Les composantes innée et acquise de l'immunité travaillent ensemble pour assurer une protection efficace de l'organisme. Les cellules dendritiques, cellules sentinelles de l’immunité capturent via des récepteurs de surface les agents pathogènes et les présentent aux lymphocytes T pour stimuler les réponses immunitaires adaptatives spécifiques. Une famille de ces récepteurs, nommée Récepteurs Lectines de type C (CLRs) ont un rôle important dans la reconnaissance de motifs oligosaccharides des pathogènes. Leurs fonctions sont parfois détournées par certains pathogènes à leur avantage et notamment le VIH. La reconnaissance du virus par DC-SIGN, une des CLRs, favorise la dissémination du virus. A l’inverse, la langerine, autre CLR, est considérée comme une barrière naturelle au VIH. Ainsi, DC-SIGN est devenue une cible thérapeutique prometteuse mais sa reconnaissance des ligands osidiques est largement partagée par la langerine.Ce travail vise à développer des antagonistes de DC-SIGN spécifiques et de hautes affinités permettant de rivaliser avec la présentation multivalente des glycosylations de gp120 du VIH avec DC-SIGN. Une approche rationnelle a été employée dans le développement de ligands glycomimétiques hautement sélectifs pour DC-SIGN à partir de l’étude du site de liaison des deux CLRs. Puis, des plates-formes de présentations de ces glycomimétiques, de valences et de géométries différentes, sont comparées par SPR. Les améliorations spectaculaires d'affinités parfois observées sont liées à différents mécanismes d’interactions multivalentes responsables d’un phénomène d’avidité.Sur une des architecture de présentation sélectionnée (RODs), un travail de caractérisation fine des mécanismes responsables de ce gain d’affinité et/ou d’avidité a été conduit par la combinaison de plusieurs techniques biophysiques (SPR, ITC, polarisation de fluorescence et AUC). L’influence de la topologie de cette structure sur les mécanismes d’interactions est ainsi mise en évidence. Par les travaux menés, plusieurs ligands multivalents ont montré des affinités sans précédent pour DC SIGN atteignant des affinités du nanomolaire et représentant les meilleurs inhibiteurs connus à ce jour.Associé au développement d’antagonistes multivalents, une CLR (DCIR) a été identifiée récemment comme impliquée dans la dissémination du VIH, comme DC¬SIGN. Dans une perspective future de développement de glycomimétique, des travaux ont été menés sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de ce nouvel acteur dans la problématique VIH. / The innate and acquired immunity components work together to provide efficient protection of organisms. Dendritic cells, sentinel cells of the immunity, are able to capture pathogens through their receptors on the surface and they can present the antigens to lymphocytes T in order to stimulate specific adaptive immune responses. Among these receptors, there is a family named C-type lectin receptors (CLRs), which has an important role in the recognition of pathogenic oligosaccharide motifs. CLRs can be hijacked by many pathogens including HIV. DC-SIGN, one of the CLRs, interacts with the virus and promotes its dissemination. Unlike DC-SIGN, langerin, another CLR, has a protective role against the HIV infection. In this context, DC-SIGN became a promising therapeutic target but it shares ligand specificities with langerin.This work aims to develop highly specific antagonists against DC-SIGN in order to compete with the multivalent glycosylated gp120 protein of HIV. Using the study of the two lectins binding sites as starting point, a rational approach has been exploited to develop highly selective glycomimetics against DC SIGN. The SPR technique was used to investigate multivalent platforms with different valencies as well as ligand presentation in space. The amazing improvement of the affinity observed in some cases can be linked to different mechanisms of multivalent interactions, leading to an avidity phenomenon. On a selected scaffold (RODs), we characterized the different mechanisms responsible for the affinity and/or avidity gains, using a combination of different biophysical techniques (SPR, ITC, fluorescence polarization, AUC). In this work, we highlighted that the topology of this structure can influence the mechanisms of interactions. Overall, different multivalent ligands showed unique affinities for DC-SIGN, reaching the nanomolar affinity range, and they represent the best inhibitors to date.Finally, another CLR has been recently identified as one of the protein involved in the HIV infection as well as DC-SIGN. In a future perspective of glycomimetic development, structural and functional characterization has been done on this new actor involved in the HIV issue.

Récemment, le concept de chaperon pharmacologique a émergé pour le traitement des maladies lysosomales. Comme inhibiteurs réversibles de glycosidases mutantes impliquées dans ces maladies, les chaperons pharmacologiques sont capables, à des concentrations sub-inhibitrices, de sauver ces enzymes des mécanismes de destruction du réticulum endoplasmique (RE). Ainsi, une partie de l’activité enzymatique est restaurée. Les iminosucres sont connus pour être une classe importante de chaperons pharmacologiques. Au cours de ce travail de thèse, de nouvelles classes d’iminosucres mono- et multivalents ont été conçues et synthétisées. Nos objectifs étaient de mettre en évidence de nouveaux chaperons pour la β-glucocérébrosidase, impliquée dans la maladie de Gaucher, mais également d’identifier de nouveaux inhibiteurs des α-glucosidases du RE impliquées dans la destruction de la protéine déficiente chez les malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre: l’utilisation d’une méthodologie de diamination d’alcènes pallado-catalysée, d’une méthodologie permettant la synthèse rapide d’une bibliothèque de composés iminosucres par chimie click ou encore de la multivalence. Une étude poussée sur la multivalence et l’inhibition de glycosidases a également été réalisée en faisant varier des paramètres clés de la multivalence tels que la valence, la charpente, le linker, ou encore la nature des ligands iminosucres. Le premier exemple d’un effet multivalent puissant jusqu’à quatre ordre de grandeur sur l’inhibition de glycosidases a été mis en évidence avec des systèmes iminosucres multivalents basés sur des charpentes de type β-cyclodextrine et fullerène C60. / Recently an innovative concept for the treatment of lysosomal diseases as emerged called pharmacological chaperone. Pharmacological chaperones are reversible inhibitors of the deficient glycosidases involved in these diseases. These molecules are able, at sub-inhibitory concentrations, to stabilize the enzymes and rescue them from the destruction by the quality control system of the endoplasmic reticulum. A part of the catalytic activity of the enzyme could be restored. Iminosugars are known to be an important class of pharmaceutical chaperones. During this PhD work, novel classes of mono- and multivalent iminosugars were designed and synthesized in order to identify novel pharmacological chaperones for the glycosidase: β-glucocerebrosidase involved in Gaucher’s disease and novel inhibitors of the α-glucosidases involved in the destruction of the defective protein delF508CFTR in cystic fibrosis. Several strategies were applied to achieve this aim. These strategies consist in the use of a synthetic methodology of palladium catalyzed alkenes diamination, the use of an efficient methodology to synthesize a library of novel iminosugars by click chemistry and the use of multivalency. A full study on the impact of multivalency on glycosidases inhibition was also completed by changing crucial structural parameters including valency, scaffold, linker and ligand. The first strong multivalent effect on glycosidases inhibition up to four orders of magnitude was reported with multivalent iminosugars based on β-cyclodextrin or C60 fullerene cores.

Les systèmes naturels ont montré l'intérêt de la multiplication des interactions pour une cible, permettant d'améliorer l'affinité et de moduler la spécificité de reconnaissance. Il est ainsi important pour des applications biologiques de concevoir des systèmes multivalents et biocompatibles. Le travail entreprit au cours de ce doctorat porte sur le développement de nouvelles méthodologies pour accéder à des systèmes multivalents originaux.Ainsi, nous avons conçu, par synthèse multi-étapes, une nouvelle plate-forme fonctionnalisée, basée sur un châssis α-PNA pour la reconnaissance multivalente d'oligonucléotides. Ce nouveau système peut potentiellement être impliqué dans la reconnaissance sélective multipoint d'ADN.En parallèle, nous avons préparé des clusters multivalents d'iminosucres sur des châssis peptidiques, construits à partir de ligations click sans métaux, pour l'inhibition enzymatique de glycosidases. En effet, des systèmes multivalents ont été récemment développés en tant qu'inhibiteurs de glycosidases. Cependant, leur méthodologie de synthèse repose quasiment exclusivement sur la ligation azoture-alcyne catalysée au cuivre, ce qui limite son application biologique en raison de sa toxicité. Nos travaux ont ainsi conduit à l'identification d'inhibiteurs efficaces d'α-mannosidases par une approche synthétique sans métaux.Dans le contexte de la vectorisation d'oligonucléotides, il existe un besoin de concevoir des systèmes dynamiques qui permettent un relargage contrôlé. Nous avons appliqué une stratégie d'auto-assemblage, par ligation click de type acylhydrazone, pour la génération in situ de clusters biomoléculaires à partir de châssis peptidiques et de ligands d'acides aminés modifiés. Etant donné le caractère dynamique de la ligation qui confère une adaptabilité au système, nous avons démontré que a) la présence d'une cible permet d'assister la formation des clusters par sélection de certains composants et b) l'ADN peut être relargué par échange de ligands. Cette technique efficace et rapide d'auto-assemblage de fragments a ensuite permis de réaliser un criblage pour sonder l'effet de l'architecture et de la valence sur la complexation. Ce projet a finalement conduit à l'identification de vecteurs efficace pour la transfection de siARN sur cellules.Enfin, dans un dernier projet, nous avons exploité diverses techniques orthogonales et chimiosélectives de ligations click dans le but de générer des nanostructures peptidiques. Deux cages ont ainsi été obtenues par la formation de ligations acylhydrazones et thiol-maléimides selon une approche one-pot.En résumé, ces travaux d'ingénierie et d'auto-assemblage de systèmes biomoléculaires multivalent ont permis le développement de méthodes innovantes pour répondre à des besoins d'actualité et permettre la construction de systèmes multivalents destinés à la reconnaissance d'oligonucléotides, la vectorisation et l'inhibition enzymatique. / Natural systems are inspiring in showing that the combination of multiple interactions enables improvement in binding affinity and selectivity for a target. Thus, the design of synthetic and biocompatible multivalent systems is of great importance for biological applications. The work described in this PhD thesis aims at developing novel methodologies for generating functional multivalent systems.In order to engineer multivalent systems for the recognition of oligonucleotides, we elaborated a multi-step synthesis of functionalized α-PNA scaffolds bearing side-groups. This new scaffold can potentially serve for the multi-point sequence-selective recognition of DNA.Multivalent nanoconstructs are emerging tools for enzyme inhibition. In this context, we prepared multivalent clusters of iminosugars – by metal-free click ligations on peptide scaffolds – as candidates for glycosidases inhibition. Although such enzyme inhibitors based on iminosugar clusters were recently reported, their synthesis relies almost exclusively on copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, which notorious toxicity represents a serious limitation for biological applications. Our approach demonstrates that iminosugar clusters can be prepared in a metal-free fashion and exhibit strong multivalent effects for the inhibition of α-mannosidases. Multivalent biomolecular systems are also candidates for gene delivery application. In this context, the design of dynamic systems is of interest for achieving controlled release. We implemented a self-assembly strategy, using the acylhydrazone click ligation, for the in situ generation of biomolecular clusters starting from peptide scaffolds and modified amino acids building blocks. We showed that, whereas both compounds are ineffective for DNA complexation, the mixed system spontaneously expresses cationic clusters that effectively complex DNA. We further demonstrated that, given the dynamic character of the acylhydrazone ligation, the system is able to a) adapt to the presence of the DNA target by selecting the optimal building blocks for the cluster self-assembly, and b) trigger DNA release by component exchange. This modular and versatile self-assembly approach was further exploited to perform a fragments screening varying molecular structure and valency. Thereby, we identified new and effective vectors for the transfection of siRNA in living cells.The last project described in this manuscript deals with the generation of cage-type peptide nanoconstructs by using a set of orthogonal and chemoselective click ligations. Two cages, based on acylhydrazone ligation on one side and thiol-maleimide on the other, were obtained successfully in one-pot.In summary, this work has led to the development of novel methodologies for the engineering and self-assembly of multivalent biomolecular nanoconstructs for diverse biological applications such as oligonucleotide recognition, delivery and enzyme inhibition.

Des supramolécules basées sur la reconnaissance de viologènes par des curcubit[n]urils (CB[n]) ont été étudiées. Les systèmes développées incluent des [3]-, [4]- et [7]pseudorotaxanes, composés de multimères à base de viologène et de CB[7] ou CB[8]. L’étude physicochimique a montré que ces supramolécules sont interconverties électrochimiquement entre un état complexé, défini par les pseudorotaxanes, et un état dissocié comprenant chacun des partenaires. Le désassemblage résulte d’une pimérisation intra/intermoléculaire entre radicaux viologènes.L’étude physicochimique de complexes pentacoordinés basés sur la reconnaissance d’azo-aryl-imidazoles par une porphyrine à anse phénanthroline a été menée; l’objectif étant d’utiliser les propriétés d’isomérisation photoinduite trans-cis d’azo-chromophores pour dissocier ces complexes. Les complexes initiaux sont alors régénérés par relaxation thermique. La stabilité et les propriétés cinétiques des complexes pentacoordinés ont été évaluées. / Supramolecules based on the recognition of redox-active bipyridiniums by cucurbit[n]uril (CB[n]) have been studied. The investigated systems include a [3]-, a [4]- and a [7]pseudorotaxane, each of them composed of a multimeric viologen-based thread molecule and CB[7] or CB[8]. The physicochemical approach emphasized that these systems can be electrochemically switched between a complexed state, defined by the pseudorotaxanes, and an uncomplexed state comprising their components. The disassembly results from intra/intermolecular pimerization of the viologen radicals.A physicochemical approach of pentacoordinated complexes of a phen-strapped porphyrin with azo-arylimidazoles has been undertaken with the aim to use the photoinduced trans-cis isomerization properties of azo-chromophores to dissociate the complexes. Thermal equilibration reinstates the thermodynamically favoured complexes. The strength and the kinetic properties of these pentacoordinated species have been evaluated.

In der vorliegenden Arbeit diente das Kapsid der Bakteriophage Qbeta als multivalentes Gerüst und ermöglichte die Bildung eines monodispersen multivalenten Systems, welches mit Homopropargylglycin als unnatürliche Aminosäure modifiziert wurde. Das so eingeführte Alkin ermöglichte kupferkatalysierte Alkin-Azid-Cycloaddition zur Anbindung von Sialinsäuregrupen. Die entsprechende Synthese der hierzu kompatiblen Azid-modifizierten Sialinsäurederivate war eine der Hauptaufgaben dieser Arbeit. Zu diesem Zweck wurde das einfach zugängliche 5-N-Acetyladamantanylthiosialosid als Glykosylierungsdonor in der alpha-selektiven Synthese von Sialosiden evaluiert. Eine effiziente Aktivierung dieses Donors wurde unter optimierten Bedingungen bei -78°C mit N-Iodsuccinimid und Trifluormethansulfonsäure erreicht, was zu hohen alpha-Selektivitäten und Gesamtausbeuten der gewünschten Sialoside führte. Insbesondere Azidoethylenglykol-verknüpfte Sialinsäuren wurden synthetisiert, die für nachfolgende Biokonjugationsreaktionen an das Qbeta-Kapsid verwendet wurden. Die so dargestellten Sialinsäure-modifizierten Qbeta-Kapsidpartikel wurden dann eingehend mit Hilfe mehrerer biophysikalischer und biologischer Tests hinsichtlich ihrer Fähigkeit an Hämagglutinin zu binden und eine Influenza-Infektion zu inhibieren charakterisiert. Niedrige nanomolare Affinitäten wurden in diesen Assays gemessen. Eine sehr effiziente Infektionshemmung in vergleichbaren Konzentrationsbereichen konnte in einem in vitro Zell-, sowie einem in vivo Maus- als auch einem menschlichen ex vivo Modellsystem beobachtet werden. Verschiedene pathologisch relevante Influenzastämme konnten über die hier vorgestellte Strategie ebenfalls gebunden werden. Die monodisperse und definierte Struktur des Qbeta-Gerüsts erlaubte es außerdem ein theoretisches Modell der zugrundeliegenden Bindungsmodi zu erstellen. / In this thesis, the bacteriophage Qbeta capsid served as a multivalent scaffold and facilitated the generation of a monodisperse multivalent system which was modified with homopropargylglycine as an unnatural amino acid. The introduced alkyne enabled copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition to attach sialic acid groups. The corresponding synthesis of the compatible azide-modified sialic acid derivatives was one of the main tasks of this work. For this purpose, the straightforwardly accessible 5-N-acetyladamantanyl thiosialoside was evaluated as a glycosylation donor in the alpha-selective synthesis of sialosides. Efficient activation of this donor was achieved under optimized conditions at -78°C with N-iodosuccinimide and trifluoromethanesulfonic acid which led to high alpha selectivities and overall yields of the desired sialosides. Particularly azidoethylene glycol-linked sialic acids were synthesized which were used for subsequent bioconjugation reactions to the Qbeta capsid. These synthesized sialic acid-modified Qbeta capsid particles were then thoroughly characterized by multiple biophysical and biological assays regarding their ability to bind to hemagglutinin and to inhibit influenza infection. Low nanomolar affinities were measured in these assays. A very efficient infection inhibition in a comparable concentration range was observed in in vitro cellular, in vivo mouse and ex vivo human model systems. Several pathologically relevant influenza strains could also be bound with the strategy presented here. The monodisperse and defined structure of the Qbeta scaffold additionally allowed for the establishment of a theoretical model describing the underlying binding modes.

Ein vielversprechender Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Influenzavirus ist die kompetitive Inhibition der Virusanhaftung an die Wirtszellen durch Behinderung der Bindung des viralen Hemagglutinin (HA) an sialylierte Glykanrezeptoren. Allerdings erschwert die hohe Variabilität des HA die Entwicklung von universellen Sialinsäure (SA)-basierten Virostatika. In dieser Arbeit wurde der antivirale Effekt von mit SA funktionalisierten Polyglycerolen (PGs) auf Influenza A Viren (IAV) evaluiert. SA-basierte PGs waren nur bei der Inhibition einer geringen Anzahl an IAV Stämmen effektiv. Um die molekulare Basis für diese Beschränkung zu ergründen, wurden mittels Serienpassagen IAV Mutanten selektiert, die gegen sialyliertes PG resistent waren. Es entwickelten sich drei unabhängige resistente Virusvarianten, die einen einfachen bzw. doppelten Aminosäuren-Austausch in der HA RBS aufwiesen. Durch Hemagglutinations-Elution, Einzel-Virus Kraft-Untersuchungen und Glykanarray Analysen konnte eine verringerte Rezeptorbindungsstabilität sowie ein verändertes Rezeptorbindeprofil für diese Virusvarianten gezeigt werden. Interessanterweise wurden drei unterschiedliche Fälle von Virusbindung und Inhibition beobachtet: 1) Virales HA wurde vom PG gebunden und die Virusreplikation inhibiert, 2) virales HA wurde vom PG gebunden ohne Inhibition der Virusreplikation und 3) Virales HA wurde nicht vom PG gebunden und es gab keine Inhibition. Diese Ergebnisse suggerieren, dass es eine Mindestanforderung an die Affinität oder Avidität für eine effektive kompetitive Inhibition von HA gibt. Durch modifizierte PGs, die Sialyllaktose statt SA und einen Amidlinker enthielten, konnte das Potential von PGs als breite IAV Inhibitoren demonstriert werden. Zusammenfassend bieten die Ergebnisse dieser Arbeit wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Resistenzen in IAV gegen Inhibitoren des HA-Attachment und in das strategische Design von sialylierten mutlivalenten Inhibitoren gegen IAV. / A promising approach to block influenza virus infections is competitive inhibition of virus attachment to host cells by interfering with binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to sialylated glycan receptors. However, the high structural and genetic variability of the viral HA has hampered the development of universal sialic acid (SA)-based antivirals. Here, the antiviral effect of biocompatible Polyglycerols (PGs) functionalized with SA on influenza A virus (IAV) was evaluated. PG compounds were only effective at inhibiting a narrow spectrum of IAV strains. To elucidate the molecular basis for this restriction, PG-resistant IAV mutants were selected using serial passaging. Three independent resistant variants developed with single or double amino acid changes mapping to the HA RBS. By employing hemagglutination elution, single-virus force measurements and glycan array analyses, a reduced receptor binding stability as well as an altered receptor binding profile of mutant viruses was shown. Intriguingly, three different cases of virus binding and inhibition were observed using Cy3-labeled compound: 1) viral HA was bound by the compound and resulted in inhibition of replication, 2) viral HA was bound by the compound but replication was not inhibited and 3) viral HA was not bound by the compound and no inhibition occurred. These results suggest that there is an affinity or avidity requirement for effective competitive inhibition of HA attachment. The suitability of PGs as IAV inhibitors with potential for broad activity was demonstrated by a modified PG incorporating sialyllactose instead of SA and an amide linkage covering an extended spectrum of inhibited IAV strains. Taken together, results described in this thesis provide valuable insights into the development of resistance against inhibitors of HA attachment in IAV and into the strategic design of sialylated, multivalent inhibitors aiming at broad activity against influenza viruses.

La multivalence est reconnue en tant qu’outil permettant d’augmenter le pouvoir d’inhibition d’un inhibiteur. La mise en évidence, en 2010, d’un effet multivalent puissant sur l’inhibition des glycosidases par un iminosucre multivalent a ouvert la voie vers la synthèse de clusters toujours plus puissants. En 2016, un composé multivalent a permis d’atteindre une inhibition 173000 fois meilleure que le composé monovalent correspondant, ce qui équivaut à une augmentation record du pouvoir d’inhibition par iminosucre de 4800. La synthèse d’une nouvelle génération d’iminosucres multivalents à ligand affin pour sa cible, pour parvenir à augmenter encore l’effet multivalent, était mon objectif de thèse. Au cours de ce travail, de nouveaux iminosucres multivalents à motif gluco- ou mannoimidazole, très affin des mannosidases, ont été synthétisés. Ces composés multivalents ont permis de travailler sur deux projets parallèles : un projet fondamental et un projet appliqué. Le premier a consisté en l’étude de l’influence de l’affinité du ligand sur l’effet multivalent par mesure du pouvoir d’inhibition sur l’enzyme commerciale répondant le mieux à l’effet multivalent, l’α-mannosidase de Jack-bean. Les résultats montrent l’existence d’un effet multivalent notable mais sa valeur n’est pas aussi importante comparée aux études précédentes. Les iminosucres multivalents pouvant également cibler les glycosidases d’intérêt thérapeutique, nous nous sommes intéressés, dans le cadre du projet appliqué, au traitement de la mucoviscidose. L’idée était de viser les mannosidases I et II du réticulum endoplasmique pour permettre de secourir la protéine CFTR déficiente impliquée dans cette maladie. Malheureusement, aucun effet correcteur ni potentiateur n’a pu être observé pour nos composés. En marge de ces axes principaux, une méthode de déshydroxylation sélective a été optimisée et développée en élargissant son champ d’application et en apportant des preuves mécanistiques. / Multivalency is known to be a tool to drive inhibitors more potent. The multivalent effect, evidenced in 2010 with multivalent iminosugar on glycosidase inhibition, paved the way to the synthesis of multimeric inhibitors even more powerful. In 2016, an iminosugar cluster was reported to be 173 000 times more potent inhibitor compared to the monovalent reference. This is equal to an inhibitory potency enhancement of 4800 per iminosugar. The goal of my PhD was the synthesis of a new generation of multivalent iminosugars very potent towards their target, to keep increasing multivalent effect. New multivalent iminosugars with glycoimidazole motifs, with high affinity towards mannosidases, were synthetised. Those multivalent compounds allowed us to work on two parallel projects: a fundamental and an applied one. The first one focused on the influence of ligand affinity on multivalent effect by measuring the inhibition potency on the most sensitive to multivalent effect commercially available enzyme: the Jack-bean α-mannosidase. Results showed that multivalent effect was maintained but at a lower level than those reported previously. Multivalent iminosugars being also able to target glycosidases of therapeutic interest, we were interested in the treatment of cystic fibrosis. Targeting endoplasmic reticulum mannosidases I and II could restore the CFTR protein whose deficiency is the root cause of the disease. Unfortunately, no corrective or potentiation effect were observed. Aside those principal lines, a selective dehydroxylation method was optimized and developed widening the scope and providing mechanistic proofs.

Aufgrund der Fähigkeit von Langerhans Zellen, welche den C-Typ Lektin (CTL) Rezeptor Langerin exprimieren, Antigene zu internalisieren und T-Zellen zu präsentieren, wurde Langerin als attraktives Ziel für neue Immunotherapien erkannt. Langerin kann Pathogene wie z.B. Viren erkennen, die zur Erhöhung der Avidität Kohlenhydratliganden multivalent präsentieren, da die monovalenten Kohlenhydratliganden nur niedrige Affinitäten für Langerin aufweisen. Die natürlichen monovalenten Kohlenhydratliganden besitzen nur niedrige Affinitäten für Langerin. Inspiriert durch die Natur stellt Multivalenz eine Strategie zur Überwindung der schwachen CTL-Kohlenhydrat-Wechselwirkung dar. Im Gegensatz zur hochmultivalenten Präsentation von Liganden mit undefinierter Anordnung hat sich diese Arbeit zum Ziel gesetzt auch die Ökonomie der Liganden zu optimieren, indem Liganden auf einer DNA Gerüststruktur so präsentiert wurden, dass sie die Distanz zwischen den Bindungstaschen des Homotrimers Langerin wiederspiegeln. Eine Untersuchung der relevanten multivalenten Bindungsmechanismen führte zu einer Anordnung der Liganden, die sowohl statistisches Rebinding als auch den Chelate Effekt einbezog. Der Rebinding Effekt wurde als Mittel erkannt, dass nicht nur die Avidität des Liganden an einer Bindungstasche erhöht, sondern auch ausgenutzt werden kann, um den Chelate Effekt zu amplifizieren. Diese Methode stellt eine Möglichkeit dar niedrige oder nicht vorhandene Multivalenzeffekte bei der bivalenten Präsentation von Liganden zu überwinden, wenn hochaffine Liganden nicht zur Verfügung stehen. Eine Kombination dieser Strategie mit der Entwicklung eines neuen selektiven Liganden für Langerin führte zu dem stärksten bekannten Langerinbinder (IC50 = 300 nM). Die Ligand-PNA-DNA Konstrukte wurden selektiv von Langerin exprimierenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen internalisiert und stellen ein System dar, welches in Zukunft für den Transport von Beladungen Anwendung finden könnte. / Targeting the C-type lectin (CTL) langerin has received increasing attention as a novel immunotherapy strategy due to the capacity of Langerhans cells, which express langerin, to endocytose and cross-present antigens to T-cells. Langerin recognizes pathogens such as viruses, which present carbohydrates in a multivalent fashion to increase avidity as the monovalent carbohydrate ligands only display low affinity for langerin. Inspired by nature, multivalency has therefore been a key tool for overcoming the low affinities of CTL-carbohydrate interactions. In contrast to highly multivalent ligand presentation with undefined arrangements this work strove to optimize ligand economy by designing bivalent ligands that take the distance between the binding sites of the homotrimeric langerin into consideration by precise arrangement of ligands on DNA-based scaffolds. Studying the multivalent mechanisms at work led us to the design of ligands that take both statistical rebinding and the chelate effect into account. The rebinding effect was recognized as a tool that not only increases ligand avidity at a single binding site but in addition can be exploited to amplify the chelate effect. This method provides a solution for overcoming the low or non-existing multivalency effects when bivalently presenting low affinity ligands on a rigid scaffold if high affinity ligands are unavailable. A combination of this arrangement strategy with the development of a first langerin selective glycomimetic ligand led to the most potent molecularly defined langerin binder to date (IC50 = 300 nM). The ligand-PNA-DNA constructs were selectively internalized by langerin expressing cells at nanomolar concentrations and constitute a delivery platform for the future transport of cargo to Langerhans cells.

Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus ist eine mögliche Zielstruktur für antivirale Therapeutika. Aus der Menge experimenteller HA-Inhibitoren stechen die kürzlich beschriebenen Q-beta-Sialoside aufgrund ihrer hohen Affinität und akkuraten, multivalenten Abbildung der Rezeptorbindungsstellengeometrie hervor. Anknüpfend an diese Eigenschaften beschreibt die vorliegende Arbeit die Erweiterung der Q-beta-Sialosidplattform durch neuartige Varianten und Anwendungsgebiete. Verschiedene Strategien für die Entfernung von Lipopolysacchariden aus Kapsidproben wurden untersucht, wobei sich das Verfahren der Cloud Point als am besten geeignet herausstellte. Das gereinigte Material war geeignet für in vivo Versuche. Teilsialylierte Kaspidvarianten wurden auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und im Vergleich der Ergebnisse mit statistischen Berechnungen Hinweise auf einen vorherrschend trivalenten Bindungsmodus zwischen Q-beta-Sialosiden und HA gefunden. Die Arbeit beinhaltet die ersten Beispiele heterobifunktionaler Q-beta-Sialoside, die verschiedene Sialinsäureliganden oder Kombinationen aus Zuckern und Fluoreszenzfarbstoffen aufweisen. Die fluoreszenzmarkierten Kapside wurden in Mukus-Mobilitätsstudien angewendet und ihre Undurchgängigkeit der äußeren Mukusbarriere visualisiert. Mehrere Sialinsäureester wurden als potenzielle ladungsmaskierte Liganden für erhöhte Mukusgängigkeit untersucht. Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit war die Entwicklung eines peptidbasierten HA-Inhibitors. Eine Gruppe von aus HA-bindenden Antikörpern und Lactoferrin abgeleiteten Peptiden wurde mit Hilfe der mikroskaligen Thermophorese auf ihre Affinität zu HA oder Influenza A/X31 (H3N2) getestet. Die vorläufigen Resultate weisen auf eine gute Bindung mehrerer Kandidaten hin. Multivalente Peptid-Polymer-Konjugate wurden auf Basis von linearem Polygylcerol niedrigen Molekulargewichts synthetisiert, jedoch zeigte keines eine Inhibierung der getesteten Influenzastämme. / The influenza virus hemagglutinin (HA) attracts much attention as a target widely unexploited by licensed therapeutics. From the numerous experimental HA inhibitors, the recently reported Q-beta sialosides stand out through their affinity and accurate, multivalent reflection of the receptor binding site geometry. Building upon these characteristics, this work expands the variety of the Q-beta sialoside platform with novel variants and explores new areas of application. Several strategies were compared to remove lipopolysaccharides from capsid preparations, determining cloud point extraction as the most suitable. The purified material shown to be suitable for in vivo experiments. The inhibitory activities of partially sialylated capsids were compared to statistical models to obtain evidence for the prevalence of trivalent interactions between Q-beta sialosides and HA. Moreover, this work contains the first examples of heterobifunctional Q sialosides, bearing multiple sialic acid (SA) ligands or combinations of sugars and fluorescent dyes. Fluorescently labeled Q-beta sialosides were applied in mucus mobility studies to visualize their entrapment in the outer mucus layer. Several SA esters were examined as potential masked-charge ligands to increase mucus permeation. A second focal point of the thesis was the design of a novel, peptide-based HA inhibitor. A library of peptides derived from HA-binding antibodies and lactoferrin was investigated using microscale thermophoresis for binding to recombinant HA or influenza A/X31 (H3N2) concentrate. Preliminary results indicated good affinity for some candidates. Multivalent polymer-peptide conjugates of several peptides were synthesized by immobilization on low molecular weight linear polyglycerol. However, none of the conjugates was able to inhibit influenza strains A/X31 (H3N2) or A/PR8 (H1N1) in a hemagglutination inhibition test.

Increasing antibiotic resistance has created a need to develop rapid and reliable methods to identify bacteria and provide pertinent information to ensure suitable antibiotics or sugar therapeutics can be chosen for treatment. Carbohydrate structures attached to proteins on host cell surfaces provide a binding point for many pathogens, including bacteria. These structures can be mimicked using single monosaccharides glycosylated to alpha-hemolysin (alpha-HL). Alpha-HL is a beta-barrel pore-forming toxin secreted by Staphylococcus aureus that forms an SDS stable heptamer, which can be expressed by coupled in vitro transcription and translation and purified by polyacrylamide gel electrophoresis. The purified heptamers can be reconstituted into planar lipid bilayers and studied at the single channel level. Through single channel recordings the effects of sugar-linker lengths, different glycans and the interaction between the ‘Glycopore’ and sugar binding molecules can be studied. The glycopore, therefore, acts as a scaffold for analysing protein-sugar interactions. Studies in this thesis have focused on the synthesis of carbohydrates for site-selective protein glycosylation; cloning and in vitro transcription translation of alpha-HL monomers; and glycosylation and oligomerisation of alpha-HL to form glycopores suitable for lectin-binding studies. Lectins DC-SIGN and FimH have been expressed in Escherichia coli and these lectins as well as others have been screened using alpha-HL glycopores. The glycopores have also been investigated with bacteria in serum in a controlled molecule-specific manner using single-channel electrical recording. In this work glycosylated alpha-HL-monomers have been found to form stable heptamers which can be formed by oligomerisation on red blood cell membranes. The purified glycopores were reconstituted into planar lipid bilayers and studied at the single-channel level. Through single-channel recordings an optimised glycopore has been shown to be effective in distinguishing lectins alone and in a mixture and has afforded qualitative and quantitative information about the binding interactions between carbohydrates and sugar binding proteins. Furthermore, the glycopore has been used to sense bacteria which may provide an insight into modes of bacterial infection. In addition, a multivalent glycopore has been formed which has proved preliminary information about the effects of multivalency in lectin binding. The design and synthesis of non-beta-lactam antibiotic candidates and their evaluation has also been carried out.