the identification of candidate genes involved in this particular interaction and provide new insights into host-parasitoid interactions in general.

Les fermentations alcooliques peuvent s’accompagner de phénomènes de mortalité des levures entraînant des fermentations languissantes ou stoppées. Les mécanismes sous-jacents de la mortalité des levures en conditions de limitation nutritionnelle au cours des fermentations alcoolique sont encore mal connus. Dans ce travail, nous avons abordé la mortalité des levures en référence au schéma conceptuel développé dans les études de vieillissement cellulaire qui ont montré que la résistance à la carence peut être influencée par la nature du nutriment limitant la croissance cellulaire. Nous avons étudié l’apparition de la mort cellulaire en analysant la capacité des levures à mettre en place une réponse appropriée à différentes carences nutritionnelles. Nous avons montré que plusieurs carences nutritionnelles (acide oléique, ergostérol, acide pantothénique et acide nicotinique) entraînent une perte de viabilité de façon dépendante de l’azote. Nous avons démontré que la voie de signalisation azotée TOR/Sch9 est impliquée dans la mise en place de cette mort cellulaire. Dans de telles conditions, les levures n’acquièrent pas de résistance au stress du fait d’une modification à un niveau post-transcriptionnel. Nous avons examiné la capacité de différentes sources d’azote à entraîner la mort cellulaire, et nous avons montré qu’elles agissent différemment sur la mort cellulaire et que le NH4+ a une forte capacité à induire la mortalité. Enfin, les approches QTL nous ont permis d’identifier plusieurs régions contrôlant la mort cellulaire en limitation en acide oléique et acide pantothénique, cohérent avec un contrôle multigénique. 3 régions QTL communes à ces deux limitations ont été identifiées, ce qui suggère des mécanismes communs de contrôle de la survie des levures dans ces deux conditions de carences nutritionnelles. / Yeast cell death can occur during wine alcoholic fermentation and lead to sluggish or stuck fermentations. The mechanisms underlying cell death during yeast starvation in alcoholic fermentations remain unclear. In this work we addressed yeast cell death using conceptual framework from ageing studies showing that yeast resistance to starvation can be influenced by the nature of the nutrient limiting cell growth. We examined cell death occurrence considering yeast cells ability to elicit an appropriate response to a set of nutrient limitations. We showed that several micronutrients limitations (oleic acid, ergosterol, pantothenic acid and nicotinic acid) trigger cell death in a nitrogen-dependent manner. We provide evidence that the nitrogen Tor/Sch9 signaling pathway is involved in triggering cell death. In such conditions, yeast cells fail to acquire stress resistance given a restriction at a post-transcriptional level. We have examined the ability of different nitrogen sources to trigger cell death showing that they impact differentially on cell death and that NH4+ had a strong death inducing capacity. Finally, the QTL approaches allowed the mapping of a set of loci controlling cell death under oleic acid and pantothenic acid starvation that are consistent with a multigenic control. 3 QTL regions appeared to be common to these two limitations which suggests some common control of the yeast survival in these two nutrient-limited situations.

Le virus de la rage est un pathogène neurotrope qui, actuellement, fait toujours plus de 55000 morts par an et dont la pathogenèse présente toujours de nombreuses zones d’ombre. Le mécanisme par lequel le virus échappe au système immunitaire de même que l’implication d’autres types cellulaires, particulièrement au niveau de la phase de latence, n’est pas encore connu. Il en est de même pour le mécanisme par lequel le virus induit un dysfonctionnement neuronal. Dans le cadre de ce projet de thèse, nous avons donc décidé d’étudier l’implication du macrophage et des caspases dans l’infection induite par le virus rabique. <p>Nos résultats ont permis de démontrer que, malgré la faiblesse de la production virale in vitro, les macrophages infectés par une souche virulente de virus rabique étaient capables de transmettre l’infection et d’induire une encéphalite mortelle chez la souris. Ces résultats suggèrent que les macrophages sont susceptibles d’être des hôtes potentiels du virus.<p>Dans un deuxième temps, nous avons également mis en évidence des différences de caractéristiques d’infection entre les souches virulentes et atténuées du virus rabique. Nous avons en effet démontré qu’en comparaison avec la souche vaccinale ERA, l’infection par la souche virulente CVS-11 était moins productive dans les cellules d’origine périphérique, tels que les cellules musculaires ou les macrophages. En revanche, la souche virulente se réplique mieux dans le cerveau et dans les cellules d’origine neuronale. Chez le macrophage, nous avons pu observer que l’infection par la souche atténuée ERA induisait une plus forte mortalité que celle générée par la souche CVS-11. Nos analyses ont mis en évidence que cette mortalité était de type apoptotique et qu’elle impliquait l’activation des caspases-1, -3, -7, -8, -9, du facteur Bid et de l’IL-1β. Des analyses réalisées sur des macrophages knock-out pour les caspase-1, -3 et -7 ont démontré d’une part l’importance de la caspase-3 dans la mortalité cellulaire et d’autre part qu’une déficience en caspase-7 pouvait être associée à une charge virale plus élevée, particulièrement en cas d’infection avec la souche virulente. In vivo, nous avons observé que l’inoculation de la souche CVS-11 chez des souris déficientes en caspase-3 retardait l’apparition des symptômes et de la mortalité sans pour autant modifier l’issue inéluctable de la maladie. Chez les souris caspase-1 knock-out, l’inoculation d’une souche atténuée entrainait une morbidité plus élevée que celle observée chez les souris WT.<p>Ce travail de thèse nous a donc permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse du virus rabique et dans la réponse de l’hôte à l’infection et a souligné le rôle potentiel du macrophage comme vecteur de dissémination virale/<p><p>Rabies virus is a neurotropic pathogen which currently causes more than 55000 deaths a year and our knowledge on its pathogenesis still contains many gaps. The mechanism by which the virus escapes the immune system as well as the involvement of different cell types, particularly in the asymptomatic phase, is still unknown. The situation is similar for the mechanism by which the virus induces neuronal dysfunction. In this work, we decided to study the involvement of caspases and the macrophage in infection induced by rabies virus.<p>Our results demonstrated that, despite a weak virus production in vitro, macrophages infected with a virulent strain of rabies virus were able to transmit infection and induce fatal encephalitis in mice. These results suggest that macrophages may be potential cellular hosts of rabies virus.<p>In a second step, we demonstrated differences in infection characteristics between virulent and attenuated rabies virus strains. Indeed, we showed that, in comparison with the ERA vaccine strain, infection with the virulent strain CVS-11 strain was less productive in cells of peripheral origin, such as muscle cells or macrophages. In contrast, the virulent strain replicated best in the brain and in neuronal cells. In the macrophage, we observed that infection with the attenuated strain ERA strain induced a higher mortality than that induced by the CVS-11 strain. Our analyzes showed that mortality was apoptotic and involved the activation of caspases-1, -3, -7, -8, -9, IL-1β and cleavage of Bid. Analyzes performed on macrophages deficient for caspase-1, -3 or -7 indicated the importance of caspase-3 in cell death and demonstrated that a deficiency in caspase- 7 could be associated with a higher viral loadd, particularly in case of infection with the virulent strain. In vivo, we observed that the inoculation of the CVS-11 strain in mice deficient in caspase-3 delayed the onset of symptoms and mortality without changing the fatal outcome of the disease. Inoculation of caspase-1 knockout mice with the attenuated strain resulted in a higher morbidity than that observed in wild type mice.<p>This work allowed us to improve our understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of rabies virus and in the host response and highlighted a potential role for the macrophage as a vector of virus dissemination.<p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La transplantation cellulaire apparaît aujourd’hui comme une thérapie prometteuse pour certaines formes graves d’insuffisance cardiaque réfractaire aux traitements classiques. Nous avons tenté dans ce travail d’améliorer la thérapie cellulaire en agissant sur deux paramètres : la perte et la survie des cellules. Dans une première étape, nous avons comparé les effets de deux méthodes de couverture épicardique des cellules via des biomatériaux cellularisés (feuilles de cellules et une matrice de gélatine) par rapport à ceux des injections conventionnelles dans le myocarde. Nous avons choisi de transplanter des cellules souches musculaires pour une étude de preuve de concept. Une amélioration de la fonction contractile au bout de 1 mois associée à une amélioration de la rétention cellulaire, une augmentation du nombre de vaisseaux sanguins et une diminution du pourcentage de la fibrose ont été enregistrées dans les groupes de biomatériaux cellularisés par rapport au groupe des injections de cellules. Nous avons tenté de confirmer les bénéfices de la couverture épicardique avec un autre type cellulaire. Nous avons choisi d’utiliser des cellules souches stromales d’origine adipeuse (ADSC pour Adipose Derived Stroma/Stem Cells). Toutefois, et malgré les bénéfices fonctionnels apportés lors des greffes, les feuilles d’ADSC étaient difficilement maniables lors de la chirurgie. De plus, les ADSC ont été incapables de générer de nouveaux cardiomyocytes s’intégrant électriquement et mécaniquement dans le tissu receveur. L’objectif de « régénération » myocardique requiert l’apport de cellules ayant un potentiel de différenciation cardiaque et devrait donc pouvoir être atteint avec des cellules souches embryonnaires (CSE). Nous avons choisi de travailler avec ce type cellulaire en raison de la possibilité de dériver, à partir de ces cellules, de véritables progéniteurs des cardiomyocytes. Pour limiter les conditions hypoxiques de l’environnement ischémique, nous avons co-transplanté les progéniteurs cardiaques dérivés des CSE humaines avec des ADSC afin d’en exploiter les propriétés trophiques, et d’optimiser ainsi la survie du greffon. Les deux populations cellulaires ont été transférées sur le myocarde infarci via, une matrice de gélatine (GELFILM™) qui représente de meilleures propriétés mécaniques. Lors de cette étude, nous avons remarqué une préservation contre le remodelage ventriculaire à court (1mois) et long (6mois) terme chez les animaux greffés avec les patchs co-ensemencés par rapport aux animaux recevant le patch seul et l’étude des patchs composites a montré la présence de cellules humaines in vitro mais pas in vivo, probablement à cause d’une maîtrise insuffisante du rejet. Notre travail a donc consisté en une analyse systématique de plusieurs paramètres fondamentaux de thérapie cellulaire (méthode de transfert des cellules, limitation des conditions de mort cellulaire après greffes, choix du type cellulaire). Les résultats obtenus valident l’emploi des matrices cellularisées déposées sur l’épicarde. Il convient maintenant d’optimiser la nature du biomatériau, les conditions de culture des progéniteurs cardiaques avec des cellules trophiques dans le but d’améliorer la survie du greffon. / Cell transplantation has emerged as a promising therapy for some kind of severe heart failure refractory to conventional treatment. We have attempted in this work to improve cell therapy by acting on two parameters: the loss and cell survival. In a first step, we compared the effects of two methods of epicardial deposition of cells via natural biomaterials (Cell sheet and gelatin matrix) compared to conventional cells injections into the myocardium. We chose to transplant muscle stem cells for a proof of concept study. Improved contractile function after 1 month associated with improved cell retention, an increased number of blood vessels and a decrease in the percentage of fibrosis were recorded in the groups of cellularized biomaterials compared with injections group. We attempted to confirm the benefits of the epicardial cover with another cell type. We chose to use stromal stem cells from adipose origin as ADSC for Adipose Derived Stromal / Stem Cells. However, despite the functional benefits provided after transplantation, ADSC sheets were hardly manipulated during surgery. In addition, ADSC were unable to generate new cardiomyocytes electrically and mechanically integrated into the host tissue. The objective of "regeneration" requires the input of contractile cells with potential of cardiac differentiation that should be achieved with embryonic stem cells (ESC). We chose to work with this cell type because of the possibility of deriving of cardiac progenitor from these cells. To reduce the hypoxic conditions of the ischemic environment, we co-transplanted cardiac progenitor derived from human embryonic stem cells with ADSC in order to develop the trophic properties, and thus optimize the graft survival. Both cell populations were transferred to the infarcted myocardium using a gelatin matrix (GELFILM ™) which represents better mechanical properties than the cell sheet. In this study, we observed a significant functional preservation against negative ventricular remodeling in the short (1 month) and long (6 months) term in animals grafted with co-seeded patches compared to animals receiving only the patch. The study of composite patches showed the presence of human cells in vitro but not in vivo, probably because of inadequate control of rejection. Our work has involved a systematic analysis of several basic parameters of cell therapy (method of cell transfer, reduce of cell death after transplantation, choice of cell type…). The results validate the use of cellularized matrix deposited on the epicardium. In conclusion, to improve graft survival, it is necessary to optimize the nature of the biomaterial, the culture conditions of cardiac progenitor cells.